وأيد هذا العمل من قبل المعهد للبحوث والابتكار في الطب الحيوي (IRIB)، ومنهاج التصوير خلية من نورماندي (PRIMACEN)، INSERM، IBiSA، وجامعة روان، الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (ERDF - PeReNE، الأقاليمي 4A)، وLARC-العصبية شبكة والمنطقة هوت نورماندي.

الحيوانات (ذكرا أو أنثى فئران ويستار) ولدت ونشأت في منشأة الحيوان المعتمدين (موافقة B.76-451-04)، وفقا لدليل الفرنسي لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وأجريت التجارب تحت إشراف المحققين المرخص (MB، DV وLG) وفقا لتوجيهات مجلس الاتحاد الأوروبي (2010/63 / UE من 22 سبتمبر 2010) وزارة الزراعة الفرنسية. 1. إعداد وسائل الإعلام وأدوات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية، وإعداد BSS 1X هانك (HBSS) في الماء المعقم من 10X حل سهم تحتوي على CaCl 2 (1.85 جم / لتر) / MgSO 4 (0.9767 جم / لتر) دون MgCl 2. إضافة NaHCO 3 (350 ميكروغرام / مل) إلى 1x أخرى حل HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية، إضافة N2 ملحق (من محلول المخزون 100X) والبنسلين (100 وحدة / مل) -streptomycin (0.1 ملغ / مل) الحل لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مزيج من المغذيات Dulbecco لالبنية F-12 (1: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في ظروف معقمة، وإعداد قسامة (25 ميكرولتر، 2 مم) من حشوية الفلورسنت صبغة تسمى خلية المقتفي الخضراء في DMSO (1.075 مل 1 ملغ). تمييع قسامة واحدة في 5 مل من DMEM في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شغل الجليد دلو للحفاظ على وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير مختبر قمم مقاعد البدلاء والأدوات مع 70٪ من الإيثانول. </li></ol> 2. تشريح المخيخ من الفئران P10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس بسرعة الفئران الوليدة (P10) مع مقص التشغيل المنحنية وراء الأذنين من أجل الحصول على بداية الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الجانب الخلفي من رأس مقطوع، وجعل خط الوسط شق الجلد من الرقبة إلى الأنف مع قزحية غرامة مقص وفصل الجلد من الجمجمة مع قزحية غرامة مقص وملقط دومون # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص القزحية الجميلة لجعل بدقة اثنين من الشقوق الجانبية من القاعدة إلى المنطقة منقاري من الجمجمة. إزالة الجمجمة تشريح مع اثنين # 3 ملقط. فصل حمالة الصدرفي من أي التزام مع الجمجمة باستخدام نفس ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغ مع نهاية ملعقة من ملعقة إلى طبق بتري (Ø 35 مم) التي تحتوي على 2 مل من الجليد الباردة HBSS المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري تحتوي على الدماغ في طبق بتري أكبر (Ø 100 مم) كامل من الثلج ونقلها إلى مرحلة من مراحل stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope وعزل المخيخ من الدماغ عن طريق تفلع باستخدام اثنين # 3 ملقط. وبالمثل، وإزالة الحبل الشوكي المتبقية وغشاء حنوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المخيخ في طبق بيتري HBSS شغل جديد (Ø 35 ملم، 2 مل) مع نهاية ملعقة من ملعقة والحفاظ على الجليد. </li></ol> 3. إعداد الحاد مخيخي شرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope، وقطع المخيخ بين دودة والنصف الأيمن كما هو مبين من قبل رؤساء اثنين السهم في الشكل 2A مع معيار مقبض مشرط # 3 الصلبة و# 15 شفرة جراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة واحدة من السماويالغراء oacrylate على vibratome عينة القرص وانتظر 15-25 ثانية للقضاء على أبخرة المذيبات السامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قطع المخيخ مع نهاية ملعقة من ملعقة وإزالة الزائد HBSS مع مناشف ورقية نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب المخيخ قريب من القرص العينة. إصلاح قطع حافة القرص العينة وانتظر 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل القرص العينة في علبة عازلة مع مناور، وتناوب عليها حتى محور عرضية من المخيخ هو عمودي على