מימון לפיתוח פרוטוקול זה מסופק על ידי דרום מזרח פנסילבניה Consortium להשכלה גבוהה וCabrini מכללת המחלקה למדע. מימון ותמיכה נוספים הגיעו מאוניברסיטת ארקדיה והאוניברסיטה של ​​תמה. תודה מיוחדת לד&quot;ר קארן Snetselaar באוניברסיטת סנט ג&#39;וזף לחביבות לוקח את תמונות אלקטרון המיקרוסקופיות של פאגים המבודדים שלנו. תמיכה נוספת מסופק על ידי ציידי המכון הרפואי הווארד יוז Alliance החינוך המדעי הפאג קידום Genomics ותכנית (SEA-פאגים) אבולוציונית מדע.

1. הכנת תאי Arthobacter לבידוד הפאג <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sp Arthrobacter התרבות. KY3901 מושבות מפוספסות על צלחת לוריא Bertaini (LB) אגר טופחה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. פיק מושבה ולהשתמש בלולאת סטרילי כדי להוסיף אותו ל -250 מיליליטר של מרק LB בבקבוק תרבות מבולבל ודגירה בחממה רועדת ב 225 סל&quot;ד ב 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כ 24 שעות של צמיחה להשיג תאים מאוחר מעריכי / תחילת נייחות שלב ניסויי זיהום הפאג. לפקח על המצב של התפתחות חיידקים באופן הדוק כדי למנוע מתאים מלהיכנס לאמצע למצב צמיחה נייח מאוחר. הערה: צמיחת תא צריכה להיות מורכבת של OD צפיפות אופטי 600 בין 0.5-.0.7 לנהלי בידוד הפאג וטיהור / השלבים מתוארים להלן. </li></ul> 2. אוסף של הפאג מדגימות קרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 200-400 גרם של אדמה ממקום רצוי. הערה: מאחר שחיידקים בArthrobaסוג cter הם חיידקי קרקע משותפים להם וניתן למצוא פאגים המדביקים אותם ובמחלחלים ברוב סוגי הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפחות 400 מיליליטר של הפאג הצפת (PB) [68 מ&quot;מ NaCl, 10 מ&quot;מ MgSO 4, 10 מ&quot;מ טריס-CL (pH 7.5)] לאדמה ולערבב בבקבוק מספיק גדול כדי שלפחות 200 מיליליטר של PB הוא בsupernatant והוא מסוגל לחלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי ערבוב או מתערבלים עד הקרקע מושעה ולאפשר משקעי האדמה להתיישב, בדרך כלל 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את &quot;תמצית האדמה&quot; דרך נייר סינון על ידי סינון כוח משיכה כדי להסיר שאריות משקעים אדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אבקת LB ולערבב כדי להפוך את פתרון 2% (4 אבקת g LB ב200 מיליליטר תמצית אדמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר על ידי סינון ואקום להשיג תסנין סטרילי. במידת האפשר, להמשיך לשלב 2.7 באופן מיידי. אם יהיה צורך, חנות מסוננת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני שתמשיך, עם זאת, מספרם של חלקיקי phage קיימאיהיה קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר Aliquot 50 מיליליטר מנות של תערובת תמצית LB / אדמה מעוקרת מסנן לתוך 250 מיליליטר בודד המעוקרות רועדים תרבות צלוחיות מבולבלות תוך שימוש בטכניקות aseptic. הוסף פתרון 2 M CaCl סטרילי 2.0 לריכוזים הרצויים הסופיים (0-50 מ&quot;מ) מאז פאגים Arthrobacter שונים לגדול בצורה אופטימלית תחת CaCl 2 תנאים שונים. הערה: אנו מוצאים כי הרוב המכריע של פאגים Arthrobacter המזוהים על ידינו הוא בטווח של 1 מ&quot;מ 2.5 מ&quot;מ CaCl 2. עם זאת, כמה מפאגים המבודדים גדלו על ידינו באופן בלעדי ב0 מ&quot;מ CaCl .or 2 בCaCl 2 ריכוזים גבוהים מאוד. פנה מייד לשלב 3.1. </li></ol> בידוד 3. הפאג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב