This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. إعداد الحلول سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend 5 نانومول من مخلوط (السيطرة) و 5 نانومول من BRCA2 سيرنا الكريات المجففة في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (تركيز سيرنا النهائي: 50 ميكرومتر). هذا هو مخزون سيرنا ويجب تخزينها في -20 درجة مئوية في 10 مكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من 10 ميكرولتر من الأسهم سيرنا وإضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه للحصول على حل العاملة 10 ميكرومتر سيرنا. يجب أن يتم تخزين هذا التخفيف في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ملاحظة: الحل العمل سيرنا لا ينبغي أن تخضع لتجميد / الذوبان أكثر من 3 مرات. </li></ol> 2. البذر من الظهارية الإنسان خطوط الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة النمو من خطوط الخلايا الظهارية الإنسان متنامية مع الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات زراعة الأنسجة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في لوحة واحدة مع RT PBS (10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 100 ملم لوحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل الخلايا من لوحة،إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين / 0.53 ملي EDTA الحل واحتضان 3-5 دقائق اعتمادا على نوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل جمع خلايا منفصلة، ​​تحييد التربسين بإضافة 2 مل من وسط النمو تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 320-330 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وكريات خلية في 5 مل من المضادات الحيوية مجانا المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا تحت المجهر في غرفة Burker أو باستخدام نظام العد الآلي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور الخلايا في 6 لوحات جيدا لتكون حوالي 80٪ متموجة بعد 24 ساعة (0.5-1 X10 6 الخلايا في 2 مل من المتوسط ​​لكل بئر). عدد الخلايا الأمثل ليكون المصنف قد تختلف اعتمادا على خطوط معينة من الخلايا ومعدل النمو. ملاحظة: لا تقم بإضافة المضادات الحيوية على المدى المتوسط ​​عند هذه النقطة لأن المضادات الحيوية سوف تتداخل سلبيا مع كفاءة حوالةction. من المهم جدا أن الخلايا هي في الممرات ثقافة منخفضة (&lt;10) لتحقيق كفاءة عالية من BRCA2 سيرنا ترنسفكأيشن. </li></ol> 3. خلايا Transfect مع سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أربع وعشرين ساعة طلاء الخلايا، المضي قدما في الجولة الأولى من ترنسفكأيشن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 6 ميكرولتر من الدهون على أساس 10 سيرنا كاشف ترنسفكأيشن محدد في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 3 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (30 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين سيرنا المخفف مع كاشف ترنسفكأيشن المخفف واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة، وإزالة المتوسطة من الخلايا وإضافة 2 مل من متوسطة جديدة قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية (من دون مضادات حيوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من المجمعات كاشف سيرنا ترنسفكأيشن إلى الخلايا (هذا المبلغ هو بئر واحدة من لوحة 6 أيضا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 3776؛ C مع 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، المضي قدما في الدور الثاني من ترنسفكأيشن بتكرار الخطوات 3.1.1-3.1.5 مع التعديلات التالية لخطوة 3.1.2: تمييع 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (50 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 1-2 أيام عند 37 درجة مئوية قبل التحليل. ملاحظة: جولتان من transfections واستخدام نسبة عالية كاشف سيرنا / ترنسفكأيشن في الجولة الثانية ضرورية للحصول على كفاءة عالية من BRCA2 إسكات. </li></ol></li></ol> 4. الخلايا ليز لتحليل immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحلل جديدة مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 1٪ من غير أيوني، غير تغيير طبيعة المنظفات octylphenoxypolyethoxyethanol، 5 ملي بيروفسفات الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، و 10 ملي فلوريد الصوديوم، 2 مم phenylmethylsulfonyl الفلوريد، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين. يبقيه على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسطة من الخلايا وثرماد لهم مرة واحدة مع PBS الباردة (2 مل / جيد) في لوحة. لمنع أي المرحل PBS، إزالة ذلك من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل جانب. ملاحظة: إذا كانت الخلايا يجب أن تستخدم أيضا لفحوصات أخرى، يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2،1-2،6 وresuspend الخلايا غير مناسب العازلة / متوسطة وفقا للتطبيق لاستخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناوب بلطف لوحة لتوزيع موحد للتحلل العازلة واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية على محور دوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المحللة خلية