Die Finanzierung für die Entwicklung dieses Protokoll wurde von der Southeastern Pennsylvania Konsortium für Hochschulbildung und der Cabrini College-Science Department zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Finanzierung und Unterstützung kam von Arcadia University und Immaculata University. Besonders danken Dr. Karen Snetselaar im St. Joseph Universität für die freundliche Aufnahme der elektronenmikroskopischen Bilder unserer isolierten Phagen. Zusätzliche Unterstützung wurde von der Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance-Phage Hunters Advancing Genomics und Evolutions Science-Programm (SEA-Phagen) zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der Zellen für Arthobacter Phage Isolation <ul><li> Kultur Arthrobacter sp. KY3901 Kolonien ausgestrichen auf Luria Bertaini (LB) Agarplatten bei 30 ° C für 2-3 Tage inkubiert. Wählen Sie eine Kolonie und eine sterile Schleife, um es zu 250 ml LB-Medium in einem Schikanekulturflasche in einem Schüttelinkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute bei 30 ° C hinzu und inkubieren. </li><li> Lassen Sie etwa 24 Stunden des Wachstums zur späten exponentiellen / frühen stationären Phase Zellen für Phageninfektionsversuche zu erhalten. Überwachen Sie den Zustand der Bakterienwachstum eng mit Zellen aus Eingabe der mittleren bis späten stationären Wachstumszustand zu verhindern. ANMERKUNG: Das Zellwachstum sollte eines optischen Dichte OD 600 zwischen 0,5-.0.7 für die unten beschriebenen Phagen Isolierungs- und Reinigungsverfahren / Schritten bestehen. </li></ul> 2. Sammlung von Phagen von Bodenproben <ol><li> Sammeln Sie 200 bis 400 g Boden vom gewünschten Ort. Anmerkung: Da Bakterien im Arthrobacter Gattung sind gemeinsame Bodenbakterien sie und die Phagen, die sie infizieren können in gefunden werden und sind allgegenwärtig in den meisten Bodenarten. </li><li> Hinzufügen mindestens 400 ml Phagenpuffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)], um den Boden und mischt in einem ausreichend großen Kolben, so dass mindestens 200 ml PB im Überstand und kann entnommen werden. </li><li> Mischen Sie durch leichtes Rühren oder wirbeln, bis der Boden ausgesetzt ist, und lassen Sie die Bodensedimente zu begleichen, in der Regel 30 Minuten. </li><li> Übergeben Sie die &quot;Bodenextrakt&quot; durch Filterpapier durch Schwerkraftfiltration Bodensediment Schmutz zu entfernen. </li><li> Fügen LB Pulver und mischen, um eine 2% ige Lösung (4 g LB-Pulver in 200 ml Bodenextrakt) zu machen. </li><li> Übergeben Sie die Lösung durch ein 0,22 um-Filter durch Vakuumfiltration, um ein steriles Filtrat zu erhalten. Wenn möglich, fahren Sie sofort mit Schritt 2.7. Falls erforderlich, zu speichern filtrierten Proben bei 4 ° C für bis zu einer Woche vor dem Fortfahren, jedoch die Anzahl von lebensfähigen Phagenpartikelnwird reduziert. </li><li> Aliquoten mehrere 50 ml des filtersterilisiert LB / Bodenextrakt Mischung in einzelne 250 ml sterilisierte Schütteln verblüfft Kulturflaschen unter aseptischen Bedingungen. In sterilen 2,0 M CaCl 2 -Lösung, um den gewünschten endgültigen Konzentrationen (0-50 mM), da verschiedene Arthrobacter Phagen optimal wachsen unter verschiedenen CaCl2 Bedingungen. HINWEIS: Wir finden, dass die Mehrzahl der Arthrobacter Phagen von uns erkannt liegen im Bereich von 1 mM bis 2,5 mM CaCl 2. Mehrere der isolierten Phagen wuchs jedoch von uns ausschließlich bei 0 mM CaCl 2 .oder bei sehr hohen CaCl 2 -Konzentrationen. Gehen Sie sofort zu Schritt 3.1. </li></ol> 3. Phage Isolation <ol><li> Hinzufügen von 1 zu 2,5 ml von späten exponentiellen / frühen