לכל אחד מהצלוחיות. לOD 600 0.5-0.7, להשתמש 1 מיליליטר של תאים. לOD 600 גבוה מOD של 0.7 להשתמש 2.5 מיליליטר שלתאים. הערה: תאים בגידול שלב מעריכי בדרך כלל תשואה יותר פאגים וtiters גבוה יותר מאשר תאים בגידול שלב נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צלוחיות ב 250 סל&quot;ד ב 30 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות בתוך חממה רועדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה 24 שעות להסיר את צלוחיות העשרה מן החממה הרועדת ולדלל את דגימות ההעשרה פי עשרה במאגר הפאג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צינורות תרבות עם 0.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב ולהוסיף כמויות שונות של תרבות ההעשרה (5 μl 500 μl של דילול 10 -1 בPB) לצינורות התרבות. הערה: מומלץ לבדוק מגוון רחב של ריכוזים מאז כל דגימת קרקע יוצרת titers הפאג שונה לאחר העשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CaCl 2 לצינורות תרבות כדי להפוך את ריכוז סופי שווה להווה הריכוז בבקבוק ההעשרה המקורי. השתמש במגוון של CaCl 2 ריכוזים שונים כדי לבחור לפאגים רבים wה- i משתנה CaCl 2 תלות. הערה: רוב פאגים יהיו מבודדים בטווח של 1-2.5 CaCl 2 מ&quot;מ אבל יש פאגים המבודדים ביותר בצורה אופטימלית בכל מקום 0-50 CaCl 2 ריכוזי מ&quot;מ. בגלל זה הוא הטוב ביותר לבדוק מגוון של CaCl 2 ריכוזים כדי למקסם את מספר פאגים Arthrobacter המבודדים ייחודיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 4.5 מיליליטר של אגר העליון LB בצינור התרבות ויוצקים את התערובת על צלחת אגר LB. מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה על פני הצלחת ולאפשר לאגרת עליון כדי לחזק למשך כ 15 דקות. הערה: Top אגר יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות יותר (250 מיליליטר) ואגרתי עליון נוסף יכול להיות מאוחסן על RT ושימוש חוזר בניסויים הבאים לשבועות לפחות. אמנם יש נוסחות שונות המשמשות לייצור אגר עליון, אנו עושים העליונים אגר באמצעות 7G / L של אגר מעורבב עם קילו אגר עליון מקום באמבט המים C ° 60 כדי לשמר את המצב הנוזלי במהלך ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך tהוא צלחת דגירה בטמפרטורה רצויה (טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס) O / N 48 שעות. להשתנות בתנאים אלה כדי לייעל לפאגים הנוכחיים. פאגים המבודדים ביותר מגיעים מצלחות טופחו על 30 מעלות צלזיוס ב1-2.5 מ&quot;מ CaCl ריכוז 2 לאחר תקופת דגירה 24 שעות. </li></ol> 4. הפאג טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקת דגירה 24 שעות להיווצרות הפלאק על צלחות. המשך דגירה של עד 72 שעות אם לא לוחות ניכרים או כדי לקבוע אם לוחות נוספים יופיעו. במידת צורך, צלחות חנות עם שלטים המשוערת לתקופה של עד שבוע ב 4 ° C לפני שתמשיך. הערה: אין זה נדיר למצוא מגוון רחב של מורפולוגיות שלט שונות בצלחת אחת. מציאת לוחות לאחר 3 ימים של דגירה אפשרית אך נדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פאגים הרצויים מלוחות מבודדים באופן ברור בשיטת שלט פס. לגעת שלט עם מקל עץ סטרילי. Streak השלט על ידי הפעלת מקל עץ דרך להבה, allowing המקל להתקרר בקצרה, ולאחר מכן לשפשף את המקל על הצלחת אגר בתנועה העדינה, כפי שמוצג באיור 1. חזור על פעולה זו בעזרת מקל נקי לכל מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, השתמש בassay כייל שלט המסורתי