Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Investigação e Inovação em Biomedicina (IRIB), a Plataforma de imagens de células de Normandy (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, da Universidade de Rouen, o Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER - Perene, Interreg 4A), o LARC-Neurociências Rede e da Região Haute-Normandie.

Animais (ratos Wistar machos ou fêmeas) foram nascidos e criados em uma facilidade animal acreditado (aprovação B.76-451-04), de acordo com o guia francês para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os experimentos foram conduzidos sob a supervisão de investigadores autorizados (MB, DV e LG), em conformidade com a Directiva Europeia Conselho da Comunidade (2010/63 / UE, de 22 de setembro de 2010) e do Ministério da Agricultura francês. 1. Preparação de Mídia e Ferramentas <ol><li> Em uma câmara de segurança biológica, preparar BSS de 1x Hank (HBSS) em água estéril a partir da solução estoque 10x contendo CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l), sem MgCl2. Adicionar NaHCO 3 (350 ug / ml) para 1x solução de HBSS. </li><li> Em uma câmara de segurança biológica, adicionar suplemento de N2 (a partir de uma solução estoque de 100x) e penicilina (100 unidades / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) solução de meio de Eagle modificado (DMEM), mistura nutriente de Dulbeccotura F-12 (1: 1). </li><li> Em condições estéreis, preparar uma aliquota (25 uL, 2 mM) do corante fluorescente citoplasmática chamada celular Rastreio verde em DMSO (1,075 ml para 1 mg). Dilui-se uma alíquota de 5 ml de meio DMEM num tubo de 15 ml. </li><li> Prepare cheio de gelo balde para manter media a 4 ° C. </li><li> Descontaminar bancadas de laboratório e ferramentas com etanol 70%. </li></ol> 2. Dissecção da Cerebelo de P10 Rats <ol><li> Rapidamente decapitar filhotes de ratos (P10) com uma tesoura operacionais curvas atrás das orelhas, a fim de obter o início da medula espinhal. </li><li> Ao lado de volta o da cabeça decapitada, fazer incisão mediana da pele do pescoço até o nariz com íris finas tesouras e separar a pele do crânio com íris finas tesouras e fórceps Dumont # 3. </li><li> Use tesouras finas íris delicadamente para fazer duas incisões laterais a partir da base para a região rostral do crânio. Remover o crânio dissecado com dois # 3 fórceps. Retire o sutiãa partir de qualquer aderência com o crânio utilizando as mesmas pinças. </li><li> Transferir o cérebro, com o fim de colher uma espátula para uma placa de Petri (Ø 35 mm), contendo 2 ml de meio de HBSS arrefecido com gelo. </li><li> Colocar a placa de Petri contendo o cérebro de um prato Petri maior (Ø 100 mm) cheia de gelo e transferência para a fase do estereomicroscópio. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, isolar o cerebelo do cérebro por dilaceração usando dois # 3 fórceps. De modo semelhante, remover a medula espinal e o residual da membrana pial. </li><li> Transferir o cerebelo em HBSS uma nova placa de Petri cheia (Ø 35 mm, 2 ml) com o fim de colher uma espátula e manter em gelo. </li></ol> 3. Preparação de agudos Cerebelar Slices <ol><li> Sob o microscópio estereoscópico, cortar o cerebelo entre vermis e o hemisfério direito como indicado pelas duas cabeças de seta na figura 2A com um cabo de bisturi padrão # 3 sólido e uma lâmina cirúrgica # 15. </li><li> Coloque uma gota de cianooacrylate cola no disco de amostra vibratome e esperar 15-25 seg para eliminar vapores de solventes tóxicos. </li><li> Recolher o cerebelo corte com o fim de colher uma espátula e remover o excesso de HBSS com toalhas de papel limpo. </li><li> Traga o cerebelo perto do disco de amostra. Fixe a borda de corte para o disco de amostra e esperar 10 segundos. </li><li> Insira o disco de amostra na bandeja de tampão com o manipulador, e gire-o para o eixo transversal do cerebelo é perpendicular ao titular da faca. Fixar o disco de amostra com uma chave Allen e preencher cuidadosamente a bandeja de tampão com meio HBSS até o cerebelo é coberto. </li><li> Carga de gelo picado para o banho de arrefecimento. </li><li> Limpar as lâminas três vezes com etanol a 70% para eliminar qualquer óleo. </li><li> Insira a lâmina no suporte para navalha e fixe com o parafuso de fixação. </li><li> Coloque o direito borda da lâmina atrás da extremidade traseira (do ponto de vista do usuário) da amostra e defini-lo como um ponto de partida. Use a frente comando para definir tele ponto final após o bordo da frente do espécime. </li><li> Selecione seccionamento velocidade a 2,5 e frequência de corte em 8. Selecione a espessura de corte a 180 mm. Iniciar o corte do tecido. </li><li> Pegue cada seção usando um copo grande de cano truncado Pasteur pipeta e transferir para HBSS contendo placa