stationären Phase Bakterienkultur auf jeden der Kolben. Bei einer OD 600 von 0,5 bis 0,7, verwenden Sie 1 ml der Zellen. Für eine OD 600 höher als eine OD von 0,7 In 2,5 mlZellen. Hinweis: Zellen im exponentiellen Phase Wachstum ergeben in der Regel mehr Phagen und höhere Titer als Zellen in der stationären Phase Wachstum. </li><li> Schüttelflaschen mit 250 Upm bei 30 ° C für etwa 24 Stunden in einem Schüttelinkubator. </li><li> Nach einer 24-Stunden Inkubationszeit entfernen Anreicherungskolben aus dem Schüttelinkubator und verdünnt das Anreicherungs Proben Zehnfache im Phagenpuffer. </li><li> Bis Kulturröhrchen mit 0,5 ml späten exponentiellen / frühen stationären Phase Bakterienkultur gesetzt sind und verschiedene Mengen des Anreicherungskultur (5 ul bis 500 ul einer 10 -1 Verdünnung in PB) zu den Kulturröhrchen. HINWEIS: Es ist ratsam, einen weiten Konzentrationsbereich zu testen, da jeder Bodenprobe erzeugt verschiedene Phagentiter nach Anreicherung. </li><li> Fügen CaCl2 zu Kulturröhrchen eine endgültige Konzentration gleich im Original Anreicherungskolben der vorliegenden Konzentration zu machen. Verwenden Sie eine Reihe von verschiedenen CaCl 2 -Konzentrationen für viele Phagen w wählenith unterschiedlichen CaCl2 Abhängigkeiten. HINWEIS: Die meisten Phagen innerhalb des CaCl2 Bereich von 1-2,5 mM isoliert werden, aber es gibt Phagen am optimalsten überall 0-50 mM CaCl 2 -Konzentrationen isoliert. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, eine Reihe von CaCl 2 -Konzentrationen zu überprüfen, um die Anzahl der eindeutigen isoliert Arthrobacter Phagen zu maximieren. </li><li> Mischungs 4,5 ml LB-Topagar im Kulturrohr und gießt die Mischung auf einem LB-Agar-Platte. Vorsichtig schwenken, um über die Platte gleichmäßig zu verteilen und ermöglichen eine Top-Agar für etwa 15 Minuten zu festigen. HINWEIS: Top-Agar in größeren Chargen (250 ml) und zusätzliche Top-Agar hergestellt werden können bei RT gespeichert und für nachfolgende Experimente wiederverwendet für mindestens zwei Wochen werden. Zwar gibt es verschiedene Formeln verwendet werden, um Top-Agar, machen wir Top-Agar mit 7 g / l Agar mit LB. gemischt Ort Topagar in einem 60 ° C Wasserbad auf den flüssigen Zustand während des Verlaufs des Experiments beibehalten. </li><li> Invert ter Inkubieren bei gewünschter Temperatur (Temperatur bis 30 ° C) O / N bis 48 hr. Variieren diese Bedingungen für die vorliegenden Phagen zu optimieren. Die meisten isolierten Phagen stammen aus Platten bei 30 ° C bei 1 bis 2,5 mM CaCl2-Konzentration nach 24 h Inkubationszeit inkubiert. </li></ol> 4. Phage Reinigung <ol><li> Nach einer 24-stündigen Inkubation Check für Plaquebildung auf Platten. Weiter Inkubation bis zu 72 h, wenn keine Plaques sind offensichtlich oder um festzustellen, ob zusätzliche Plaques erscheinen. Falls erforderlich, speichern Platten mit vermeintlichen Plaques für bis zu einer Woche bei 4 ° C, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, dass eine Vielzahl von verschiedenen Morphologien Plaque auf einer Platte zu finden. Auffinden Plaques nach 3 Tagen der Inkubation ist möglich, aber selten. </li><li> Reinige gewünschten Phagen aus klar getrennt Plaques mit dem Streifen Plaque-Methode. Berühren Sie eine Plakette mit einer sterilen Holzstab. Streak die Plaque, indem Sie einen Holzstab durch eine Flamme, allowing der Stick kurz abkühlen, und dann reiben Sie den Stick auf der Agar-Platte in der sanften Bewegung, wie in Abbildung 1 dargestellt. mit einem sauberen Stick für jeden Durchgang Wiederholen Sie diesen Vorgang. </li><li> Alternativ können Sie die