עבודה זו נתמכה על ידי המכון למחקר והחדשנות בביו-רפואה (IRIB), פלטפורמת ההדמיה הנייד של נורמנדי (PRIMACEN), INSERM, IBiSA, אוניברסיטת רואן, האירופי לפיתוח אזורי הקרן (ERDF - PeReNE, Interreg 4A), LARC-Neurosciences הרשת ואזור Haute-Normandie.

בעלי חיים (זכר או נקבת חולדות Wistar) נולדו וגדל במתקן בעלי חיים מוכר (אישור B.76-451-04), על פי המדריך הצרפתי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. ניסויים שנערכו תחת פיקוחו של חוקרים מורשים (MB, DV ו- LG) בהתאם לאירופה מועצת קהילת ההוראה (2010/63 / UE 22 בספטמבר 2010) ומשרד החקלאות הצרפתי. 1. הכנת מדיה וכלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי, להכין BSS של 1x האנק (HBSS) במים סטריליים מ10x פתרון מניות המכיל CaCl 2 (/ L 1.85 g) / MgSO 4 (.9767 גר &#39;/ ליטר) ללא MgCl 2. להוסיף NaHCO 3 (350 מיקרוגרם / מיליליטר) ל1x פתרון של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי, להוסיף תוספת N2 (מפתרון מניות 100x) ופניצילין (100 יחידות / מיליליטר) -streptomycin פתרון לבינוני נשר שונה (DMEM) התערובת המזינה של Dulbecco (מ&quot;ג 0.1 / מיליליטר)ture F-12 (1: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים, להכין aliquot (25 μl, 2 מ&quot;מ) של תא cytoplasmic ניאון הצבע נקרא Tracker הירוק בDMSO (1.075 מיליליטר ל1 מ&quot;ג). לדלל aliquot אחד ב 5 מיליליטר של DMEM בצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קרח דלי מלא כדי לשמור על תקשורת ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר צמרות מעבדה ספסל וכלים עם 70% אתנול. </li></ol> 2. Dissection של המוח קטן מחולדות P10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לערוף גורי חולדה (P10) במספריים הפעלה מעוקלים מאחורי אוזניים כדי לקבל את תחילת חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלק האחורי בצד של הראש הערוף, לעשות חתך קו האמצע של העור מהצוואר לאף עם איריס מספריים הקנס ולהפריד את העור מהגולגולת עם איריס מספריים קנס ו# 3 מלקחיים דומון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי איריס בסדר לעשות בעדינות שני חתכים רוחב מהבסיס באזור מקורי של הגולגולת. הסר את הגולגולת גזור עם שני # 3 מלקחיים. לנתק את החזייהמכל דבקות בגולגולת באמצעות אותו המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח עם סוף הכפית של מרית לצלחת פטרי (מ&quot;מ Ø 35) המכילה 2 מיליליטר של מדיום HBSS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי המכילה את המוח בצלחת פטרי גדולה יותר (O מ&quot;מ 100) מלאה קרח וההעברה לשלב של סטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, לבודד את המוח הקטן מהמוח על ידי dilaceration באמצעות שני # 3 מלקחיים. באופן דומה, להסיר את חוט השדרה השייר וpial-קרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח הקטן בצלחת פטרי מלאה-HBSS חדשה (O 35 מ&quot;מ, 2 מיליליטר) עם הכפית של סוף מרית ולשמור על קרח. </li></ol> 3. הכנת פרוסות המוח הקטן חריפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, לחתוך את המוח הקטן בין vermis והאונה הימנית כפי שצוין על ידי שני ראשי החץ באיור 2 א עם ידית אזמל # סטנדרטי 3 מוצקים ולהב כירורגים # 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפה אחת של ציאןדבק oacrylate על דיסק דגימת vibratome ולחכות 15-25 שניות לחסל אד ממס רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המוח הקטן לחתוך עם סוף הכפית של מרית ולהסיר HBSS העודף במגבות נייר נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את המוח הקטן הקרוב לדיסק הדגימה. תקן את הקצה לחתוך לדיסק הדגימה ולחכות 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את דיסק