This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن بروتين الاهتمام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام من خلال إضافة FCS المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى المتاحة تجاريا Dulbecco&#39;s التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع GlutaMAX-I، البيروفات، و 4.5 جم / L D-الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا HEK293 في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. دون زراعة الخلايا كل يوم الثالث على التوالي. إزالة وسائل الإعلام وresuspend الخلايا في 15 مل وسائل الإعلام الجديدة. ماصة 1 مل في الجديدة 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة وإضافة 14 مل سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور خلايا HEK293 في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن استخدام بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن. Transfect الخلايا مع pEGFP-C2 أو pEGFP-C2-CaeB باستخدام كاشف ترنسفكأيشن. قبل استخدامها، الاحماء reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة وسائل الإعلام اللازمة لRT. استخدام 3: 1 نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لDNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التفاصيل، ماصة 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مباشرة في 50 ميكرولتر من المصل خالية DMEM المتوسطة. لتكوين معقد، ماصة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي ترميز GFP أو GFP-CaeB إلى ترنسفكأيشن التي تحتوي على كاشف الخليط واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect الخلايا عن طريق إضافة خليط التفاعل بطريقة الإفلات من الحكمة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ لمدة 24 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ملغ / مل geneticin لاختيار من الحيوانات المستنسخة GFP إيجابية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 6 أيام، عزل الخلايا وحيدة عن طريق التدفق الخلوي والفرز في لوحة 96-جيدا إيواء المتوسطة وHEK293 طاف في نسبة 1: 1. توليد HEK293 طاف من الخلايا متموجة HEK293 مثقف أن تم طرد لمدة 15 دقيقة في 4966 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تحل محل الثقافة المتوسطة مع المتوسط ​​تحتوي على 1.50؛ ملغ / مل geneticin. تغيير وسائل الإعلام مرة واحدة في الأسبوع. إذا كانت الخلايا شكل أحادي الطبقة متموجة، نقلها إلى لوحة 24-جيدا. دون زراعة الخلايا مرتين في الأسبوع في نسبة 1: 5 في وسائل الإعلام التي تحتوي على 1.5 ملغ / مل geneticin. أخيرا، وتحليل نسبة الخلايا GFP إيجابية من خلال تحليل طخة مناعية والتدفق الخلوي. </li></ol> تحليل 2. من خطوط الخلايا مستقرة خلال تحليل طخة مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ما يقرب من 4 × 10 4 خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 4 ميكرولتر من مكافحة GFP الأضداد في 4 مل من MPT واحتضان الأغشية O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية في 4 مل من MPT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 2.6) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين. </li></ol> 3. تحليل الخلايا باستخدام عداد الكريات التدفق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني. استخدام الخلايا HEK293 كما سيطرة سلبية لضبط الشوري الأمامatter (FSC) والجانب مبعثر (SSC) بحيث الخلايا هي على نطاق واسع. رسم بوابة على الخلايا الحية من خلال استبعاد الحلل خلية، وحدات العمل والحطام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط أنبوب مضخم (PMT) مكاسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني للقناة FL1 (488 نانومتر الأرجون ليزر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل كثافة مضان من HEK293-GFP وHEK293-GFP-CaeB خلايا فتح الرسم البياني للقناة FL1 والحصول على 10000 الأحداث على السكان بوابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام FACS التجارية برامج التحليل. </li></ol> 4. ترنسفكأيشن من مستقر خط الخلية مع محرض نظام ناقلات التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور خلايا HEK293 يعبرون عن ثابت GFP أو GFP-CaeB في لوحة ال 12 أيضا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 خلايا / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 