de Petri (Ø 35 mm) mantidos em gelo. </li><li> Usando dois # 5 pinça, retire cuidadosamente as meninges do cerebelo quando interfere com a lâmina. Recolhe um máximo de 5 fatias por cerebelo (Figura 2B, C). </li><li> Retire as meninges de as fatias de cerebelo cuidadosamente com dois # 5 fórceps sob o microscópio estereoscópico e separar os lóbulos suavemente para melhor carregamento da sonda. </li></ol> 4. fluorescente Coloração de Interneurônios de Vida <ol><li> Transferir fatias cerebelares com uma pipeta de Pasteur de vidro grande calibre truncado para uma placa de 6 poços (max 3 fatias / por cavidade). Aspirar o meio HBSS. </li><li> Incubar fatias (3 no máximo) em 5 ml de loading solução do corante fluorescente (10 uM). </li><li> Para proteger da luz, cobrir a microplaca com papel alumínio. Coloque-o sobre uma mesa giroscópio em movimento a 35 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente para facilitar a rotulagem celular. </li><li> Fatias de transferência na membrana de um Transwell insere (3,0 mm de tamanho de poro; Figura 2D) com uma pipeta Pasteur de vidro wide-bore truncado. Aspirar o meio de carga com pipeta. </li><li> Remova a inserção e encher o poço com 1,9 ml de DMEM. Substituir o inserto e adicionar 100 ul de DMEM em cima da fatia para cobrir o tecido. </li><li> Colocar a placa contendo as inserções de cultura na câmara incubadora (37 ° C, 5% de CO2) durante 2 horas o que é suficiente para observar GCs no ML. Deite tecidos lisos para permitir a ligação na membrana de inserção (Figura 2E). Certifique-se de que as fatias não estão secando. </li></ol> 5. Ex vivo de imagens Através confocal Macroscopia <ol><li> Transferir a placa sema tampa de plástico em uma incubadora ligada ao suporte de um macroscope confocal. Coloque uma tampa de vidro sobre a inserção da placa macroscope. Manter a temperatura da câmara a 37,0 ° C ± 0,5 ° C, e fornecer as fatias com fluxo constante de gases (95% O2, 5% de CO 2) através da placa de inserção para manter o pH constante. Espere por mais 2 horas antes da experiência de lapso de tempo. </li><li> Para visualizar a distância de migração GC nas fatias de tecido, iluminar a preparação com uma luz de comprimento de onda de 488 nm por meio de um diodo de laser através de um macroscópio confocal de varrimento laser equipado com uma objectiva seco X2 (de trabalho: 39 mm, diâmetro: 58 mm, NA = 0,234), e detectar emissão de fluorescência 500-530 nm. <ol><li> Para resolver finamente o movimento de GCs, aquisição de imagens com um fator de zoom óptico adicional de 1,5 a 2,0. Recolha de imagens GNs num único plano focal ou até 10 diferentes planos focais ao longo do eixo z a cada 30 min até 12 h. </li></ol></li&gt; <li> Quando necessário, retire a tampa de vidro e adicionar pequenos volumes (1-10 ul) de ativadores ou inibidores biológicos em DMEM com uma pipeta 10 ul para estudar seu efeito sobre a migração GC. </li></ol> Rastreamento 6. celular <ol><li> Para cada momento do filme, execute projeção z-stack através do modo de tipo ecart em ImageJ. Modular o contraste e os níveis de brilho das imagens sucessivas para facilitar a identificação e o seguimento dos GCs rotulados. Mapa manualmente cada posição no instantâneo de referência (a t = 0). <ol><li> Use o plugin &quot;Rastreio manual&quot; no Menu Particle Analisar e determinar clicando no ponto de gravidade de cada corpo celular durante lapso de tempo. Exportar os dados de rastreamento de matérias em uma planilha. </li></ol></li><li> Reorganizar os dados de rastreamento de matérias exportadas de ImageJ com um programa inteligente home-made (http://primacen.fr, escrito em código PHP) que identificam cada célula e posições associadas. Usando o programa, calculatè A distância total percorrida ea velocidade média de migração para cada célula. Classificar e comparar as características de migração de células em condições de controlo e de tratamento sob filtros apropriados utilizando o mesmo programa. </li></ol>

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	<li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+in+the+Cerebellum.">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex.">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li><li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration.">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li><li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2++spike+frequency.">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li><li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+(tPA)+in+neuronal+cells:+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li><li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li><li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-A2+and+its+ligand,+Sema6A,+