حامل السكين. إصلاح القرص العينة مع مفتاح ألين وملء بلطف علبة عازلة مع HBSS متوسطة حتى يتم تغطية المخيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل سحق الجليد في حمام التبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف شفرة ثلاث مرات مع 70٪ من الإيثانول للقضاء على أي نفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج شفرة في حامل السكين وآمنة مع لقط المسمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحق حافة شفرة وراء الحافة الخلفية (من رأي المستخدم) من العينة وتحديد ذلك كنقطة انطلاق. استخدام الأمام الأمر لتحديد رانه نقطة النهاية بعد الحافة الأمامية للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد باجتزاء السرعة 2.5 وباجتزاء تردد في 8. اختر سمك تقليم في 180 ميكرون. بدء باجتزاء الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلتقط كل قسم باستخدام الزجاج واسعة الجوف اقتطاع ماصة باستير ونقلها إلى HBSS التي تحتوي على طبق بتري (Ø 35 ملم) أبقى على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين من ملقط # 5، وإزالة السحايا بعناية من المخيخ عند التدخل في النصل. جمع بحد أقصى 5 شرائح في المخيخ (الشكل 2B، C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السحايا من شرائح المخيخ بعناية مع اثنين # 5 ملقط تحت stereomicroscope وفصل الفصيصات بلطف لأفضل التحقيق التحميل. </li></ol> 4. نيون تلون Interneurons المعيشة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شرائح للدماغ مع ماصة باستير الزجاج واسعة الجوف اقتطاع إلى لوحة 6 جيدا (بحد أقصى 3 شرائح / لكل بئر). نضح المتوسطة HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح (3 ماكس) في 5 مل من لحل oading من صبغة الفلورسنت (10 ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحماية من الضوء، وتغطي صفيحة ميكروسكوبية بورق الألمنيوم. وضعه على طاولة الدوران الحركة في 35 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في RT لتسهيل وضع العلامات الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح نقل على غشاء من Transwell إدراج (3.0 ميكرومتر حجم المسام؛ الشكل 2D) مع ماصة باستير الزجاج واسعة الجوف اقتطاع. نضح المتوسطة التحميل مع ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة إدراج وملء البئر مع 1.9 مل من DMEM. استبدال إدراج وإضافة 100 ميكرولتر من DMEM على أعلى شريحة لتغطية الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة تحتوي على إدراج الثقافة في غرفة الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) لمدة 2 ساعة وهو ما يكفي لمراقبة GCS في ML. تكمن الأنسجة مسطحة للسماح المرفق على غشاء إدراج (الشكل 2E). تأكد من أن شرائح لا تجف. </li></ol> 5. خارج الحي التصوير من خلال متحد البؤر الفحص العياني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة من دونالغطاء البلاستيك في حاضنة تعلق على موقف من macroscope متحد البؤر. وضع غطاء زجاجي على إدراج لوحة من macroscope. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة في 37.0 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية، وتوريد شرائح مع تدفق الغاز ثابت (95٪ O 2، 5٪ CO 2) من خلال لوحة إدراج للحفاظ على ثبات درجة الحموضة. الانتظار لمدة 2 ساعة إضافية قبل التجربة مرور الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسافة إلى تصور الهجرة GC في شرائح الأنسجة، وإلقاء الضوء على التحضير مع 488 نانومتر ضوء الطول الموجي من خلال ليزر ديود من خلال متحد البؤر macroscope المسح بالليزر مجهزة الهدف الجاف X2 (العمل: 39 مم، الإطارات: 58 ملم، NA = 0.234)، وكشف عن انبعاث مضان 500-530 نانومتر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحل ناعما حركة GCS، الحصول على صور مع عامل زووم بصري إضافية بين 1.5 و 2.0. جمع الصور من حلول الشبكات الخليجية في طائرة تنسيق وحيد أو ما يصل إلى 10 طائرات التنسيق مختلفة على طول محور Z كل 30 دقيقة لمدة تصل إلى 12 ساعة. </li></ol></lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الضرورة، قم بإزالة غطاء زجاجي وإضافة كميات صغيرة (1-10 ميكرولتر) من المنشطات البيولوجية أو مثبطات في DMEM مع ماصة 10 ميكرولتر لدراسة تأثيرها على الهجرة GC. </li></ol> تتبع 6. خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل مرة من الفيلم، نفذ إسقاط ض كومة من خلال وضع ecart من نوع في يماغيج. تعدل وعلى النقيض من مستويات السطوع من الصور المتعاقبة لتسهيل تحديد وتتبع GCS المسمى. خريطة يدويا في كل موقف على لقطة المرجعية (في تي = 0). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام &quot;دليل تتبع&quot; المساعد في القائمة الجسيمات تحليل وتحديد بالضغط على نقطة الثقل في كل خلايا الجسم أثناء مرور الزمن. تصدير بيانات تتبع الخام في جدول بيانات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تنظيم بيانات تتبع الخام المصدرة من يماغيج مع برنامج الذكية الصنع (http://primacen.fr، وكتب في كود PHP) التي تحدد كل خلية والمواقف المرتبطة بها. باستخدام هذا البرنامج، calculatالبريد المسافة الإجمالية سافر ومتوسط ​​سرعة الهجرة لكل خلية. تصنيف ومقارنة خصائص الهجرة الخلية في ظروف مراقبة والعلاج تحت الفلاتر المناسبة باستخدام نفس البرنامج. </li></ol>

<ol>
	<li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+in+the+Cerebellum.">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex.">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li><li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration.">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li><li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2++spike+frequency.">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li><li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+(tPA)+in+neuronal+cells:+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li><li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li><li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-A2+and+its+ligand,+Sema6A,+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells.">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+granule+cell+migration:+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations.">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li><li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(PACAP)+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex.">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li><li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li><li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+(tPA)+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones.">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li><li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration.">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li><li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum.">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li><li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration,+axonal+growth,+and+pathfinding.">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li><li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain.">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li><li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+for+activation+of+the+PAC1+receptor.">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول ثقافة الفئران P10 شرائح للدماغ الحادة في النظام Transwell ووضع العلامات الفلورية من GC مع صبغة الفلورسنت الأخضر لدراسة الهجرة الخلية أثناء التطور بعد الولادة من خلال الفحص العياني متحد البؤر. هذا البروتوكول يسمح الملاحظات للهجرة الخلايا لمدة تصل إلى 12 ساعة واختبار الأدوار المحتملة لتنظيم العوامل في الهجرة بما في ذلك منبهات أو الخصوم من نيوروببتيد، مثبطات