הדגימה למגש החיץ עם מניפולטור, ולסובב אותו כל כך הציר הרוחבי של המוח הקטן הוא בניצב לבעל הסכין. תקן את דיסק הדגימה עם מפתח אלן ולמלא בעדינות את מגש החיץ עם מדיום HBSS עד המוח הקטן מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען קרח כתוש לאמבטיה הקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שלוש פעמים הלהב עם 70% אתנול לחסל את כל שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הלהב לתוך מחזיק הסכין ובטוח עם הידוק בורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את זכות קצה להב מאחורי הקצה האחורי (מהתצוגה של המשתמש) של הדגימה ולהגדיר אותה כנקודת התחלה. השתמש קדימה הפקודה להגדיר tהוא נקודת הסיום לאחר הקצה הקדמי של הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חתך מהירות 2.5 וחתך תדירות ב8. עובי זמירה בחר ב 180 מיקרומטר. התחל חתך רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים כל קטע באמצעות זכוכית רחבה נשא מקוצצת פיפטה פסטר והעברה לHBSS המכיל צלחת פטרי (O 35 מ&quot;מ) שמר על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים 5 #, להסיר את קרומי המוח בזהירות מהמוח הקטן כאשר מפריע ללהב. לאסוף מקסימום של 5 פרוסות למוח קטן (איור 2, C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרומי המוח מפרוסות המוח הקטן בזהירות עם שני # 5 מלקחיים תחת סטראו ולהפריד את האוניות בעדינות לטעינת בדיקה טובה יותר. </li></ol> 4. פלורסנט הכתמה של interneurons החיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פרוסות המוח הקטן עם טפטפת פסטר מקוצץ זכוכית רחבה נשא לצלחת 6-היטב (מקסימום 3 פרוסות / בכל טוב). לשאוב את מדיום HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות (3 מקסימום) ב 5 מיליליטר של Lפתרון oading של צבע הניאון (10 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגן מפני אור, לכסות את microplate עם רדיד אלומיניום. שים את זה על שולחן ג&#39;יירו-מרגש ב 35 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב RT כדי להקל על תיוג תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פרוסות על הקרום של Transwell להכניס (3.0 מיקרומטר גודל נקבובית; איור 2 ד) עם פיפטה פסטר מקוצצת זכוכית רחבה נשא. לשאוב את מדיום הטעינה עם פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התוסף ולמלא היטב עם 1.9 מיליליטר של DMEM. החלף את הכנס ולהוסיף DMEM של 100 μl על גבי הפרוסה כדי לכסות את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המכילה את התרבות מוסיף בתא החממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 2 שעות שמספיק להתבונן GCS בML. לשקר רקמות שטוחות כדי לאפשר עיקול על הקרום להוסיף (איור 2E). ודא שפרוסות לא מתייבשות. </li></ol> 5. הדמיה Ex vivo באמצעות Confocal Macroscopy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת ללאמכסה הפלסטיק לחממה צמוד לדוכן של macroscope confocal. מניחים כיסוי זכוכית על להכניס את הצלחת של macroscope. לשמור על הטמפרטורה של החדר ב37.0 מעלות צלזיוס ± 0.5 ° C, ולספק את הפרוסות עם זרימת גז קבועה (95% O 2, 5% CO 2) דרך להוסיף הצלחת כדי לשמור על pH הקבוע. חכה לשעה 2 נוספת לפני ניסוי הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרחק כדי להמחיש הגירת GC בחתכי הרקמה, להאיר את ההכנה עם אור באורך גל 488 ננומטר באמצעות דיודות לייזר דרך macroscope סריקת לייזר confocal מצויד מטרה יבשה X2 (עבודה: 39 מ&quot;מ, קוטר: 58 מ&quot;מ, NA = 0.234), ולזהות פליטת הקרינה 500-530 ננומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק כדי לפתור את התנועה של GCS, לרכוש תמונות עם גורם נוסף זום אופטי של 1.5 עד 2.0. לאסוף תמונות של GNS במישור מוקד אחד או עד 10 מטוסי מוקד שונים לאורך ציר z בכל 30 דקות במשך שעה עד 12. </li></ol></li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת צורך, להסיר את כיסוי הזכוכית ולהוסיף כמויות קטנות (1-10 μl) של מפעילים או מעכבים ביולוגיים בDMEM עם פיפטה 10 μl ללמוד את השפיעו על הגירת GC. </li></ol> מעקב 6. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל שעה של הסרט, לבצע הקרנת Z- מחסנית באמצעות מצב ecart-הסוג בImageJ. לווסת את הניגוד ואת רמות הבהירות של תמונות הרצופות כדי להקל על זיהוי והמעקב של GCS שכותרת. מפה ידנית בכל עמדה על תמונת ההתייחסות (בזמן t = 0). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוסף &quot;מעקב ידני&quot; בתפריט החלקיקים לנתח ולקבוע על ידי לחיצה על הנקודה של כל גוף תא הכובד במהלך הזמן לשגות. לייצא את נתוני מעקב הגלם בגיליון אלקטרוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן מחדש את נתוני מעקב גלם המיוצאים מImageJ עם תכנית חכמה תוצרת בית (http://primacen.fr, נכתבה בקוד PHP) המזהות את כל תא ועמדות הקשורות. באמצעות התכנית, calculatדואר המרחק הכולל נסע ומהירות הממוצעת של הגירה לכל תא. לסווג ולהשוות מאפיינים של נדידת תאים בתנאי בקרה וטיפול במסננים מתאימים באמצעות אותה התכנית. </li></ol>

<ol>
	<li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+in+the+Cerebellum.">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex.">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li><li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration.">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li><li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2++spike+frequency.">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li><li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+(tPA)+in+neuronal+cells:+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li><li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li><li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-A2+and+its+ligand,+Sema6A,+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells.">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+granule+cell+migration:+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations.">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li><li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(PACAP)+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex.">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li><li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li><li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+(tPA)+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones.">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li><li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration.">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li><li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum.">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li><li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration,+axonal+growth,+and+pathfinding.">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li><li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain.">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li><li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+for+activation+of+the+PAC1+receptor.">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את התרבות של פרוסות המוח הקטן עכברוש P10 חריפים במערכת Transwell ותיוג הניאון של GC עם צבע ניאון ירוק ללמוד נדידת תאים במהלך