This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. הכן את פתרונות siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 5 nmol של מקושקשת (Ctrl) ו -5 nmol של כדורים מיובשים BRCA2 siRNA במים RNase ללא 100 μl (ריכוז siRNA סופי: 50 מיקרומטר). זהו מניית siRNA וחייבים להיות מאוחסנים ב -20 ° C ב 10 aliquots μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של 10 μl ממניות siRNA ולהוסיף 40 μl מים RNase ללא להשיג הפתרון עובד 10 מיקרומטר siRNA. דילול זה חייב להיות מאוחסן ב -20 ° C עד לשימוש. הערה: הפתרון עובד siRNA לא צריך לעבור הקפאה / פשרה יותר מ 3 פעמים. </li></ol> 2. זריעה של שורות תאי אפיתל האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול משורות תאי אפיתל אדם גדלו כמו monolayers תא בצלחות תרבית רקמת חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בצלחת פעם אחת עם RT PBS (10 מיליליטר של PBS לצלחת 100 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את התאים מהצלחת,להוסיף 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% / 0.53 פתרון mM EDTA ודגירה 3-5 דקות, תלוי בסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף התאים מנותקים, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום גידול מלא המכיל 10% בסרום שור עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב320-330 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור דלי מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא ב5 מיליליטר של מדיום אנטיביוטיקה-חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים תחת מיקרוסקופ בתא &quot;שודד גופות או על ידי שימוש במערכת ספירה אוטומטית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים בצלחות 6-גם להיות מחוברים כ -80% לאחר 24 שעות (0.5-1 x10 6 תאים ב 2 מיליליטר של מדיום לכל טוב). מספר תאים אופטימלי לזרע עשוי להשתנות בהתאם לשורות תאים הספציפיות וקצב הצמיחה. הערה: אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום בשלב זה בגלל אנטיביוטיקה שלילי להפריע ליעילות של transfeסיפורת. זה מאוד חשוב כי התאים במעברים נמוכים תרבות (&lt;10) כדי להשיג יעילות גבוהה של transfection BRCA2 siRNA. </li></ol> 3. תאי Transfect עם siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרים וארבע שעות לאחר ציפוי התאים, להמשיך בסיבוב הראשון של transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס siRNA ספציפי 10 ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 3 μl של 10 מיקרומטר siRNA (30 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את siRNA המדולל עם מגיב transfection המדולל ודגירה של 5-10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להסיר את המדיום מן התאים ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום טרי מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של המתחמים מגיב siRNA-transfection לתאים (סכום זה הוא לטוב אחד של צלחת 6-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בחממה humidified ב 3776; C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להמשיך בסיבוב השני של transfection ידי חזרה על שלבי 3.1.1-3.1.5 עם השינוי הבא לצעד 3.1.2: לדלל 5 μl של 10 מיקרומטר siRNA (50 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 1-2 ימים על 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. הערה: שני סבבים של transfections ושימוש ביחס מגיב siRNA / transfection הגבוה בסיבוב השני הם חיוניים כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2. </li></ol></li></ol> 4. תאי Lyse לניתוח immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה טרי עם PBS (pH 7.4) המכיל 1% מאינם denaturing octylphenoxypolyethoxyethanol nonionic, חומרי הניקוי, pyrophosphate נתרן 5 מ&quot;מ, orthovanadate נתרן 1 מ&quot;מ, פלואוריד נתרן 10 מ&quot;מ, פלואוריד phenylmethylsulfonyl 2 מ&quot;מ, 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin. שמור את זה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום מן התאים וwאפרם פעם אחת עם PBS הקר (2 מיליליטר / טוב) בצלחת. כדי למנוע כל שריד PBS, להסיר אותו לחלוטין מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ תמוגה היטב כל אחד. הערה: אם התאים צריכים לשמש גם למבחנים אחרים, trypsinize התאים כמתואר בשלב 2.1-2.6 וresuspend התאים במאגר / בינוני מתאימים בהתאם ליישום לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסובב את הצלחת להפיץ באופן אחיד מאגר תמוגה ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את lysate התא בצינור microcentrifuge על קרח באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 17900 XG במשך 25 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון זמין מסחרי על פי הוראות היצרן. </li></ol> ניתוח immunoblotting 5. BRCA2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגר פועל על ידי דילול 50 מיליליטר של 20x טריס-אצטט SDS ב פועליםuffer (50 מ&quot;מ tricine, 50 מ&quot;מ טריס בסיס, 0.1% SDS, pH 8.24) עם 950 מיליליטר של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם באופן הבא: להוסיף 15 מיקרוגרם בסך הכל lysate תא, 5 μl של חיץ מדגם 4x מכיל סולפט dodecyl ליתיום ב- pH 8.4, 2 μl 10x מדגם סוכן צמצום (0.5 M DTT) של, ומאגר תמוגה לנפח סופי של 20 μl. הערה: פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של BRCA2 בשורות תאים נורמלים גם בעת שימוש בכמות נמוכה יותר של חלבונים כולל (עד 5 מיקרוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל דגימות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: זה חיוני כדי להשתמש 55 מעלות צלזיוס. מאז חלבון BRCA2 הוא thermosensitive 11, טמפרטורות denaturing גבוהות לגרום לאובדן של באורך מלא בשלמות (390 KDA) חלבון BRCA2 עקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקים את תא electrophoretic לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות ו -10 μl לסטנדרטים של חלבון משקל מולקולרי גבוה מראש צבעונית על ג&#39;ל precasted (טריס-אצטט 3-8%) ולהפעיל ב 120 V לabמתוך 2 שעות 12. לעצור את ריצת electrophoretic לפני הסמן הכחול kDa 55 משאיר את הג&#39;ל precasted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ ההעברה עם 50 מיליליטר של 20x חיץ העברה, של מתנול 100% 100 מיליליטר ו -850 מיליליטר מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קרום PVDF (גודל נקבובית 0.45 מיקרומטר) על ידי השרייה במתנול 100% במשך 5 דקות, לשטוף עם מים מזוקקים ולאזן במאגר העברה לפחות במשך 5 דקות. משרים את ספוגים של מנגנון ההעברה בהעברת חיץ על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר electrophoretic הריצה נגמרה, להרכיב את הכריך בערימת ההעברה בהזמנה (מלמטה למעלה) הבאה: שלושה ספוגים רוויים במאגר העברה, גיליון נייר כיתה 3 מ&quot;מ אחד רווי במאגר העברה, ג&#39;ל, קרום PVDF הופעל, אחד 3 מ&quot;מ גיליון נייר כיתה רווי במאגר העברה, שלושה ספוגים רוויים במאגר העברת 13,14. הנח את המחסנית לתוך חלבוני המנגנון והעברה ב 350 מילי-אמפר לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס או 180 מילי-אמפר הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: להיות BRCA2 חלבון גדול מאוד, זה הוא חיוני כדי להאריך את זמן העברה מהשעה 1 (כפי שהוצע על ידי היצרן ורוב פרוטוקולי העברה) 4 שעות או לילה על מנת להבטיח העברה של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים מלאה. בנוסף, בשל הזמן ארוך העברה, זה הכרחי כדי לבצע את סופג בחדר קר ב 4 ° C כדי למזער התחממות יתר ולהקל פירוק כריך. מערכות העברת חצי יבשות הן לא טובות להעברת חלבונים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברה, לשטוף את הממברנה עם כפות, לחסום אותו במשך שעה 1 ב RT ב0.25% TBS-Tween (TBS-T) המכילה חלב ללא שומן 5% יבשים ובדיקת הלילה ב 4 ° C עם נוגדן הארנב polyclonal 30 μl אנטי-BRCA2 ( 200 מיקרוגרם / מיליליטר), בדילול מלא 9 מיליליטר TBS-T + 5% שומן חלב יבש [1: 300 (V / V) דילול]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T, אז דגירה המסנן עבור שעה 1 עם 1 μl של נוגדן נגד ארנב חזרת peroxidase מצומדות המשני מדולל ב 10 מיליליטר של TBS-T + 5% שומן חלב יבש. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunodetection ידי ECL לחשוף חלבון BRCA2 באמצעות chemiluminescence המשופרת (ECL) מערבית סופג איתור מגיב, הבאים להוראות היצרן. דמיינו להקות immunochemiluminescent בסרטים ברזולוציה גבוהה ECL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunodetection עם נוגדן לגן משק, כמו β-טובולין (55 KDA), באותו המסנן בקרת טעינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים לβ-טובולין בדילול של 1: 1,000 (10 μl של נוגדן אנטי-טובולין ב 10 מיליליטר TBS-T + 5% חלב יבש ללא שומן) במשך שעה 1 ב RT. לשטוף דגירה נוגדנים משני כמתואר עבור BRCA2 (5.10-5.11), פרט לשימוש בחזרת אנטי עכבר peroxidase מצומדות במקום נוגדנים משני נגד ארנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה דיגיטלית של הסרטים הרשימו עם להקות immunochemiluminescent ולנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (לדוגמא., ImageJ). </li></ol>