الإنزيم، مما يشير إلى خلية جهري أو المواد السامة أثناء التجربة. ثقب صغير في إدراج الغشاء مع طرف ماصة ضروري لتسهيل إدارة المركبات في المتوسط ​​الحضانة. ويمكن استخدام المنحنية غيض ماصة محلية الصنع لتسهيل إيصال الحل. قضية واحدة من دراسات الهجرة الخلية الحية على شرائح الأنسجة هي أن تحركات الأنسجة نفسها يمكن أن تتبع الخلية الصعبة. في حين اقترح النهج السابقة لتحقيق الاستقرار بلطف سليالمجال الاقتصادي الموحد مع النايلون شبكة أو طبقة رقيقة من ذيل فأر الكولاجين 7،17، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو نقل بسيطة ومباشرة من لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على شرائح للدماغ على إدراج غشاء من الحاضنة CO 2 في إطار الهدف من macroscope متحد البؤر. كما توفر درجة الحرارة متكاملة وCO 2 وحدات التحكم العوامل البيئية المناسبة والمستمرة ضرورية لهجرة الخلية 9. لذلك، يتم الاحتفاظ الظروف والثقافة خلال الملاحظات والحركات الأنسجة إلى أدنى حد ممكن حيث أن تعلق شرائح جيدا لإدراج الغشاء. يتم التحقق من استقرار النسيج باتباع موقف حواف شريحة أو الخلايا العصبية التي ينبغي أن تكون ثابتة مراجع خلال الاستحواذ. بالإضافة إلى ذلك، شرائح للدماغ (بين 12 و 18) وزعت في 6 آبار من لوحة يمكن ملاحظة بسرعة بالتفصيل مع مرحلة الآلية وزووم بصري. نظرا لبعد المسافة الكبيرة العاملة (X2، 39 مم) هدف الجاف، وبرنامج التحصين الموسع-observation خالية من الغمر وإدارة المركبات في مستنبت هو أسهل من ذلك بكثير. ولذلك، المعايير البيئية والتشابه لدعم الثقافة في CO 2 الحاضنة ومتحد البؤر الفحص العياني يؤدي إلى الحفاظ على الحد الأقصى من العينة البيولوجية. ميزة أخرى للبروتوكول في مجال واسع من الرأي، وبالتالي عدد كبير من الخلايا التي يمكن ملاحظتها في وقت واحد. على سبيل المثال، فقد قررنا سابقا أن كثافة GCS الفلورسنت مع الهجرة شعاعي في ML كان 1124 ± 138 خلية / ملم 2 18. الفحص العياني متحد البؤر (X2، NA = 0.234) لديه دقة أقل الجانبي مقارنة متحد البؤر المجهري (40X، NA = 1.25) ولكن الخلية يمكن تتبع جثث GCS بسهولة ومتوسط ​​سرعة الهجرة غير قابلة للمقارنة بين تقترب من التكنولوجية اثنين 7،18 . إلى جانب تحسن التقنية للقيام بعمليات استحواذ الصورة، ونوعية من شرائح الأنسجة والعشرينجودة (ه) من العلامات هي النقاط الرئيسية للتجارب الناجحة. دائما وسائل الاعلام والأنسجة على الجليد أثناء عمليات تشريح، والقضاء على النفط على vibratome شفرات ولا تستخدم شرائح من الأنسجة في اتصال مع الغراء. يتم تكييفها أقسام السهمي وعرضية لشعاعي والهجرة عرضية على التوالي. استخدام أطوال مختلفة من الحضانة للكشف المناسب في الطبقات القشرية مختلفة من المخيخ. أوقات طويلة الحضانة (تصل إلى 8 ساعات) ضرورية للكشف عن هجرة العديد من GCS في PCL وIGL. منذ الهجرة GC هي عملية فيزيولوجية خلال النوافذ المكانية والزمانية محددة، والسيطرة الإيجابية هي أن الخلايا لديها إلى الهجرة بشكل صحيح. على وجه الخصوص، العديد من GC المغزل في ML هي واحدة من المؤشرات الصحية الرئيسية لشرائح المخيخ السهمي. لبدء التجارب، ويقترح مراقبة تحركات GC في ML. في الواقع، ينبغي النظر في شكل GC مع ممدود عموديا خلايا الجسم كنقطة مرجعية لبدء ميلانquisition مع مراقبة متتالية (2 ساعة) والعلاج (2 ساعة) الفترات التي يمكن القيام بها بسهولة في ML. الأصباغ الفلورية مثل عائلة تعقب خلية أو البروتينات الفلورية التعبير عنها من خلال بنيات وراثية ويمكن استخدام كأثر للدراسات الهجرة الخلية. ونظرا لحركية بطيئة للهجرة GC (1 كومة كل 30 دقيقة)، والتجارب متعدد الألوان ويمكن أيضا أن يؤديها في وضع متتابعة منذ 4 الليزر الحزم (405، 488، 532 و 633 نانومتر) متوفرة على النظام. وبالنظر إلى الجاذبية والطرد المركزي الهجرة شعاعي، وتتبع من interneurons أخرى يمكن أيضا أن تتحقق 18. على وجه الخصوص، وأقل أنواع الخلايا عديدة يمكن أن تكون مترجمة أكثر سهولة مع حقل كبير للعرض. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الهجرة الخلية في مراحل أخرى من تطوير للدماغ ولكن أيضا مناطق الدماغ الأخرى.