19 ساعة بعد البذر، وشارك في transfect الخلايا مع البلازميد منظم والبلازميد استجابة إما ترميز باكس أو كاسباس تنشيط 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في transfect الخلايا HEK293 مستقرةمع 100 نانوغرام من pWHE125-P منظم البلازميد (الشكل 2) و 100 نانوغرام من البلازميدات استجابة pWHE655-hBax أو pWHE655-revCasp3 (الشكل 3) و 0.4 ميكرولتر من polyethylenimine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA وpolyethylenimine ترنسفكأيشن كاشف كل في 75 ميكرولتر من غروب MEM المتوسطة واحتضان لمدة 5 دقائق بالضبط في RT. لتكوين معقد، واحتضان كل من الخلائط معا لمدة 15 دقيقة في RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة polyethylenimine / DNA حل قطرة من الحكمة إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. </li></ol> 5. استحثاث موت الخلايا المبرمج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لحث التعبير من البروتينات الموالية لأفكارك طريق إضافة 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين لثقافة المتوسط. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. </li></ol> تحليل 6. من الخلية المضيفة موت الخلايا المبرمج من قبل تحليل طخة مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد الخلايا قبل ساعةarvesting تحت المجهر الضوئي للتحقق من تحريض موت الخلايا. الخلايا أفكارك هي اكتشافها من خلال وجود هيئات أفكارك في الخلايا المحيطة بها الموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وغسل الخلايا انضمت مرة واحدة مع PBS الدافئ. resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ما يقرب من 4 × 10 4 خلايا لكل عينة على 12٪ هلام SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، حمولة 6 ميكرولتر من سلم البروتين التجاري باعتباره الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل المواد الهلامية في نظام الكهربائي للهلام في إطار الجهد المستمر من 180 V لل45-60 دقيقة مع 1X Laemmli عازلة على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات وصمة عار على الأغشية PVDF (حجم المسام 0.45 ميكرون) في الجهد المستمر من 16 V لمدة 60 دقيقة باستخدام ترانس وصمة عار SD نقل خلية شبه الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأغشية كتلة في 10 مل من 5٪ غير دهن الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني / 0.05٪ توين 20 (MPT) لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 4 μل المضادة للالمشقوق بولي البلمرة ADP-ريبوز (PARP) الأجسام المضادة في 4 مل من MPT واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ ثلاث خطوات الغسيل 10 دقيقة مع 10 مل من PBS / توين 20 بنسبة 0.05٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 4 مل MPT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7) وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة ملزمة 30 دقيقة حضانة في RT مع 7 مل البقعة الغربية تجريد العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة يغسل مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7)، تحقيق الأغشية مع 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة الأكتين في 4 مل من MPT O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاث خطوات غسل MPT (كما هو موضح في 6.7)، واحتضان الأغشية مع 0.8 ميكرولتر من حوالأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق rseradish الثانوية مخففة في 4 مل من MPT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة حضانة في RT، وغسل الأغشية ثلاث مرات مع PBS / 0.05٪ توين 20 (كما هو موضح في 6.7 وكشف الفجل النشاط البيروكسيداز مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تطبيق التجهيزات القياسية للتنمية فيلم لتصور العصابات البروتين. ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات الحضانة على شاكر لوحة للمرة المشار إليه ودرجة الحرارة. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض تؤوي أنظمة إفراز لإفراز أو نقل من البروتينات المستجيب البكتيرية إلى داخل الخلية المضيفة. هذه البروتينات المستجيب لديها القدرة على تعديل العمليات ومسارات في الخلية المضيفة، مما يسمح للبكتيريا من أجل البقاء وتكرار داخل مكان...