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells.">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+granule+cell+migration:+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations.">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li><li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(PACAP)+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex.">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li><li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li><li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+(tPA)+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones.">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li><li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration.">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li><li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum.">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li><li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration,+axonal+growth,+and+pathfinding.">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li><li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain.">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li><li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+for+activation+of+the+PAC1+receptor.">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve a cultura de fatias de ratos P10 cerebelares agudos no sistema Transwell e a marcação fluorescente de GC com um corante fluorescente verde para estudar a migração de células durante o desenvolvimento pós-natal através macroscópica confocal. Este protocolo permite a migração de células de observações durante um período de até 12 horas e os testes de funções possíveis de factores, incluindo a migração de agonistas ou antagonistas de neuropéptidos, inibidores de enzimas, moduladores de sinalização celular e substâncias tóxicas, durante o experimento de regulação. Um pequeno orifício na inserção da membrana com uma ponta de pipeta é necessário para facilitar a administração dos compostos no meio de incubação. Uma curva ponteira caseiras podem ser usadas para facilitar a libertação da solução. Uma questão de estudos de migração celular em fatias de tecido vivo é que os movimentos do próprio tecido pode tornar difícil rastrear celular. Considerando que as abordagens anteriores têm proposto para estabilizar suavemente SLIces com uma malha de nylon ou uma fina camada de colagénio de cauda de rato 7,17, uma vantagem principal desta tecnologia é a transferência simples e directo de uma placa de cultura de 6 poços contendo fatias cerebelares sobre inserções de membrana a partir da incubadora de CO 2 no âmbito do objectivo de um macroscópio confocal. Controladores de temperatura integrado e CO 2 também fornecer parâmetros ambientais pertinentes e constantes essenciais para a migração celular 9. Portanto, as condições de cultura são mantidos durante as observações e movimentos dos tecidos são minimizados uma vez que as fatias são bem ligado à inserção da membrana. Estabilização do tecido é verificado, seguindo a posição de corte ou arestas células de Purkinje, que se pode fixar referências durante a aquisição. Além disso, as fatias de cerebelo (entre 12 e 18) distribuídos nas 6 cavidades da placa pode ser rapidamente observado em detalhe com uma platina motorizada e um zoom óptico. Devido à grande distância de trabalho (X2, 39 mm), do objectivo seco, epi-observation é livre de imersão e a administração de compostos no meio de cultura é muito mais fácil. Portanto, os parâmetros ambientais e semelhanças de apoio a cultura em incubadora de CO 2 e confocal MACROSCOPIA levar a conservação máximo da amostra biológica. Uma outra vantagem do protocolo é o grande campo de visão e, consequentemente, o grande número de células que podem ser observados simultaneamente. Por exemplo, temos anteriormente determinado que a densidade dos GCs fluorescentes com migração radial no ML foi 1124 ± 138 células / mm 2 18. Macroscopia confocal (X2, NA = 0,234) tem uma resolução lateral inferior em comparação com a microscopia confocal (40X, NA = 1,25), mas célula corpos de GCs podem ser facilmente rastreados e da velocidade média de migração é comparável entre os dois tecnológico aproxima 7,18 . Além de aprimoramento técnico para aquisições de imagem, a qualidade de fatias de tecido e the qualidade de rotulagem são pontos-chave para experiências bem-sucedidas. Sempre mantenha mídia e tecidos em gelo durante os processos de dissecação, eliminar óleo no vibratome lâminas e não utilizam fatias de tecido em contato com cola. Cortes sagitais e transversais são adaptados para a migração radial e tangencial, respectivamente. Use diferentes comprimentos de incubação para a detecção apropriada nas diferentes camadas corticais do cerebelo. Longos tempos de incubação (para cima de 8 h) são necessárias para a detecção da migração de numerosos GCs no PCL e a IGL. Uma vez que a migração de GC é um processo fisiológico durante as janelas de espaço-temporais específicas, o controlo positivo é de que as células têm de migrar adequadamente. Em particular, numerosos CG fuso no ML é um dos principais indicadores de saúde para fatias sagitais cerebelares. Para iniciar experimentos, sugere observação dos movimentos GC no ML. Com efeito, a forma do corpo da célula com GC verticalmente alongado deve ser considerada como um ponto de referência para iniciar acaqui- com controlo sucessivo (2 horas) e o tratamento (2 horas) períodos que podem ser facilmente realizados na ML. Corantes fluorescentes, como a família Rastreio celular ou proteínas fluorescentes expressas através de construções genéticas pode ser usada como marcadores em estudos de migração celular. Devido à cinética lenta migração de GC (uma pilha de cada 30 min), as experiências multicolor também pode ser realizada em modo sequencial desde 4 lasers vigas (405, 488, 532 e 633 nm) estão disponíveis no sistema. Considerando migração radial centrífuga e centrípeta, rastreamento de outros interneurónios também pode ser realizado 18. Em particular, menos numerosos tipos de células pode ser mais facilmente localizada com um grande campo de visão. Finalmente, este protocolo pode ser utilizado para estudar a migração celular nas outras fases de desenvolvimento do cerebelo, mas também de outras áreas do cérebro.

No cerebelo em desenvolvimento, oito tipos diferentes de neurónios são produzidos sequencialmente entre a segunda semana embrionário e pós-natal, a segunda semana em roedores 1. Originário inicialmente a partir de, uma zona germinal primário, as células granulares imaturos (GC) são os últimos neurônios a serem produzidos a partir da camada externa granular (EGL), uma zona germinal secundário 2. Durante as três primeiras semanas pós-natal, do córtex cerebelar é uma estrutura folheada organizada em quatro camadas, incluindo da EGL, a camada molecular (ML), a camada de Purkinje célula (PCL) e a camada granular interna (IGL) (Figura 1). Através de migração centrípeta, imaturo GCs, interneurônios glutamatérgicos, chegar ao IGL dentro de aproximadamente dois dias. Na terceira semana pós-natal, a EGL desaparece ea IGL constitui o que é chamado a camada granular (GL) no cerebelo de adultos. No GL, GCs receber entradas sináptica excitatória de fibras cobertas de musgo e células escova unipolares, eentradas sinápticas inibidores de axónios de células de Golgi. No ML, os axônios GC fazer sinapses excitatórias com neurônios gabaérgicos, incluindo células de Purkinje, as células cesta, células estreladas e células de Golgi 2. Observação em tempo real do movimento de células em fatias cerebelares agudos obtidos a partir de roedores pós-natais precoces demonstra que os GC modificar a sua forma concomitante com alterações na modalidade e a velocidade de migração durante o seu percurso no córtex cerebelar 3. Durante os primeiros dois dias pós-natais, precursores GC proliferam activamente na parte superior da EGL. Na parte média da EGL, pós-mitótico GCs migrar tangencialmente na direcção do seu processo maior. Na fronteira EGL-ML, GCs retardar seu movimento, as células começam a entrar em um processo descendente vertical curta para o ML. No ML, GCs têm um corpo celular verticalmente alongada, um processo de fuga fina e um processo que conduza mais volumoso, e migrar radialmente ao longo das fibras gliais Bergmann. NoPCL, GCs parar o seu movimento, mas depois de uma fase estacionária prolongada (2 horas), eles atravessam a fronteira PCL-IGL. No IGL, GCs migrar para a parte inferior da camada, na ausência de suporte de fibra glial. Uma vez que as pontas do processo conducente aproximar da fronteira importa IGL-branco (WM), GCs lento e parar seu movimento. Cortes transversais do cerebelo são preferidos para estudos de migração tangenciais na EGL enquanto fatias sagital são dedicados a migração radial no ML, PCL e IGL. Alguns factores reguladores de movimentos GC incluindo neuropeptídeos (por exemplo, somatostatina, PACAP) foram identificados até agora, mas os mecanismos completos envolvidos no controle espaço-temporal da migração de GC em cada camada cortical ainda são 1,4,5,6 em grande parte desconhecida. Migração GC foi estudado durante os últimos 20 anos através de vídeo e microscopia confocal usando iluminação de luz transmitida para as células cultivadas isoladas ou detecção de fluorescência para acufatias de cerebelo te. Inicialmente DII lipofílicos, e, mais recentemente, &quot;celular&quot; Rastreio de corantes fluorescentes e as proteínas expressas de células foram usadas para confocal ou microscopia de dois fotões 