<ol>
	<li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2:+a+universal+recombinase+regulator.">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li><li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair,+transcription,+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage.">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li><li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic.">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li><li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer.">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li><li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients.">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li><li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2.">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82 (2013).</li><li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma.">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li><li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death.">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li><li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems:+pharmaceutical+perspectives.">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA2:+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression.">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Western+blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer.">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li><li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2.">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li><li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+the+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer.">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li><li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction.">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בגלל מוטציות בתאי מין של עופרת גן BRCA2 לעלייה בסיכון למספר סוגי הסרטן, כוללים סרטן נשי וגברי השד, סרטן השחלות, סרטן הערמונית, סרטן לבלב, ולנומה 3,4, מספר מחקרים נעשו על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של חלבון BRCA2. רוב המחקרים האלה הם בעיקר מבוסס גנטיים בשל קשיים טכ...

גן BRCA2 (רגישות לסרטן שד גן-2) מקודד לחלבון מדכא גידולים שממלא תפקיד מכריע בתיקון הפסקות פעמיים גדיל DNA על ידי המסדיר את התפקוד של אנזים recombinase 1 Rad51. BRCA2 גם היה מעורב באפנון של שעתוק ובבקרת מחזור תא 2. מוטציות בתאי מין בגן BRCA2 לגרום רגישות אוטוזומלית דומיננטית לסרטן שד ושחלות בנשים וסרטן הערמונית אצל גברים, כמו גם נטייה לסוגי סרטן אחרים 3,4. עם זאת, למרות העלייה בסיכון בהתפתחות סרטן, מוטציות BRCA2 המדכאות או להפחית פונקצית BRCA2 עלול להפוך תאים סרטניים פגיעים יותר לתרופות כימותרפיות הגורמות לניזק לדנ&quot;א 5-7. סרטן סדיר להציג שיעור נמוך של מוטציות BRCA2 (&lt;3%) למרות שרמות מופחתות של חלבון BRCA2 של אותרו בכמה סוגי הסרטן, טוען כי חלבון BRCA2עלול ללכת לאיבוד במהלך tumorigenesis בסרטן סדיר באמצעות מנגנונים שאינן מוטציה תלויה 7,8. לכן, חשוב להבין באופן מלא פונקציות BRCA2 בהקשר של ביולוגיה של הסרטן, כמו גם בהגדרות ביולוגיות אחרות. כלי רב עוצמה המשמש לזיהוי פונקציות רומן של גן בתאי יונקים הוא להשתיק את ביטויה. כדוגמא, ביטוי BRCA2 השתקה במגוון רחב של תאי האפיתל נורמלים הוביל לאחרונה לזיהוי של תפקוד רומן של BRCA2 כרגולטור של התנגדות anoikis, צעד חשוב ברכישה של תאים סרטניים יכולת פולשנית וגרורתי 9. השתקת גנים יכולה להיות מושגת על ידי החדרת בתאים או RNA הקטן מפריע (si) או מולקולות RNA סיכה קצרה (SH) מיקוד הגן הספציפי. העוצמה הגבוהה של siRNA וקלות שימוש להפוך אותו לכלי המועדף להשתקת ניסויים שמטרתם תובנה חדשות תהליכים ביולוגיים קריטייםND לזהות מטרות טיפוליות חדשניות. עם זאת, מציאה יעילה של ביטוי גנים לא יכולה להיות ברת השגה בקלות לכל הגנים ויכולה להיות מאוד משתנה בהתאם לסוג התא. בגלל ירידה ברמות חלבון תאיות הוא הפנוטיפ הרלוונטי ביותר בחקירה, חשוב לכמת השתקת גנים על ידי immunoblotting ניתוח של מוצר הגן. עם כל כבוד זה, חלבון BRCA2 מציב אתגר נוסף: להיות חלבון גדול (כ 390 KDA), קשיים טכניים קיימים לאנליזה ביוכימית קונבנציונלית, כוללים immunoblotting. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מותאם להשתקה יעילה של BRCA2 בשורות תאי אפיתל אדם ולזיהוי מהיר ומוצלח חלבון BRCA2 מציאה ידי immunoblotting ניתוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BRCA2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-003462-00</td>