התפתחות לאחר לידה באמצעות macroscopy confocal. פרוטוקול זה מאפשר תצפיות של נדידת תאים לתקופה של עד 12 שעות ובדיקה של התפקידים האפשריים של ויסות גורמים בהגירה כוללים אגוניסטים או יריבים של נוירופפטידים, מעכבי אנזים, מאפנני תא איתות או חומרים רעילים במהלך הניסוי. חור קטן בהוספת הקרום עם קצה פיפטה יש צורך להקל על ממשל של תרכובות במדיום הדגירה. פיפטה קצה מעוגלת תוצרת בית ניתן להשתמש כדי להקל על המשלוח של פתרון. נושא אחד מחקרי נדידת תאים בחי פרוסות רקמה הוא שהתנועות של הרקמה עצמה יכולה לעשות תא מעקב קשה. ואילו גישות קודמות הציעו לייצב SLI בעדינותCES עם רשת ניילון או שכבה דקה של קולגן זנב החולדה 7,17, יתרון עיקרי של טכנולוגיה זו היא ההעברה הפשוטה וישירה של צלחת תרבות 6 היטב המכילה פרוסות המוח הקטן במוסיף קרום מן החממה CO 2 תחת המטרה של macroscope confocal. בקרי טמפרטורה משולבת ו- CO 2 גם מספקים פרמטרים סביבתיים מתאימים וקבועים חיוניים לתא הגירה 9. לכן, תנאי תרבות נשמרים במהלך תצפיות ותנועות רקמה הם מזעריים מאז פרוסות מחוברות היטב להוספת הקרום. ייצוב הרקמות מאומת על ידי ביצוע העמדה של קצוות פרוסה או תאי פורקינג שצריך להיות קבוע אזכור במהלך רכישה. בנוסף, פרוסות המוח הקטן (בין 12 ל 18) שהופצו ב6 הבארות של הצלחת ניתן לצפות במהירות בפירוט בשלב ממונע וזום אופטי. בשל המרחק הגדול עבודה (X2, 39 מ&quot;מ) של המטרה היבשה, עלית-observation הוא ללא טבילה וממשל של תרכובות במדיום התרבות הוא הרבה יותר קל. לכן, פרמטרים סביבתיים ודמיון תמיכת התרבות בCO 2 באינקובטור וconfocal macroscopy להוביל לשימור מרבי של המדגם הביולוגי. יתרון נוסף של הפרוטוקול הוא השדה הגדול של תצוגה וכתוצאה מכך המספר הגדול של תאים שניתן לראות בו זמנית. לדוגמא, יש לנו קבענו בעבר כי הצפיפות של GCS ניאון עם הגירת רדיאלי בML הייתה 1,124 ± 138 תאים / מ&quot;מ 2 18. macroscopy confocal (X2, NA = 0.234) בעל רזולוציה לרוחב נמוך יותר בהשוואה למיקרוסקופיה confocal (40X, NA = 1.25), אך תא גופות של GCS ניתן לעקוב בקלות והמהירות הממוצעת של הגירה היא השוואה בין שני גישות טכנולוגיות 7,18 . מלבד שיפור טכני לרכישות תמונה, האיכות של פרוסות וה רקמותאיכות דואר של תיוג הן נקודות מפתח לניסויים מוצלחים. תמיד לשמור על תקשורת ורקמות על קרח במהלך תהליכי נתיחה, לחסל שמן על vibratome להבים ולא לנצל את פרוסות רקמה במגע עם דבק. סעיפי sagittal והרוחביים מותאמים לרדיאלי והגירה משיקה בהתאמה. השתמש באורכים שונים של דגירה לגילוי נאות בשכבות בקליפת המוח השונות של המוח הקטן. פעמים דגירה ארוכות (עד 8 שעות) נחוצות כדי לזהות את ההגירה של מספר רב של GCS בPCL וIGL. מאז הגירת GC הוא תהליך פיסיולוגי במהלך חלונות מרחב ובזמן ספציפיים, השליטה החיובית היא שהתאים צריכים להעביר כראוי. בפרט, GC ציר רב בML הוא אחד מחוון הבריאות העיקרי לפרוסות המוח הקטן sagittal. להתחלת ניסויים, תצפיות של תנועות GC בML הוא הציע. ואכן, את הצורה של GC עם גוף תא מוארך אנכי צריכה להיחשב כנקודת התייחסות להתחיל ACquisition עם שליטה רצופה (2 שעות) וטיפול (2 שעות) תקופות שניתן לבצע בקלות בML. צבעי ניאון כמו משפחת Tracker הנייד או חלבוני הניאון באו לידי ביטוי במבנים גנטיים יכולים לשמש כקליעים נותבים ללימודי נדידת תאים. בשל קינטיקה האיטית של הגירת GC (מחסנית 1 בכל 30 דקות), יכולים גם להתבצע ניסויי ססגוניות במצב רציף מאז 4 קורות לייזרים (405, 488, 532 ו633 ננומטר) זמינים במערכת. בהתחשב הגירת רדיאלי צנטריפטלי וצנטריפוגלי, מעקב של interneurons אחרת גם יכול להתממש 18. בפרט, יכולים להיות מקומיים סוגי תאים רבים פחות בקלות רבה יותר עם שדה גדול של השקפה. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור נדידת תאים בשלבים אחרים של פיתוח המוח הקטן, אלא גם אזורים אחרים במוח.