7,8. Experiências bem sucedidas dependem de um número de procedimentos específicos que tornam o protocolo simples, mas não é fácil. Em particular, fatias aguda têm que ser estabilizadas durante observações geralmente com uma rede de malha de nylon caseira 9. A intensidade de luz de iluminação deve ser tão baixa quanto possível para evitar a fototoxicidade e foto-branqueamento, tal como proposto por varrimento multiponto abordagem microscópio confocal. Além disso, a temperatura e CO 2 são parâmetros ambientais fundamentais pois a instabilidade pode afetar a migração neuronal. Para facilitar e aperfeiçoar os procedimentos experimentais, temos desenvolvido um protocolo macroscopia confocal que limita movimentos fatia, assegura parâmetros ambientais constantes, reduz fotodegradação, campo de visão aumenta (da ordem de milímetros) e consequtemente o número de células (dezenas) que podem ser rastreados através de análise de imagem. Assim, 180 mm fatias grossas são cultivados em inserções de membrana e placas de 6 poços são transferidos diretamente sob um objetivo motorizado 2X de um macroscope confocal comercial equipado com uma grande câmara de incubação, temperatura e CO 2 controladores e um sistema de controle de vibração. Time-lapsos e z-stacks são, então, realizada ao longo de várias horas e ferramentas farmacológicas ou moléculas bioativas podem ser adicionados ou entregues no meio de incubação. Este método também poderia ser usado para estudar a migração dos outros tipos de neurónios no cérebro cerebelo ou em diferentes estágios de desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACAP38</td>
			<td>INRS, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Bourgault et al., 200919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAI-1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td>
			<td>O973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Transwell-Clear inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 35 mm diameter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100 mm diameter</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylen tube (15 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0800DF/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological safety cabinet fume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MSC9 Class II A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adjustable-volume pipette (0,5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gyro-rocker, SSL3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, Hera Cell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal macroscope, TCS LSI</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, M205 C</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors, curved, blunt/blunt</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>03.03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>149090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 and #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11293-00 and 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome injector blades/single edge</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard scalpel handle #3 solid</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade #15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of postnatal cerebellar granule cell migration using confocal macroscopy

Durante o desenvolvimento pós-natal, células granulares imaturos (interneurónios excitatórios) exibem migração tangencial na camada granular externa, e, em seguida, a migração radial na camada molecular e a camada de células de Purkinje para alcançar a camada granular interna do córtex cerebelar. Padrão em processos migratórios induz ou morte celular ou extravio dos neurônios, levando a déficits em diversas funções do cerebelo. Migração de células granulares centrípeta envolve vários mecanismos, tais como a quimiotaxia e a degradação da matriz extracelular, para guiar as células para a sua posição final, mas os factores que regulam a migração celular em cada camada cortical estão apenas parcialmente conhecida. No nosso método, fatias agudas cerebelares são preparadas a partir de ratos P10, células granulares são marcadas com um marcador fluorescente citoplasmática e os tecidos são cultivadas em insertos de membrana de 4 a 10 horas antes de iniciar a monitorização em tempo real da migração das células por macroscópica confocal a 37 ° C nopresença de CO 2. Durante a sua migração nas diferentes camadas corticais do cerebelo, as células granulares podem ser expostas a agonistas ou antagonistas do neuropéptido, inibidores de protease, bloqueadores de efectores intracelulares ou mesmo substâncias tóxicas, tais como o álcool ou metilmercúrio para investigar o seu possível papel na regulação da migração neuronal .