			<td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctrl siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>&#160;D-001810-10-05</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Medium for transfection procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EA0378</td>
			<td>Gel for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>Reagent for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>Reagent for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Reagent for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiMark Pre-stained protein standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5699</td>
			<td>Prestained marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLoc Mini-Cell&#160; System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0002</td>
			<td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LA0041</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8326</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4026-100UL</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>70166</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Reagent for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Pierce Thermo Scientific</td>
			<td>34080/34096</td>
			<td>Chemiluminescence system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT1A cells</td>
			<td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td>
			<td>95012614</td>
			<td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nthy cells</td>
			<td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td>
			<td>90011609</td>
			<td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11465007001</td>
			<td>Kit for cell proliferation assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

השתקה של BRCA2 החלבון המדכא הסרטן וגילויה על ידי ניתוח ביוכימי קונבנציונלי מהווה אתגר טכני גדול בגלל הגודל הגדול של חלבון BRCA2 האנושי (כ 390 KDA). אנו מדווחים שינויים של פרוטוקולי transfection וimmunoblotting siRNA סטנדרטיים להשתיק BRCA2 האנושי ולזהות חלבון אנדוגני BRCA2, בהתאמה, בשורות תאי אפיתל אנושיות. צעדים עיקריים כוללים siRNA גבוה יחס מגיב transfection ושני סיבובים הבאים של transfection siRNA בתוך אותו הניסוי. באמצעות שינויים אלה ואחרים לפרוטוקול הסטנדרטי באופן עקבי להשיג השתקה יותר מ -70% מגן BRCA2 האנושי כמו להישפט על ידי immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד BRCA2. בנוסף, denaturation של lysates התא ב 55 מעלות צלזיוס במקום C הקונבנציונלי 70-100 מעלות ואופטימיזציות טכניות אחרות של הליך immunoblotting לאפשר זיהוי חלבון BRCA2 שלם של אפילו ש&quot;שen סכומים נמוכים מאוד של חומר מוצא זמינים או כאשר רמות ביטוי חלבון BRCA2 הן נמוכות מאוד. השתקה יעילה של BRCA2 בתאים אנושיים מציעה אסטרטגיה יקרה להפריע לפעילות של BRCA2 בתאים עם BRCA2 שלם, כוללים תאים סרטניים, לבחון מסלולים מולקולריים חדשים ותפקודים תאיים שעלולים להיות מושפע על ידי מוטציות BRCA2 פתוגניים בגידולים. העיבוד של פרוטוקול זה להשתקה וניתוח של חלבונים אחרים &#39;גדולים&#39; כמו BRCA2 יעילים צריך להיות בר השגה בקלות.

לפני שתמשיך עם assay ביולוגי / ביוכימי לבחון את ההשפעה של השתקת BRCA2 על פונקציות תא, הצעד הראשון הוא לאשר את הספציפיות של ההשתקה באמצעות siRNA מקושקשת (ללא מיקוד siRNA) זה לצד זה עם BRCA2 siRNA (איור 1 א ). חשוב לבצע סיבוב של transfection siRNA שני עם יחס גבוה siRNA / transfection כדי לקבל י?...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K Views.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Video: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...