في المخيخ النامية، ثمانية أنواع مختلفة من الخلايا العصبية تنتج بالتسلسل بين الأسبوع الجنينية الثاني والأسبوع الثاني بعد الولادة في القوارض 1. تنشأ في البداية من، منطقة جرثومي الأولية، الخلايا الحبيبية غير ناضجة (GC) هي الخلايا العصبية الماضية إلى أن يتم إنتاجها من طبقة خارجية الحبيبية (EGL)، منطقة جرثومي ثانوي 2. خلال ثلاثة أسابيع بعد الولادة الأولى، وقشرة المخيخ هو بنية رقي نظمت في أربع طبقات بما في ذلك EGL، وطبقة الجزيئية (ML)، وطبقة الخلايا العصبية (PCL) والطبقة الحبيبية الداخلية (IGL) (الشكل 1). من خلال الهجرة الجاذبية، غير ناضج GCS، interneurons glutamatergic، وصول إلى IGL غضون ما يقرب من 2 يوما. في الأسبوع ما بعد الولادة الثالث، وEGL يختفي ويشكل IGL ما يسمى الطبقة الحبيبية (GL) في المخيخ الكبار. في GL، GCS حصول على مدخلات متشابك مثير من الألياف المطحلب والخلايا فرشاة القطب الواحد، ومدخلات متشابك المثبطة من محاور الخلايا جولجي. في ML، المحاور GC تجعل نقاط الاشتباك العصبي مثير مع الخلايا العصبية GABAergic بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا سلة، والخلايا النجمية، والخلايا جولجي 2. مراقبة الوقت الحقيقي من حركة الخلايا في المخيخ شرائح الحادة التي تم الحصول عليها من القوارض بعد الولادة المبكرة يدل على أن GCS تعديل شكلها بالتزامن مع التغييرات في طريقة وسرعة الهجرة خلال طريقهم في قشرة المخ 3. خلال أول أسبوعين بعد الولادة، السلائف GC تتكاثر بنشاط في الجزء العلوي من EGL. في الجزء الأوسط من EGL، تالية للتفتل GCS الهجرة بشكل عرضي في اتجاه عملية أكبر بهم. على الحدود EGL-ML، GCS بطء حركتها، فإن الخلايا تبدأ في الدخول في عملية الهابطة عمودية قصيرة في ML. في ML، GCS لديها خلايا الجسم ممدود عموديا، وهي عملية زائدة رقيقة وعملية تؤدي أكثر ضخمة، وترحيل شعاعيا على طول الألياف الدبقية بيرجمان. فيPCL، GCS وقف حركتهم ولكن بعد مرحلة ثابتة لفترات طويلة (2 ساعة)، وعبور الحدود PCL-IGL. في IGL، GCS تهاجر نحو الجزء السفلي من طبقة في غياب الدعم الألياف الدبقية. مرة واحدة على نصائح من العملية المؤدية الاقتراب من الحدود مسألة IGL البيضاء (WM)، GCS بطيئة ووقف حركتهم. ويفضل المقاطع العرضية من المخيخ لدراسات الهجرة عرضية في EGL في الوقت الذي يكرسون شرائح السهمي إلى شعاعي الهجرة في ML، PCL وIGL. بعض العوامل التنظيمية للحركات GC بما في ذلك نيوروببتيد (على سبيل المثال، السوماتوستاتين، PACAP) تم التعرف حتى الآن ولكن آليات متكاملة تشارك في السيطرة المكانية والزمانية للهجرة GC في كل طبقة قشرية لا تزال 1،4،5،6 معروفة إلى حد كبير. وقد تمت دراسة الهجرة GC خلال 20 عاما الماضية من خلال أشرطة الفيديو ومتحد البؤر المجهري باستخدام الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن الخلايا المستزرعة معزولة أو الكشف عن مضان لإبرةشرائح المخيخ الشركة المصرية للاتصالات. استخدمت الجاذبة للدهون في البداية، ومؤخرا &quot;المقتفي خلية&quot; الأصباغ وأعرب الخلية البروتينات الفلورية للمتحد البؤر أو اثنين من الفوتون المجهري 7،8. التجارب الناجحة تعتمد على عدد من الإجراءات المحددة التي تجعل من بروتوكول بسيطة ولكن ليس من السهل. على وجه الخصوص، شرائح الحادة يجب أن استقرت خلال الملاحظات بشكل