במוח הקטן הפיתוח, שמונה סוגים שונים של תאי עצב מיוצרים ברצף בין השבוע השני העוברי והשבוע לאחר הלידה השנייה במכרסמים 1. מקורו בתחילה מ, אזור נבטי עיקרי, תאים לא בשלים גרגיר (GC) הם נוירונים האחרונים שהופקו מהשכבה החיצונית הגרעינית (EGL), אזור נבטי משנית 2. במהלך שלושת השבועות לאחר הלידה הראשון, קליפת המוח הקטנה הוא מבנה foliated המאורגן בארבע שכבות כוללים EGL, השכבה המולקולרית (ML), שכבת פורקינג &#39;התא (PCL) והשכבה הפנימית גרגירים (IGL) (איור 1). באמצעות הגירה הצנטריפטלי, GCS לא בוגר, interneurons glutamatergic, להגיע IGL בתוך כ 2 ימים. בשבוע שלאחר הלידה השלישי, EGL נעלם וIGL מהווה מה שנקרא שכבת גרגרים (GL) במוח הקטן למבוגר. בGL, GCS לקבל תשומות הסינפטי מעוררות מסיבי אזובי ותאי מברשת חד קוטביים, ותשומות הסינפטי מעכבות מהאקסונים של תאי Golgi. בML, האקסונים GC לעשות סינפסות מעוררות עם נוירונים GABAergic כוללים תאי פורקינג &#39;, תאי סל, תאים דמויים כוכב, ותאי Golgi 2. תצפית בזמן אמת של תנועת תא במוח קטנה פרוסות חריפות המתקבלות ממכרסמים לאחר לידה מוקדמות מוכיחה כי GCS לשנות את צורתם במקביל לשינויים באופנות והמהירות של הגירה במסלולם במוח הקטנה הקליפה 3. במהלך שבועיים שלאחר לידה ראשון, מבשרי GC להתרבות באופן פעיל בחלק העליון של EGL. בחלק האמצעי של EGL, GCS postmitotic להעביר בעקיפין בכיוון של התהליך הגדול יותר שלהם. בגבול EGL-ML, GCS להאט את תנועתם, התאים מתחילים להיכנס לתהליך יורד אנכי קצר לML. בML, יש לי GCS גוף מוארך אנכי תא, תהליך נגרר דק ותהליך מוביל משופע יותר, ולהעביר רדיאלית לאורך סיבי גליה ברגמן. בתוך הPCL, GCS לעצור התנועה שלהם, אבל אחרי שלב ממושך נייח (2 שעות), שהם חוצים את גבול PCL-IGL. בIGL, GCS להעביר לתחתית השכבה בהעדר תמיכת סיבי גליה. ברגע שהעצות של התהליך המוביל להתקרב לגבול עניין IGL-לבן (WM), GCS איטי ולעצור את תנועתם. סעיפים רוחביים של המוח הקטן עדיפים ללימודי הגירה משיקים בEGL בעוד פרוסות sagittal מוקדשות לרדיאלי הגירה בML, PCL וIGL. כמה גורמי רגולציה של תנועות GC כוללים נוירו (למשל, סומטוסטטין, PACAP) זוהה עד כה, אך המנגנונים שלמים המעורבים בשליטת המרחב ובזמן של הגירת GC בכל שכבת קליפת המוח עדיין 1,4,5,6 במידה רבה לא ידועים. הגירת GC נחקרה במהלך 20 השנים האחרונות באמצעות וידאו ומיקרוסקופיה confocal באמצעות תאורת אור או מועברת לתאים מבודדים בתרבית או גילוי הקרינה לACUפרוסות המוח הקטן te. DiI תחילה lipophilic, ולאחרונה צבעים &quot;Tracker תא&quot; וחלבוני ניאון הביע תא שמשו למיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים 7,8. ניסויים מוצלחים תלויים במספר ההליכים הספציפיים שהופכים את הפרוטוקול פשוט אך לא קל. בפרט, פרוסות חריפות צריכה להיות התייצבו במהלך תצפיות בדרך כלל עם רשת רשת ניילון תוצרת בית 9. עוצמת הארת אור צריך להיות נמוך ככל האפשר כדי למנוע phototoxicity וphotobleaching כפי שהוצע על ידי גישת מיקרוסקופ confocal סריקה מרובות. בנוסף, טמפרטורה ו- CO 2 פרמטרים סביבתיים מרכזיים מאז חוסר יציבות עלולה להשפיע על נדידת נוירונים. כדי להקל ולשפר את הליכי הניסוי, פיתחנו פרוטוקול macroscopy confocal שמגביל תנועות פרוסה, מבטיח פרמטרים סביבתיים קבועים, מפחית photobleaching, מגביר שדה הראייה (על סדר milimeters) וconsequently מספר התאים (עשרות) שניתן לעקוב באמצעות ניתוח תמונה. לפיכך, 180 מיקרומטר פרוסות עבות בתרבית במוסיף קרום, ו6-גם צלחות מועברות ישירות תחת מטרה ממונעת 2X של macroscope confocal המסחרי מצוידים בדגירה גדולה קאמרית, מערכת בקרת רטט טמפרטורה ו- CO 2 בקרים ו. זמן מעידות וZ- ערימות מבוצעות לאחר מכן על פני כמה שעות וכלים תרופתיים או ניתן להוסיף מולקולות ביו או נמסרו במדיום הדגירה. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת ללמוד ההגירה של הסוגים של תאי עצב במוח הקטן או המוח בשלבי התפתחותיים שונים האחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACAP38</td>