traditionellen Plaque-Titer-Test für einzelne Phagenplaques zu isolieren. Die Plaque-Titer-Assay erfordert die Verwendung von mehr Reagenzien wie LB-Agar und LB-Topagar und Materialien wie Petrischalen für Phagenplaqueisolierung. Wir waren sehr erfolgreich mit dem Streifen Plaque-Methode, aber es ist technisch einfacher, einzelne Plaques mit Hilfe des Plaque-Titer-Test zu isolieren. </li><li> Sobald der LB-Agarplatte wird mindestens dreimal ausgestrichen, markieren den Bereich mit der niedrigsten Konzentration der putative Phagenpartikel und sanft an 0,5 ml Arthrobacter und 4,5 ml geschmolzener Deckagar LB (die die gleiche Konzentration von Calciumchlorid als Mutterplatte ) und lassen Sie es gleichmäßig über die Platte verteilt. </li><li> Invertieren und Inkubation Platte O / N. Wiederholen Sie den Streifen PlaqueTechnik für mindestens drei Iterationen, um eine reine Phagen-Arten zu gewährleisten ist isoliert. Speicher-Platten bei 4 ° C für bis zu einer Woche zwischen Streifen Bedarf ohne erheblichen Verlust an Phagen Lebensfähigkeit. </li><li> Sobald die gewünschte Plaques worden sind, und auf der letzten Streifen der Platte getrennt, berühren Sie einen gut isolierten Plaque mit einer Mikropipette Spitze und resuspendieren in 100 ul PB. Seriell verdünnt diese Lösung 10 0 aus, um die 10 -8 Verdünnung, indem 20 ul der Probe in 180 ul frischem PB. </li><li> Zugabe von 10 ul jeder Verdünnung auf 0,5 ml gezüchtet Arthrobacter in ein Kulturröhrchen für 5 bis 10 min bei RT und der Platte hergestellt, indem die infizierten Bakterien mit 4,5 ml geschmolzenen LB-Deckagar, enthaltend die gleiche Konzentration an CaCl 2 verwendet, um den Phagen zu isolieren, von der ursprünglichen Bodenprobe. Speichern Sie alle Verdünnungen bei 4 ° C bis zum nächsten Tag gemacht. </li><li> Bestimmen Sie die Phagenverdünnungs benötigt, um eine Web-Muster mit der herkömmlichen Plaque-Titer, wie machensagen sie mal. Der Zweck der Plaque-Titer-Assay ist, um den Phagen-Titer benötigt, um eine Bahn-Musterplatte zu erhalten, zu bestimmen. Identifizieren Sie einen Web-Musterplatte als überwiegend frei von Bakterien, sondern enthält Reste der Bakterien, die noch nicht von Phagen lysiert wurden. 5 ml späten exponentiellen / frühen stationären Arthrobacter Kultur in ein steriles 50 ml Kulturflasche. <ol><li> Füge 100 ul der Verdünnung (das gab ein Netzmuster auf die Arthrobacter-Kultur) in den Kulturbehälter und ermöglichen, dass die Phagen an die Bakterienzellen für 5 bis 10 min bei RT infizieren. Mischen mit geschmolzenem LB-Deckagar, enthaltend die gleiche Konzentration an CaCl 2, wie verwendet, um den Phagen zunächst zu identifizieren und die Platte 5 ml dieser Mischung auf 10 frische LB-Platten. Erstarren lassen und Inkubation umgekehrten Platten bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag, durchfluten die Web-Modellplatten mit 5 ml PB und speichern O / N bei 4 ° C oder 4 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Filtern des Phagenlysats durch ein 0,22 um-Spritzenfilterund bei 4 ° C. Muss diese letzte Phagenvorrat für weitere Experimente, wie Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Phagenpartikeln, Phagen Isolierung genomischer DNA für DNA-Restriktionsenzym-Analyse und Sequenzierung unter Verwendung von Standardverfahren. Für langfristige Lagerung des Phagen Lager, fügen Sie eine gleiche Menge des Phagen-Lysats auf steriles Glycerin in kleine Fläschchen für Lager Archivierung bei -80 ° C. HINWEIS: Für alle, die nicht mit dieser Phagen-Techniken erfahren, ist eine großartige Ressource die Online zugänglich www.phagesdb.org Website. </li></ol>