عام مع النايلون شبكة شبكة محلية الصنع 9. شدة الإضاءة الخفيفة يجب أن تكون في أدنى مستوى ممكن لتجنب الضيائية وphotobleaching من النحو الذي اقترحه مسح متعددة نهج المجهر متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك، درجة الحرارة وCO 2 هي المعايير البيئية الرئيسية منذ عدم الاستقرار قد تؤثر هجرة الخلايا العصبية. لتسهيل وتحسين الإجراءات التجريبية، قمنا بتطوير بروتوكول الفحص العياني متحد البؤر التي تحد من تحركات شريحة، ويضمن المعايير البيئية المستمرة، ويقلل من photobleaching من، ويزيد من مجال الرؤية (بناء على أمر من مليمتر) وconsequمستديم عدد الخلايا (عشرات) التي يمكن تتبعها من خلال تحليل الصور. وهكذا، 180 ميكرون شرائح سميكة يتم تربيتها على إدراج الغشاء، ويتم نقل 6 لوحات جيدا مباشرة تحت هدف 2X بمحرك من macroscope متحد البؤر التجارية مجهزة حضانة كبيرة الغرفة ودرجة الحرارة وCO 2 وحدات التحكم ونظام التحكم في الاهتزاز. ثم يتم تنفيذ الوقت الهفوات وض مداخن على مدى عدة ساعات وأدوات الدوائية أو الجزيئات النشطة بيولوجيا يمكن إضافة أو تسليمها في المتوسط ​​الحضانة. ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها لدراسة هجرة أنواع أخرى من الخلايا العصبية في المخيخ أو المخ في مراحل النمو المختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACAP38</td>
			<td>INRS, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Bourgault et al., 200919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAI-1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td>
			<td>O973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Transwell-Clear inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 35 mm diameter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100 mm diameter</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylen tube (15 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0800DF/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological safety cabinet fume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MSC9 Class II A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adjustable-volume pipette (0,5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gyro-rocker, SSL3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, Hera Cell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal macroscope, TCS LSI</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, M205 C</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors, curved, blunt/blunt</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>03.03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>149090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 and #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11293-00 and 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome injector blades/single edge</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard scalpel handle #3 solid</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade #15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of postnatal cerebellar granule cell migration using confocal macroscopy