No cerebelo pós-natal precoce, GCs apresentam mudanças significativas no seu modo e velocidade de migração como eles cruzam diferentes camadas corticais 1 (Figura 1). Esta secção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através do estudo de migração de GC no seu meio celular natural. P10 fatias de tecido cerebelar de rato marcada com um corante fluorescente verde são examinadas sob um macroscópio confocal (Figura 3A), onde se mostra que os GC migrar radialmente no ML com uma velocidade média de 18 um / h (Figura 3B, C). Até à data, o papel das interacções / comunicação entre as células neuronais e gliais, incluindo os factores de regulação e os mecanismos moleculares envolvidos no controle da migração celular em cada camada cortical estão em grande parte desconhecida. Consequentemente, a questão principal é identificar os neuropeptídeos, neurotransmissores, neurotrofinas e componentes da matriz extracelular que poderiam desempenhar um papel nestes cortical camada específicafic mudanças de velocidade durante o seu processo de migração. Pituitária adenilato-ciclase de activação (PACAP) é detectada principalmente no PCL, mas também na ML e a IGL durante as primeiras duas semanas pós-natal em roedores 7,10,11. Aplicação de PACAP38 (10 -6 M) ao meio de cultura resultou numa diminuição de 79% da velocidade da GC na ML. Por exemplo, a velocidade de migração dos GCs em ML caiu de 11,9 uM / h em condições de controlo de 2,5 um / h após a administração de PACAP38 (Figura 4A). -Activador do plasminogénio tecidular (tPA) é um membro da cascata proteolítica que leva à degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC), tais como moléculas de adesão celular ou laminina 12,13. tPA e plasminogénio, um substrato de tPA, são detectados em camadas corticais durante o desenvolvimento do cerebelo 14,15,16 pós-natal. A administração de PAI-1 (10 -7 M), um inibidor endógeno de tPA, reduzida em 78% a CGmigração no ML. Por exemplo, os GC reduzida velocidade de migração no ML de 19,2 uM / h em condições de controlo a 4,2 um / h após a adição de PAI-1 (Figura 4B). Estes resultados indicam que o PACAP exerce um efeito inibidor directo sobre os movimentos de GC e que a serina-protease de tPA facilita a migração dos GCs em ML do cerebelo de rato em desenvolvimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figura 1: Representação 3D da migração GC no córtex cerebelar pós-natal. 1-4, Extensão dos processos de GC e migração tangencial no EGL. 5, Radial migração no ML ao longo das fibras gliais Bergmann. 6, fase estacionária Transient no PCL. 7, a migração glial-independente radial na IGL. 8, de Conclusão migração de GC no IGL GC, de células granulares, em vermelho;. EGL, Camada granular externa; B, Bergmann glia, em roxo escuro; G, células de Golgi, em amarelo; cf, escalada fibras, em azul; g, células granulares postmigratory, em verde claro; IGL, camada granular interna; mft, fibras musgosas terminal, em verde escuro; ML, camada molecular; P, células de Purkinje, em roxo luz; camada de células PCL, Purkinje. Este valor foi modificado a partir do 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figura 2: ex vivo cultura de fatias de cerebelo P10 (A) cerebelo de rato dissecado a partir de P10.. Barra de escala = 6 mm. (B) Micrografia de viver 180 um de espessura fatia cerebelar através de estereomicroscopia. Barra de escala = 3 mm. (C) Nouma ampliação mais elevada, as quatro camadas corticais (EGL, ML, PCL, IGL) do cerebelo já são distinguíveis. Escala da barra = 1 mm. (D) Após a marcação fluorescente, fatias de tecido são colocados em inserções de cultura (24 mm de diâmetro) numa placa de 6 poços. (E) Representação esquemática de uma inserção de cultura com membrana de poliéster de cultura de tecidos tratados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figura 3: migração dinâmica de GCs nas camadas corticais de rato P10 cerebelo (A) vista Macroconfocal (xyz, projeção 2D) de uma fatia do cerebelo P10 rato em que os GCs são marcadas com um corante fluorescente do citoplasma verde.. Barra de escala = 75 mm. (B) de imagem Time-lapse que mostra GCmovimentos no ML por macroscopia confocal para 4 horas em condições de controle. Asterisco (*) marca o símbolo soma GC. O tempo decorrido (em min) está indicado na parte inferior de cada fotomicrografia. Escala da barra = 10 m. (C) alterações sequenciais na distância percorrida por GC soma. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figura 4:. Efeito do neuropéptido e de inibidor de protease de migração GC (A) GC foi rastreado no ML macroscópica confocal durante 2 horas em condições de controlo e, em seguida, durante 2 horas, na presença de pituitária adenilato-ciclase de activação (PACAP). (B) A GC foi rastreado no ML macroscópica confocal durante 2 horas em condições de controlo e, em seguida, durante 2 horas na presença de inibidor do activador do plasminogénio-1 (PAI-1).

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Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

9.3K visualizações.  Inserm, IRIB, University of Rouen. During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Vídeo: Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Neurociência

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Rato rombencéfalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para estudar Facial Migração Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

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