לבודד את הפלאק הפאג בודד. Assay כייל השלט דורש שימוש בחומרים כימיים יותר כגון אגר LB ואגר העליון LB וחומרים כגון צלחות פטרי לבידוד לוחית הפאג. יש לנו הצלחה רבה בשיטת שלט פס אבל זה יותר קל מבחינה טכנית לבודד את הפלאק בודד באמצעות assay כייל שלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהצלחת אגר LB היא מפוספסת לפחות שלוש פעמים, סמן את השטח עם הריכוז הנמוך ביותר של חלקיקי phage משוערים ועדינות להחיל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter ו -4.5 מיליליטר של אגר העליון LB המותך (המכיל את אותו ריכוז של סידן כלורי כצלחת ההורה ) ולאפשר לו להתפשט באופן שווה על פני הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דגירה O צלחת / N. חזור על שלט הפסטכניקה לפחות שלוש חזרות כדי להבטיח מיני הפאג טהורים מבודדת. צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפי צורך בין פסים ללא אובדן משמעותי של כדאיות הפאג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחות רצויים ברגע שכבר גדלו ומבודדים על צלחת הפס הסופית, לגעת שלט אחד מבודד היטב עם טיפ micropipette מחדש להשעות ב 100 PB μl. סדרתי לדלל פתרון 10 0 זו לדילול 10 -8 על ידי העברת 20 μl של המדגם לμl 180 של PB הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של דילול כל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter גדל בצינור תרבות במשך 5 עד 10 דקות ב RT וצלחת על ידי ערבוב החיידקים הנגועים עם 4.5 מיליליטר של אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl 2 משמש כדי לבודד את הפאג ממדגם הקרקע המקורי. שמור את כל דילולים נעשו על 4 מעלות צלזיוס עד ליום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את דילול סדרתי הפאג צריך לעשות תבנית אינטרנט באמצעות כייל השלט המסורתי כאומר. המטרה של assay כייל השלט היא לקבוע את כייל הפאג צריך להשיג צלחת דפוס אינטרנט. לזהות צלחת דפוס אינטרנט כבעיקר נטולת חיידקים אך מכילה שאריות של חיידקים שעדיין לא lysed ידי פאגים. הוסף 5 מיליליטר של תרבות Arthrobacter מאוחר מעריכי / תחילת נייחת לבקבוק תרבות 50 מיליליטר סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של הדילול (שנתן דפוס אינטרנט לתרבות Arthrobacter) בבקבוק התרבות 100 μl ולאפשר פאגים להדביק את תאי חיידקים במשך 5 עד 10 דקות ב RT. מערבבים עם אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl 2 כבתחילה כדי לזהות את הפאג וצלחת 5 מיליליטר של תערובת זו על גבי 10 לוחות LB טריים. לאפשר לביסוס ודגירת צלחות הפוכות ב 30 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להציף את צלחות דפוס האינטרנט עם 5 מיליליטר של PB וO חנות / N ב 4 ° C או 4 שעות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את lysate הפאג דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטרולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש מניות הפאג זה סופי לניסויים נוספים כגון תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של חלקיקי הפאג, בידוד הדנ&quot;א הגנומי הפאג לניתוח אנזים הגבלת DNA ורצף הגנומי באמצעות נהלים סטנדרטיים. לאחסון ארוך טווח של מניית הפאג, להוסיף כמות שווה של lysate הפאג לגליצרול סטרילי בבקבוקונים קטנים לאחסון בארכיון המניה ב -80 ° C. הערה: למי שלא חווה עם טכניקות הפאג אלה, משאב נהדר הוא אתר www.phagesdb.org הנגיש באינטרנט. </li></ol>