أثناء التطور بعد الولادة، الخلايا الحبيبية غير ناضجة (interneurons مثير) يحمل الهجرة عرضية في الطبقة الحبيبية الخارجية، والهجرة ثم شعاعي في طبقة الجزيئية وطبقة الخلايا العصبية للوصول إلى الطبقة الحبيبية الداخلية للقشرة المخ. الافتراضي في عمليات الهجرة يدفع إما موت الخلايا أو في غير موضعها من الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى عجز في وظائف المخيخ متنوعة. تتضمن الجاذبية هجرة الخلايا الحبيبية عدة آليات، مثل الكيميائي وتدهور المصفوفة خارج الخلية، لتوجيه الخلايا نحو موقفهم النهائي، ولكن لا يعلمها إلا جزئيا العوامل التي تنظم الهجرة خلية في كل طبقة قشرية. في أسلوبنا، يتم إعداد شرائح للدماغ الحادة من P10 الفئران، وصفت الخلايا الحبيبية مع علامة حشوية الفلورسنت والأنسجة ومثقف على إدراج غشاء 4-10 ساعة قبل بدء رصد في الوقت الحقيقي من الهجرة الخلية عن طريق الفحص العياني متحد البؤر عند 37 درجة مئوية فيوجود CO 2. أثناء هجرتها في الطبقات القشرية مختلفة من المخيخ، والخلايا الحبيبية يمكن أن يتعرض لمنبهات نيوروبيبتيدي أو الخصوم، مثبطات الأنزيم البروتيني، حاصرات من المؤثرات داخل الخلايا أو المواد السامة حتى مثل الكحول أو ميثيل الزئبق للتحقيق في دور محتمل في تنظيم الهجرة العصبية .

في المخيخ ما بعد الولادة في وقت مبكر، GCS يحمل تغييرات كبيرة في الوضع وسرعة الهجرة لأنها عبور مختلف الطبقات القشرية 1 (الشكل 1). يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال دراسة الهجرة GC في الوسط الخلوي الطبيعية. يتم فحص الفئران P10 شرائح الأنسجة المخيخ المسمى مع صبغة الفلورسنت الأخضر تحت macroscope متحد البؤر (الشكل 3A)، وتبين لنا أن GCS ترحيل شعاعيا في ML بمتوسط ​​سرعة 18 ميكرون / ساعة (الشكل 3B، C). حتى الآن، ودور التفاعلات / الاتصالات بين الخلايا العصبية والدبقية بما في ذلك العوامل التنظيمية والآليات الجزيئية تشارك في السيطرة على الهجرة خلية في كل طبقة قشرية غير معروفة إلى حد كبير. وبالتالي، فإن القضية الرئيسية هي تحديد نيوروببتيد، العصبية، neurotrophins ومكونات المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تلعب دورا في هذه الطبقات القشرية SPECIالتغييرات المرورية من خلال سرعة عملية هجرتهم. تم الكشف عن النخامية أدينيلات-تفعيل محلقة ببتيد (PACAP) بشكل رئيسي في PCL، ولكن أيضا في ML وIGL خلال أول أسبوعين بعد الولادة في القوارض 7،10،11. أدى تطبيق PACAP38 (10 -6 M) إلى مستنبت في انخفاض سرعتها 79٪ من GC في ML. على سبيل المثال، انخفضت سرعة هجرة GCS في ML من 11.9 ميكرون / ساعة في ظروف السيطرة إلى 2.5 ميكرون / ساعة بعد إعطاء PACAP38 (الشكل 4A). الأنسجة من نوع المنشط plasminogen (TPA) هو عضو في سلسلة بروتين الذي يؤدي إلى تدهور مكونات المصفوفة خارج الخلية (EM) مثل جزيئات التصاق الخلية أو laminin 12،13. سكتة والبلازمينوجين، ركيزة من سكتة، تم الكشف في الطبقات القشرية خلال تطوير المخيخ 14،15،16 بعد الولادة. إدارة PAI-1 (10 -7 M)، المانع من الذاتية سكتة، وانخفاض بنسبة 78٪ في GCالهجرة في ML. على سبيل المثال، خفض GCS سرعة الهجرة في ML من 19.2 ميكرون / ساعة في ظروف السيطرة إلى 4.2 ميكرون / ساعة بعد إضافة PAI-1 (الشكل 4B). هذه النتائج تشير إلى أن PACAP يمارس تأثير كابح بشكل مباشر على حركات GC وأن سيرين البروتيني سكتة تسهل هجرة GCS في ML من المخيخ الفئران النامية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> الشكل 1: تمثيل 3D الهجرة GC في قشرة المخ بعد الولادة. 