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	<li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Catabolic+Pathways:+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism.">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li><li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil.">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li><li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine.">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li><li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens.">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li><li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters.">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li><li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7.">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li><li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+&#8220;Arthrobacter+aureus&#8221;+C70.">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting &#8220;Arthrobacter aureus&#8221; C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li><li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil.">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li><li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis.">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li><li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water.">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li><li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG:+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria.">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li><li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells.">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li><li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age.">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li></ol>

Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Trotz vieler bisherigen Versuche, Phagen infizieren kann Arthrobacter Hosts zu isolieren, wir hatten wenig Erfolg mit Standard-Anreicherungsverfahren. Das verallgemeinerte Verfahren zur Bakterienanreicherung entwickelt und von van Twest und Kropinskis 10 angepasst, um Phagen aus Umweltproben reichern bleibt die Grundlage für die Mehrheit der Anreicherungsverfahren. Erkenntnisse aus früheren Studien legt nahe, dass Methoden der direkten Beschichtung haben nachweisbaren Plaques auf Stämme von Ar...

Die Allgegenwärtigkeit von Arthrobacter species in Boden-Umgebungen bietet eine große Anzahl und Vielfalt der Phagen Lage ist, von dieser Art von Wirtsbakterien isoliert. Bakterielle Mitglieder der Familie Acintobacteriaceae Weise bestehen für ihre Abbauwege abbau widerspenstigen Verbindungen wie Atrazin und verschiedenen anderen Pestiziden und Herbiziden 1,2,3. Obwohl die meisten der Forschung wurde mit Umweltbelastungen von Arthrobacter getan wird klinische Isolate dieser Gattung in Blut, Urin, Augen, und viele andere menschliche Quellen alle Anzeigen von phylogenetischen Heterogenität 4 gefunden. Zwar gibt es eine recht umfangreiche Anzahl von Studien auf Arthrobacter Bakterien, nur wenige Studien berichten über die Phagen infizieren kann Mitglieder dieser vielfältigen Gattung. Interessant ist jedoch, zuvor an Arthrobacter getan Phagen berührt mehrere wichtige unterschiedliche Themen wie die Eingabe der Boden &lt;em&gt; Arthrobacter species 5, industrielle Zwecke mit dem Zweck der Reduzierung schädlicher Schaum in Belebtschlammanlagen 6 und Arbeit hervorgehoben ortsspezifische Rekombination und Integrase-Gene 7. Verschiedene Anreicherungsverfahrens Protokolle wurden verwendet, um zu erzeugen reine Phagen-Isolate in Arthrobacter species. Frühe Verfahren umfassen Inkubation des Bodens mit aufgenommen Giftstoffe wie Nikotin Salze für die Dauer von mehr als einem Jahr 8, die zu Phagen in der Lage, nur infizieren A. globiformis. Studien mit Erde getan versickert mit labilen organischen schien nachweisbar Phagen durch Plaque-Assay-Techniken erzeugen, jedoch ohne lange Inkubationszeiten 8. Interessanterweise wurde eine Technik ähnlich direkte Beschichtung in der Vergangenheit, die zu mehreren Phagen, während immer noch eine deutlich geringe Erfolgsquote von den Ermittlern 5 verwendet, unter Berufung auf frühere Studien mit niedrigen Erfolgsraten <sbis&gt; 8. Insgesamt waren die Isolationstechniken in der Vergangenheit bekannt für eine geringe Wirksamkeit in der Praxis trotz der Gattung Arthrobacter, die die häufigsten aeroben Boden in der Natur 4,9 isolieren, Van Twest und Kropinski 10 vorhanden Anreicherungsverfahren zur Isolierung von Phagen aus Wasser und Boden von früheren Techniken zum Umwelt Bakterienisolate aber diese Anreicherungstechniken bereichern angepasst erwiesen ineffizient bei der Isolierung Arthrobacter Phagen. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens ist es, &quot;proof of concept&quot; zeigen, dass die frühen Anreicherungsverfahren angepasst werden, um konsequent und effektiv isolieren Arthrobacter Phagen, die Überwindung vorherige technische Herausforderungen mit Trenn Phagen aus dieser Bakteriengattung zugeordnet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB Broth powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9722-2</td>
			<td>It&#39;s best to order these in bulk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td>It&#39;s best to order these in bulk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.22 um buchner filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">430320</td>
			<td>More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">76002844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">76002845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-824</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Um die Reproduzierbarkeit der verbesserte Anreicherungsverfahrens für Arthrobacter Phagen zu zeigen, wurden 30 verschiedene Bodenproben zu verschiedenen Zeiten und Orten im Frühjahr und Sommer 2014. Von diesen 30 Bodenproben einzigartige Arthrobacter Phagen wurden aus 22 der gesammelten Bodenproben mit dieser Bereicherung erhalten verwendet Verfahren. Die Standardanreicherungsverfahren ergab eindeutige Phagen von 3 der gleichen Bodenproben. Die Anreicherung Proben eine sehr hohe Phagentiter benötige...