في أنبوب microcentrifuge على الجليد باستخدام مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 17900 x ج لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> تحليل immunoblotting 5. BRCA2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزن المؤقت تشغيل عن طريق تمييع 50 مل من 20X تريس، خلات SDS تشغيل بuffer (50 ملي Tricine، 50 ملي تريس قاعدة، 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.24) مع 950 مل من الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير العينة على النحو التالي: إضافة 15 ميكروغرام من إجمالي المحللة الخلية، 5 ميكرولتر من 4X عينة العازلة التي تحتوي على ليثيوم دوديسيل كبريتات في الرقم الهيدروجيني 8.4، 2 ميكرولتر من 10X عينة الحد من وكيل (0.5 M DTT)، وتحلل العازلة إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول الكشف عن BRCA2 في خطوط الخلايا العادية أيضا عند استخدام كمية أقل من البروتين الكلي (وصولا الى 5 ميكروغرام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد العينات عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: ومن الأهمية بمكان استخدام 55 ° C. منذ البروتين BRCA2 هو حساس للحرارة 11 ودرجات الحرارة أعلى تغيير طبيعة يسبب خسارة ثابتة للسليما كامل طول (390 كيلو دالتون) البروتين BRCA2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة الكهربي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينات و 10 ميكرولتر من ارتفاع الوزن الجزيئي قبل الملطخة البروتين القياسية على هلام precasted (تريس، خلات 3-8٪) وتعمل في 120 V لABخارج 2 ساعة 12. إيقاف تشغيل الكهربي قبل يترك 55 كيلو دالتون علامة زرقاء هلام precasted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزن المؤقت نقل مع 50 مل من 20x ونقل العازلة، 100 مل من الميثانول بنسبة 100٪ و 850 مل من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط الغشاء PVDF (0.45 ميكرون حجم المسام) عن طريق نقع في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق ثم يشطف بالماء المقطر وتتوازن في المخزن نقل على الأقل لمدة 5 دقائق. نقع الإسفنج لجهاز نقل في المخزن نقل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما المدى الكهربي هو أكثر، وتجميع شطيرة في كومة نقل بالترتيب التالي (من أسفل إلى أعلى): ثلاثة الإسفنج مشبعة في المخزن نقل، 3MM واحد ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، وهلام، غشاء PVDF تفعيلها، واحدة 3MM ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، ثلاثة الإسفنج مشبعة في نقل العازلة 13،14. وضع كومة في جهاز ونقل البروتينات في 350 مللي أمبير لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 180 مللي أمبير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يجري BRCA2 بروتين كبير جدا، لا بد من تمديد الوقت نقل من 1 ساعة (كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ومعظم بروتوكولات نقل) إلى 4 ساعات أو طوال الليل لضمان نقل كامل من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى وقت طويل نقل، فمن الضروري لأداء النشاف في غرفة باردة في 4 درجات مئوية للحد من ارتفاع درجة الحرارة وتسهيل تفكيك شطيرة. أنظمة نقل شبه الجافة ليست جيدة لنقل البروتينات الكبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل، ويغسل الغشاء مع TBS، منعه لمدة 1 ساعة على RT في TBS-توين 0.25٪ (TBS-T) التي تحتوي على 5٪ غير دهن الحليب الجاف والتحقيق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 30 ميكرولتر مكافحة BRCA2 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ( 200 ميكروغرام / مل)، مخففة في 9 مل TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف [1: 300 (V / V) التخفيف]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T، ثم احتضان مرشح لمدة 1 ساعة مع 1 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية مخففة في 10 مل من TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف. بعد ذلك، ويغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مناعي من قبل ECL للكشف عن البروتين BRCA2 باستخدام تعزيز التوهج (ECL) الغربية التنشيف كشف الكاشف، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تصور العصابات immunochemiluminescent على ارتفاع القرار الأفلام ECL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مناعي مع الأجسام المضادة للجين التدبير المنزلي، مثل β تويولين (55 كيلو دالتون)، على مرشح واحد عن السيطرة التحميل باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى β تويولين المخفف في 1: 1000 (10 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة تويولين في 10 مل TBS-T + 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم) لمدة 1 ساعة على RT. غسل واحتضان الضد الثانوية كما هو موضح BRCA2 (5،10-5،11)، باستثناء استخدام الفجل-البيروكسيديز مترافق مكافحة الفأر بدلا من المضادة للأرنب الضد الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة رقمية للأفلام أعجب مع عصابات immunochemiluminescent وتحليل كثافة الفرقة التي كتبها صورة مخصصة برامج التحليل (على سبيل المثال.، يماغيج). </li></ol>