<ol>
	<li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Catabolic+Pathways:+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism.">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li><li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil.">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li><li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine.">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li><li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens.">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li><li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters.">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li><li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7.">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li><li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+&#8220;Arthrobacter+aureus&#8221;+C70.">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting &#8220;Arthrobacter aureus&#8221; C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li><li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil.">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li><li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis.">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li><li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water.">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li><li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG:+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria.">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li><li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells.">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li><li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age.">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li></ol>

מחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות ניסיונות רבים קודמים לבודד פאגים מסוגלים להדביק מארחי Arthrobacter, היו לנו הצלחה קטנה באמצעות הליכי העשרה סטנדרטיים. השיטה הכללית של העשרת חיידקים פיתחה והתאימה על ידי ואן Twest וKropinski 10 להעשיר פאגים מדגימות סביבתיות הוא הבסיס למרבית הליכי העשרה. ראיות ממח?...

המצאות בכל מקום של מיני Arthrobacter בסביבות אדמה מציעה מספר ומגוון עצומים של פאגים מסוגלים להיות מבודד ממין זה של חיידקי מארח. חברי חיידקים ממשפחת Acintobacteriaceae הם בולטים ביותר למסלולי קטבולי של משפיל תרכובות סוררות כמו אטרזין וחומרי הדברה שונות ו1,2,3 קוטלי עשבים. למרות שרוב המחקר שנעשה באמצעות זנים סביבתיים של Arthrobacter, מבודדים קליני של הסוג הזה נמצא בדם, שתן, עיניים, ומקורות רבים אחרים אדם כולו מוצגות ההטרוגניות פילוגנטי 4. אמנם יש גוף נרחב למדי של מחקר על חיידקי Arthrobacter, רק מעט מחקרים לדווח על פאגים מסוגלים להדביק בני מין מגוון זו. מעניין אם כי, שנעשתה בעבר על Arthrobacter עבודת פאגים נגיעות בכמה נושאים שונים מפתח כגון ההקלדה של אדמה &lt;em&gt; מיני Arthrobacter 5 שימושים תעשייתיים, במטרה להפחית את הקצף מזיק במפעלים לטיפול בבוצה משופעלת 6, ועבודה המדגישה רקומבינציה ספציפית באתר וגני אינטגראז 7. פרוטוקולי טכניקת העשרה שונים נוצלו כדי ליצור טהור הפאג מבודד במינים Arthrobacter. נהלים מוקדמים כוללים incubations של אדמה עם סוכנים רעילים הוסיפו כמו מלחי ניקוטין לתקופות של למעלה משנת 8 עלייה נותנת לפאגים מסוגלים א מדביק רק globiformis. מחקרים שנעשו באמצעות אדמה חלחלו עם אורגניים יציב הופיע לייצר פאגים לזיהוי באמצעות טכניקות assay פלאק, השמטת תקופות דגירה ארוכה 8. מעניין אם כי, טכניקה הדומה ציפוי ישיר שימשה בעבר והוליד כמה פאגים בעוד שיש עדיין שיעור הצלחה נמוך במיוחד על-ידי החוקרים 5, בצטטו מחקרים האחרונים עם אחוזי הצלחה נמוכות <sעד&gt; 8. בסך הכל, טכניקות הבידוד שימשו בעבר היו ראויות לציון על כך שיעילות קטנה בפועל למרות סוג Arthrobacter המייצג את האדמה האירובית השכיחה ביותר לבודד בטבע 4,9,, ואן Twest וKropinski 10 שיטות העשרה הנוכחיות לבידוד פאגים ממים ואדמה מותאם מטכניקות קודם לכן משמשות להעשרה מבודדת חיידקים סביבתיים, אלא טכניקות העשרה אלה הוכיחו יעילים בבידוד פאגים Arthrobacter. מטרת השיטה המתוארת כאן היא להראות &quot;הוכחה של מושג&quot; שניתן להתאים את שיטות ההעשרה המוקדמות בעקביות וביעילות כדי לבודד פאגים Arthrobacter, להתגבר על אתגרים טכניים קודמים הקשורים לבידוד פאגים מסוג חיידקים זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB Broth powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9722-2</td>
			<td>It&#39;s best to order these in bulk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td>It&#39;s best to order these in bulk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.22 um buchner filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">430320</td>
			<td>More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">76002844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">76002845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-824</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