			<td>INRS, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Bourgault et al., 200919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAI-1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td>
			<td>O973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Transwell-Clear inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 35 mm diameter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100 mm diameter</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylen tube (15 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0800DF/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological safety cabinet fume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MSC9 Class II A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adjustable-volume pipette (0,5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gyro-rocker, SSL3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, Hera Cell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal macroscope, TCS LSI</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, M205 C</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors, curved, blunt/blunt</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>03.03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>149090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 and #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11293-00 and 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome injector blades/single edge</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard scalpel handle #3 solid</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade #15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of postnatal cerebellar granule cell migration using confocal macroscopy

במהלך התפתחות לאחר לידה, תאים לא בשלים גרגיר (interneurons מעוררת) תערוכה הגירה משיקה בשכבת גרגרים החיצונית, ולאחר מכן הגירת רדיאלי בשכבה המולקולרית ושכבת תאי פורקינג להגיע שכבת גרגרים הפנימית של קליפת המוח הקטנה. ברירת מחדל בתהליכים נודדים גורמת גם מוות של תאים או מיקום שגוי של תאי העצב, שהוביל לגירעונות בפונקציות המוח הקטן מגוונות. נדידת תאי גרגיר הצנטריפטלי כרוכה במספר מנגנונים, כגון chemotaxis והשפלה מטריקס, כדי להנחות את התאים למיקום הסופי שלהם, אבל הגורמים המווסתים את נדידת תאים בכל שכבת קליפת המוח ידועים רק באופן חלקי. בשיטה שלנו, פרוסות המוח הקטן חריפות ערוכות מP10 חולדות, תאי גרגיר מסומנים עם סמן cytoplasmic ניאון ורקמות בתרבית על קרום מוסיף 4-10 שעות לפני תחילת ניטור של נדידת תאים בזמן אמת על ידי macroscopy confocal על 37 מעלות צלזיוס בתוך הנוכחות של CO 2. במהלך נדידתם בשכבות בקליפת המוח השונות של המוח הקטן, יכולים להיות חשופים תאי גרגיר לאגוניסטים neuropeptide או יריבים, מעכבי פרוטאז, חוסמי של effectors תאיים או חומרים רעילים אפילו כמו אלכוהול או מתיל כספי לחקור תפקידם האפשרי ברגולציה של נדידת נוירונים .

במוח הקטן לאחר הלידה המוקדם, GCS מציג שינויים משמעותיים במצב והמהירות של הגירתם כפי שהם חוצים שכבות בקליפת המוח שונות 1 (איור 1). סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג על ידי לימוד הגירת GC בסביבה הטבעית שלהם סלולרית. פרוסות רקמת המוח הקטן עכברוש P10 שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי ירוק נבחנות תחת macroscope confocal (איור 3 א) ואנו מראים כי GCS להעביר רדיאלית בML עם מהירות של 18 מיקרומטר / שעה ממוצעת (איור 3, C). עד כה, את התפקיד של אינטראקציות / תקשורת בין תאים עצביים וגליה כוללים גורמי הרגולציה והמנגנונים מולקולריים המעורבים בשליטה של ​​נדידת תאים בכל שכבת קליפת המוח הוא במידה