4/1، تمديد عمليات GC والهجرة عرضية في EGL. 5، والهجرة شعاعي في ML جنبا إلى جنب بيرجمان الألياف الدبقية. 6، مرحلة ثابتة عابر في PCL 7 والهجرة الدبقية مستقلة شعاعي في IGL 8، استكمال الهجرة GC في IGL GC، الخلية الحبيبية، باللون الأحمر؛ EGL، الطبقة الحبيبية الخارجية؛ B، بيرجمان الدبقية، في الأرجواني الداكن، G، خلية جولجي، باللون الأصفر؛ قوات التحالف، والألياف التسلق، باللون الأزرق، ز، الخلايا الحبيبية postmigratory، في ضوء الأخضر؛ IGL، الطبقة الحبيبية الداخلية؛ MFT، والألياف المطحلب المحطة، باللون الأخضر الداكن، ML، طبقة الجزيئية؛ P، الخلية العصبية، في الأرجواني الخفيفة؛ طبقة الخلايا PCL، العصبية. تم تعديل هذا الرقم من 5. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> الشكل 2: خارج الحي ثقافة شرائح P10 المخيخ (A) المخيخ تشريح من الفئران P10. شريط النطاق = 6 مم. (B) صورة مجهرية المعيشة 180 شريحة المخيخ ميكرون سميكة من خلال stereomicroscopy. شريط النطاق = 3 مم. (C) فيالتكبير العالي، والطبقات القشرية الأربعة (EGL، ML، PCL، IGL) من المخيخ ومميز بالفعل. شريط النطاق = 1 مم. (D) بعد وضع العلامات الفلورية، يتم وضع شرائح الأنسجة على إدراج الثقافة (24 مم) في لوحة 6 جيدا. (E) تمثيل تخطيطي لإدراج الثقافة مع غشاء البوليستر زراعة الأنسجة المعالجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> الرقم 3: الهجرة دينامية GCS في الطبقات القشرية من P10 الفئران المخيخ (A) نظرا Macroconfocal (XYZ، والإسقاط 2D) من شريحة المخيخ الفئران P10 التي وصفت GCS مع الأخضر صبغة الفلورسنت حشوية. = شريط نطاق 75 ميكرون. (B) الوقت الفاصل بين التصوير تظهر GCالحركات في ML بواسطة الفحص العياني متحد البؤر لمدة 4 ساعة في ظروف السيطرة. النجمة (*) يمثل رمزا سوما GC. يشار إلى الوقت الذي انقضى (في دقيقة) على الجزء السفلي من كل صورة مجهرية. = شريط نطاق 10 ميكرون. (C) تغييرات متتابعة في المسافة التي يقطعها GC سوما. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> الرقم 4: تأثير نيوروبيبتيدي ومثبط البروتياز الهجرة GC كانت تتبع (A) GC في ML بواسطة الفحص العياني متحد البؤر لمدة 2 ساعة في ظروف السيطرة ومن ثم لمدة 2 ساعة في وجود الغدة النخامية أدينيلات-تفعيل محلقة ببتيد (PACAP). وتعقب (B) GC في ML التي كتبها الفحص العياني متحد البؤر لمدة 2 ساعة في ظروف السيطرة ومن ثم لمدة 2 ساعة في وجود منشط البلازمينوجين المانع-1 (PAI-1).

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

9.3K Views.  Inserm, IRIB, University of Rouen. During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Video: Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

الماوس الدماغ المؤخر<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة الهجرة Branchiomotor الوجه العصبية

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.