כדי להדגים שחזור של טכניקת ההעשרה משופרת לפאגים Arthrobacter, 30 דגימות קרקע שונות שמשו בזמנים ובמקומות שונים באביב ובקיץ של שנת 2014 של דגימות קרקע 30 אלה פאגים Arthrobacter ייחודיים התקבלו משל 22 דגימות קרקע שנאספו באמצעות העשרה זו הליך. הליך ההעשרה הסטנדרטי הניב פאגים יי...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates at JoVE.com

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

19.3K Views.  University of the Sciences. We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Video: An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

עיצוב והפעלה של רציף<sup&gt; 13</sup&gt; C ו<sup&gt; 15</sup&gt; N תיוג הלשכה לאחיד או דיפרנציאלי, מטבולית ומבנית, צמח איזוטופ תיוג

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use due to increased demand for landscape irrigation. Improper irrigation practices and large rainfall events can result in runoff from urban landscapes which has potential to carry nutrients and sediments into local streams and lakes where they may contribute to eutrophication. A 1,000 m2 facility was constructed which consists of 24 individual 33.6 m2 field plots, each equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated urban landscapes. Runoff volumes from the first and second trials had coefficient of variability (CV) values of 38.2 and 28.7%, respectively. CV values for runoff pH, EC, and Na concentration for both trials were all under 10%. Concentrations of DOC, TDN, DON, PO4-P, K+, Mg2+, and Ca2+ had CV values less than 50% in both trials. Overall, the results of testing performed after sod installation at the facility indicated good uniformity between plots for runoff volumes and chemical constituents. The large plot size is sufficient to include much of the natural variability and therefore provides better simulation of urban landscape ecosystems.

This paper describes the design, construction, and function of a 1,000 m2 facility containing 24 individual 33.6 m2 field plots equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated home lawns.

עיצוב ובנייה של מתקן מחקר ניגר עירוני

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most experiments examine only two or a few levels of CA concentration and a single soil type, but if CA can be varied as a gradient from subambient to superambient concentrations on multiple soils, we can discern whether past ecosystem responses may continue linearly in the future and whether responses may vary across the landscape. The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility applies a 250 to 500 &#181;l L-1 CA gradient to Blackland prairie plant communities established on lysimeters containing clay, silty clay, and sandy soils. The gradient is created as photosynthesis by vegetation enclosed in in temperature-controlled chambers progressively depletes carbon dioxide from air flowing directionally through the chambers. Maintaining proper air flow rate, adequate photosynthetic capacity, and temperature control are critical to overcome the main limitations of the system, which are declining photosynthetic rates and increased water stress during summer. The facility is an economical alternative to other techniques of CA enrichment, successfully discerns the shape of ecosystem responses to subambient to superambient CA enrichment, and can be adapted to test for interactions of carbon dioxide with other greenhouse gases such as methane or ozone.

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility creates a 250 to 500 &#181;l L-1 linear carbon dioxide gradient in temperature-controlled chambers housing grassland plant communities on clay, silty clay, and sandy soil monoliths. The facility is used to determine how past and future carbon dioxide levels affect grassland carbon cycling.

CO<sub&gt; 2</sub&gt; מתקן מפל ריכוזים לבדיקה CO<sub&gt; 2</sub&gt; העשרה וקרקע השפעות על תפקוד המערכת האקולוגית גראסלאנד

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

פרוטוקול Rhizobox ממוטבת כדי להמחיש צמיחה השורש והיענות לצרכי מזינים לשפות אחרות

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

מיקרועלילה עיצוב וצמח הכנה לדגימת קרקע עבור 15ניתוח חנקן

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

שיטה אלקטרוסטטית להסרת חומר אורגני חלקיקי מאדמה

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

הערכת תכולת תאית גבישית של ביומסה צמחית בשיטת Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...