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An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Eine optimierte Enrichment-Technik für die Isolierung von<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bakteriophagen Arten von Bodenprobe Isolate

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

19.4K Aufrufe.  University of the Sciences. We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Serie: An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

Aufbau und Betrieb einer Dauer<sup&gt; 13</sup&gt; C und<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Kammer für Uniform oder Differential, Stoffwechsel-und Struktur, Pflanze Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Forschung

Umwelt

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use due to increased demand for landscape irrigation. Improper irrigation practices and large rainfall events can result in runoff from urban landscapes which has potential to carry nutrients and sediments into local streams and lakes where they may contribute to eutrophication. A 1,000 m2 facility was constructed which consists of 24 individual 33.6 m2 field plots, each equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated urban landscapes. Runoff volumes from the first and second trials had coefficient of variability (CV) values of 38.2 and 28.7%, respectively. CV values for runoff pH, EC, and Na concentration for both trials were all under 10%. Concentrations of DOC, TDN, DON, PO4-P, K+, Mg2+, and Ca2+ had CV values less than 50% in both trials. Overall, the results of testing performed after sod installation at the facility indicated good uniformity between plots for runoff volumes and chemical constituents. The large plot size is sufficient to include much of the natural variability and therefore provides better simulation of urban landscape ecosystems.

This paper describes the design, construction, and function of a 1,000 m2 facility containing 24 individual 33.6 m2 field plots equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated home lawns.

Design und Bau eines Stadt Abfluss Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most experiments examine only two or a few levels of CA concentration and a single soil type, but if CA can be varied as a gradient from subambient to superambient concentrations on multiple soils, we can discern whether past ecosystem responses may continue linearly in the future and whether responses may vary across the landscape. The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility applies a 250 to 500 &#181;l L-1 CA gradient to Blackland prairie plant communities established on lysimeters containing clay, silty clay, and sandy soils. The gradient is created as photosynthesis by vegetation enclosed in in temperature-controlled chambers progressively depletes carbon dioxide from air flowing directionally through the chambers. Maintaining proper air flow rate, adequate photosynthetic capacity, and temperature control are critical to overcome the main limitations of the system, which are declining photosynthetic rates and increased water stress during summer. The facility is an economical alternative to other techniques of CA enrichment, successfully discerns the shape of ecosystem responses to subambient to superambient CA enrichment, and can be adapted to test for interactions of carbon dioxide with other greenhouse gases such as methane or ozone.

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility creates a 250 to 500 &#181;l L-1 linear carbon dioxide gradient in temperature-controlled chambers housing grassland plant communities on clay, silty clay, and sandy soil monoliths. The facility is used to determine how past and future carbon dioxide levels affect grassland carbon cycling.

Ein CO<sub&gt; 2</sub&gt; Konzentration Gradient Facility for Testing CO<sub&gt; 2</sub&gt; Enrichment und Boden Auswirkungen auf Grünland-Ökosystemen Funktion

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protokoll für die Mikroplastik Probenahme auf der Meeresoberfläche und Probenanalyse

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Eine optimierte Rhizobox-Protokoll zum Wurzelwachstum und Reaktionsfähigkeit auf lokalisierte Nährstoffe zu visualisieren

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

Mikroplot-Design und Pflanzen- und Bodenprobenvorbereitung für 15Stickstoffanalysen

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

Elektrostatische Methode zur Entfernung organischer Partikel aus dem Boden

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse nach der Updegraff-Methode

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...