רבה לא ידועה. כתוצאה מכך, הבעיה העיקרית היא לזהות נוירו, מוליכים עצביים, neurotrophins ורכיבי מטריצה ​​תאיים שיכול לשחק תפקיד באלה שכבה-ספציפי בקליפת המוחשינויי פיק של המהירות במהלך תהליך הגירתם. פוליפפטיד יותרת המוח adenylate הפעלה-cyclase (PACAP) מזוהה בעיקר בPCL, אלא גם בML וIGL בשבועות לאחר הלידה הראשונים במכרסמים 7,10,11. יישום של PACAP38 (10 -6 M) למדיום התרבות הביא 79% ירידה במהירות של GC בML. לדוגמא, מהירות ההעברה של GCS בML ירד מ 11.9 מיקרומטר / שעה בתנאי שליטה 2.5 מיקרומטר / שעה לאחר מתן PACAP38 (איור 4 א). activator רקמות סוג plasminogen (tPA) הוא חבר של מפל מפרקי החלבונים שמוביל לזילות של רכיבי מטריצה ​​תאית (EM) כגון מולקולות הידבקות תא או laminin 12,13. tPA וplasminogen, מצע של tPA, מתגלים בשכבות בקליפת המוח במהלך ההתפתחות של המוח הקטן 14,15,16 לאחר הלידה. מנהל של PAI-1 (10 -7 מ &#39;), מעכב של אנדוגני tPA, הפחית ב- 78% GCהגירה בML. לדוגמא, GCS מופחת מהירות הגירה בML מ19.2 מיקרומטר / שעה בתנאי שליטה 4.2 מיקרומטר / שעה לאחר תוספת של PAI-1 (איור 4). תוצאות אלו מצביעות כי PACAP מפעילה השפעה מעכבת ישירה על תנועות GC ושפרוטאז סרין tPA מאפשר ההגירה של GCS בML של המוח הקטן עכברוש פיתוח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג 3D של הגירת GC בקליפת המוח הקטנה שלאחר הלידה. 1-4, הרחבה של תהליכי GC והגירה משיקה בEGL. 5, הגירת רדיאלי בML לאורך סיבי גליה ברגמן. 6, שלב חלוף נייח בPCL. 7, הגירת גליה-עצמאית רדיאלי בIGL. 8, השלמת הגירת GC בIGL GC, תא גרגיר, באדום;. EGL, שכבת גרגרים חיצונית; B, גליה ברגמן, בסגול הכהה; G, תא Golgi, בצהוב; CF, סיבי טיפוס, בכחול; ז, תאי גרגיר postmigratory, באור הירוק; IGL, שכבת גרגרים פנימית; MFT, סיבי אזובי מסוף, בצבע ירוק כהה, ML, שכבה מולקולרית; P, תא פורקינג &#39;, באור סגולה; שכבת PCL, פורקינג&#39; תא. נתון זה שונה מ5. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> איור 2: תרבות vivo לשעבר של פרוסות המוח הקטן P10 () המוח הקטן גזור מן החולדה P10.. בר סולם = 6 מ&quot;מ. מיקרוסקופ (B) של חיים 180 פרוסה המוח הקטן מיקרומטר עבה דרך stereomicroscopy. בר סולם = 3 מ&quot;מ. (ג) בהגדלה גבוהה יותר, ארבע השכבות בקליפת המוח (EGL, ML, PCL, IGL) של המוח הקטן הן כבר להבחין. בר סולם = 1 מ&quot;מ. (ד) לאחר תיוג ניאון, פרוסות רקמה מונחים על התרבות מוסיף (קוטר 24 מ&quot;מ) לתוך צלחת 6-גם. ייצוג סכמטי של הכנס תרבות עם קרום פוליאסטר תרבית רקמה שטופל (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> איור 3: הגירה דינמית של GCS בשכבות בקליפת המוח של המוח הקטן P10 העכברוש (א) להציג Macroconfocal (XYZ, הקרנת 2D) של פרוסת המוח הקטן עכברוש P10 בי GCS מסומנים עם צבע פלואורסצנטי cytoplasmic ירוק.. בר סולם = 75 מיקרומטר. זמן לשגות הדמיה מראה GC (ב)תנועות בML ידי macroscopy confocal במשך 4 שעות בתנאי שליטה. כוכבית (*) סמל מסמן את סומה GC. זמן שחלף (בדקות) מצויינים בתחתית כל photomicrograph. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ג) שינויים עוקבים במרחק שעובר סומה GC. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> איור 4:. אפקט של מעכב פרוטאז neuropeptide והגירת GC GC () היה במעקב בML ידי macroscopy confocal לשעה 2 בתנאי שליטה ולאחר מכן לשעה 2 בנוכחות פוליפפטיד adenylate יותרת המוח ההפעלה-cyclase (PACAP). GC (ב) היה במעקב בML ידי macroscopy confocal לשעה 2 בתנאי שליטה ולאחר מכן לשעה 2 בנוכחות activator plasminogen מעכב-1 (PAI-1).

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

9.3K Views.  Inserm, IRIB, University of Rouen. During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Video: Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

עכבר המוח האחורי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.