<ol>
	<li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2:+a+universal+recombinase+regulator.">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li><li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair,+transcription,+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage.">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li><li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic.">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li><li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer.">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li><li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients.">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li><li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2.">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82 (2013).</li><li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma.">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li><li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death.">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li><li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems:+pharmaceutical+perspectives.">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA2:+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression.">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Western+blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer.">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li><li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2.">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li><li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+the+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer.">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li><li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction.">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بسبب الطفرات سلالة الجرثومية من الرصاص BRCA2 الجينات إلى زيادة خطر عدة أنواع من السرطان، بما في ذلك الذكور والإناث سرطان الثدي وسرطان المبيض وسرطان البروستاتا، وسرطان البنكرياس، وسرطان الجلد 3،4، وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم الوظيفة البيولوجية من البر...

بترميز الجين BRCA2 (سرطان الثدي قابلية الجينات 2) لبروتين القامع الورم الذي يلعب دورا حاسما في إصلاح DNA فواصل مزدوج الجديلة من خلال تنظيم وظيفة الانزيم recombinase Rad51 1. كما تم المتورطين BRCA2 في التشكيل النسخ والسيطرة في الخلية دورة 2. الطفرات سلالة الجرثومية في الجين BRCA2 تحفز الحساسية جسمية مهيمنة لسرطان الثدي وسرطان المبيض لدى النساء وسرطان البروستاتا لدى الرجال، فضلا عن الاستعداد لأنواع السرطان الأخرى 3،4. ومع ذلك، على الرغم من زيادة خطر في الاصابة بسرطان، والطفرات BRCA2 التي تقمع أو الحد من وظيفة BRCA2 قد تجعل الخلايا السرطانية أكثر عرضة لعوامل العلاج الكيميائي الذي يسبب التلف في الحمض النووي 07/05. السرطان متفرقة يحمل انخفاض معدل الطفرات BRCA2 (&lt;3٪) على الرغم من انخفاض مستويات البروتين BRCA2 قد تم الكشف عنها في بعض أنواع السرطان، مما يشير إلى أن البروتين BRCA2قد يتم فقدان أثناء تكون الأورام في أمراض السرطان متفرقة خلال آليات غير طفري ​​التي تعتمد على 7،8. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم بشكل كامل وظائف BRCA2 في سياق بيولوجيا السرطان وكذلك في إعدادات البيولوجية الأخرى. أداة قوية تستخدم لتحديد وظائف جديدة من الجينات في خلايا الثدييات هي لإسكات تعبيرها. وكمثال على ذلك، فقد أدت إسكات التعبير BRCA2 في مجموعة متنوعة من الخلايا الظهارية الطبيعية مؤخرا إلى تحديد وظيفة جديدة للBRCA2 كمنظم للمقاومة anoikis، خطوة هامة خلال الاستحواذ على الخلايا السرطانية الغازية والمتنقل قدرة 9. لا يمكن أن يتحقق الجينات إسكات عن طريق إدخال في الخلايا إما صغير التدخل (سي) RNA أو دبوس الشعر القصير (ش) جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف جين معين. رجولية عالية من سيرنا وسهولة الاستخدام جعله أداة تفضيلية لإسكات التجارب التي تهدف إلى اكتساب رؤى جديدة في العمليات البيولوجية الهامة لالثانية لتحديد أهداف علاجية جديدة. ومع ذلك، ضربة قاضية كفاءة في التعبير الجيني قد لا تكون قابلة للتحقيق بسهولة لجميع الجينات وربما يكون متغير بدرجة كبيرة اعتمادا على نوع من الخلايا. بسبب انخفاض في مستويات البروتين داخل الخلايا هو النمط الظاهري الأكثر ملاءمة قيد التحقيق، لا بد من تحديد إسكات الجينات التي immunoblotting تحليل للمنتج الجين. مع هذا الصدد، يقدم البروتين BRCA2 تحديا آخر: كونه بروتين كبير (حوالي 390 كيلو دالتون)، والصعوبات التقنية موجودة لتحليل الكيمياء الحيوية التقليدية، بما في ذلك immunoblotting. نحن هنا التقرير بروتوكول الأمثل لإسكات الفعال للBRCA2 في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان وللكشف السريع والناجح من البروتين BRCA2 ضربة قاضية من قبل immunoblotting التحليل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRCA2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-003462-00</td>
			<td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctrl siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>&#160;D-001810-10-05</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Medium for transfection procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EA0378</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Reagent for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiMark Pre-stained protein standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5699</td>
			<td>Prestained marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLoc Mini-Cell&#160; System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LA0041</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8326</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4026-100UL</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>70166</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Pierce Thermo Scientific</td>
			<td>34080/34096</td>
			<td>Chemiluminescence system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT1A cells</td>
			<td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td>
			<td>95012614</td>
			<td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nthy cells</td>
			<td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td>
			<td>90011609</td>
			<td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11465007001</td>
			<td>Kit for cell proliferation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

إسكات الكابتة للورم البروتين BRCA2 وكشف من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية التقليدية تمثل تحديا تقنيا كبيرا نظرا لحجم كبير من البروتين البشري BRCA2 (حوالي 390 كيلو دالتون). نفيدكم التعديلات ترنسفكأيشن وimmunoblotting بروتوكولات سيرنا القياسية لإسكات BRCA2 البشري وكشف الذاتية البروتين BRCA2، على التوالي، في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان. وتشمل الخطوات الرئيسية لسيرنا ارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لواثنين من الجولات اللاحقة من سيرنا ترنسفكأيشن داخل نفس التجربة. باستخدام هذه وغيرها من التعديلات على بروتوكول قياسي نحن باستمرار تحقيق أكثر من 70٪ إسكات الجينات BRCA2 البشري كما تقرره immunoblotting التحليل مع أضداد BRCA2. بالإضافة إلى ذلك، تمسخ من الخلية لست] في 55 ° C بدلا من التقليدية 70-100 ° C والتحسينات التقنية الأخرى من الإجراء immunoblotting السماح الكشف عن البروتين BRCA2 سليمة حتى WHأون كميات قليلة جدا من بدء المواد المتاحة أو عندما تكون مستويات بروتين تعبير BRCA2 منخفضة جدا. إسكات الفعال للBRCA2 في الخلايا البشرية يقدم استراتيجية ثمينة لتعطيل وظيفة BRCA2 في الخلايا مع BRCA2 سليمة، بما في ذلك الخلايا السرطانية، لدراسة المسارات الجزيئية الجديدة والوظائف الخلوية التي قد تتأثر طفرات BRCA2 المسببة للأمراض في الأورام. وينبغي أن يكون التكيف هذا البروتوكول لإسكات وتحليل البروتينات الأخرى كبيرة &quot;مثل BRCA2 كفاءة تحقيقه بسهولة.

قبل الشروع في / الفحص البيولوجي والكيمياء الحيوية لدراسة تأثير BRCA2 إسكات على وظائف الخلية، فإن الخطوة الأولى هي لتأكيد خصوصية إسكات باستخدام سيرنا المخفوق (عدم استهداف سيرنا) جنبا إلى جنب مع BRCA2 سيرنا (الشكل 1A ). من المهم إجراء الجولة الثانية من سيرنا ترن?...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

إسكات<em&gt; BRCA2</em&gt; من التعرف على رواية الوظائف البيولوجية التنظيم BRCA2 في الخلايا البشرية المستزرعة

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K Views.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Video: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

يعيش تصوير الكثيفة الأساسية الحويصلات في الخلايا العصبية الأولية الحصين مثقف

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

التقاط الطيف الكتلي - أداة قوية لتحديد رواية ج-دي-GMP المستجيب البروتينات

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في<em&gt; في المختبر</em&gt; مثقف الإنسان ميوتوبيس الابتدائية

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...