الفوعة للعوامل الممرضة سلبية الغرام البكتيرية تعتمد على أنظمة إفراز المتخصصة لخطف الخلايا المضيفة حقيقية النواة. البكتيريا تستخدم هذه النظم إفراز لحقن البروتينات الفوعة البكتيرية (المؤثرات) في الخلية المضيفة لتعديل مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية والكيمياء الحيوية. قدمت دراسة البروتينات المستجيب ليس فقط نظرة ملحوظة في الجوانب الأساسية للمضيف / التفاعلات الممرض ولكن أيضا في البيولوجيا الأساسية للخلايا حقيقية النواة 1. وقد تبين أن التشكيل من موت الخلايا المبرمج الخلية المضيفة أن تكون آلية الفوعة هامة لكثير من الكائنات الممرضة داخل الخلايا، كما تم تحديد عدد من البروتينات المستجيب تحوير الخلايا 2-9. ومع ذلك، آلياتها الجزيئية دقيقة من النشاط لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات. موت الخلايا المبرمج، وهو شكل من موت الخلية المبرمج، يلعب دورا هاما في الاستجابة المناعية للإصابة 10. مسارين الرئيسية المؤدية إلى موت الخلايا المبرمج لهاتم تحديد: استهداف الميتوكوندريا (موت الخلايا المبرمج الجوهرية) أو تنبيغ المباشر للإشارة عن طريق مستقبلات موت الخلايا في الغشاء البلازمي (موت الخلايا المبرمج خارجي). يتم تشغيل مسار موت الخلايا الذاتية أو بوساطة الميتوكوندريا بواسطة إشارات بين الخلايا وتتضمن تفعيل باكس وباك، وهما عضوان الموالية لأفكارك من عائلة بي سي إل 2. وتتكون هذه العائلة من البروتينات منظم المؤيدة والمضادة للأفكارك التي تتحكم في موت الخلايا 11-14. تفعيل الخلايا يؤدي إلى oligomerization من باكس وباك تليها permeabilization لاحق من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما أدى إلى الإفراج السيتوكروم C إلى السيتوبلازم. الإفراج السيتوكروم C يبدأ تفعيل caspases المستجيب 3 و 7 من خلال تفعيل كاسباس 9 في apoptosome 15. وهذا يؤدي إلى التحلل البروتيني من ركائز مختارة، من بين أمور أخرى، يؤدي إلى تعرض فسفاتيديل على سطح الخلية 16 و يحرر الدناز مخصص أن شظايا الفصلromatin 17،18. من أجل تحديد مكان ضمن سلسلة أفكارك بروتين المستجيب الفردية يتدخل، كان يعمل بنظام التعبير محرض 19. وكانت الأجهزة التنظيمية للتعبير مشروط من الجينات المحورة أداة لا تقدر بثمن في تحليل وظيفة البروتين داخل الخلية أو أهميتها بالنسبة للأنسجة، جهاز والتنمية الكائن الحي، وكذلك أثناء بدء والتقدم والحفاظ على المرض 20-23. عادة، ونظم التحكم محرض، مثل نظام تيت 24 يعملون هنا، تشكل وحدة النسخ الاصطناعية (انظر الشكل 1). عنصر واحد هو عامل النسخ هندسيا بشكل مصطنع دعا نقل واكتساب التكنولوجيا (التي تعتمد على التتراسيكلين النسخ المنشط)، التي شكلتها انصهار النسخ كاظمة البكتيرية TetR 25 إلى مجال البروتين الثدييات التي تتوسط تفعيل النسخي أو إسكات 24،26. العنصر الثاني هو هجينالمروج، ووصف TRE (عنصر التتراسيكلين استجابة)، التي تتألف من الحد الأدنى من المروج حقيقية النواة، التي تحتوي على ما لا يقل عن TATA مربع وموقع بدء النسخ، وانضم إلى تكرار متعددة من موقع ملزم DNA وما شابه ذلك لTetR، TETO 24،25. العنصر الثالث هو يجند الطبيعي للTetR، التتراسيكلين أو أحد مشتقاته، مثل anhydrotetracycline أو دوكسي 25. على يجند بالإضافة إلى مستنبت، TetR يفقد تقارب من أجل تيتو وتنأى عن TRE. ونتيجة لذلك، يتم إلغاء نسخ من الجين المستهدف. التعبير التحوير يمكن، بالتالي، أن تسيطر بإحكام بطريقة الزمنية وتعتمد على الجرعة في كل من زراعة الخلايا والحيوانات 20،23،24. مع نقل واكتساب التكنولوجيا، يحدث التحوير التعبير بشكل جوهري، إلا في وجود التتراسيكلين. هذا يمكن أن يكون العيب في دراسة السامة للخلايا أو أنكجنيك البروتينات لأن التتراسيكلين أولا أن يتم إزالتها من النظام، قبل التحوير expressioن يحدث ويمكن رصد آثار البروتين المستهدف على الخلية. هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت وليس دائما كاملة، خصوصا في الحيوانات المعدلة وراثيا 27. لمعالجة هذا القيد، تم استخدام متحولة TetR مع استجابة عكسية لوجود الدوكسيسيكلين لتوليد عامل النسخ الجديدة، rtTA (عكس TTA) 28. فإنه يلزم فقط لتري، وبصورة متزامنة، وينشط النسخ في وجود دوكسي. التسرب المتبقية للنظام، أي، التعبير التحوير في غياب عامل النسخ متجهة الى TRE، منشؤها إما (ط) من آثار الموقف في موقع التكامل الجيني، (ب) من TRE نفسها 29، أو (ج) من غير -specific ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا / rtTA 28، وقد وجهت عن طريق إدخال كاتم الصوت النسخي إضافية، ووصف تحويل النص إلى كلام (التي تعتمد على التتراسيكلين كاتم الصوت النسخي) 30 إلى النظام. أنها تشكل شبكة تنظيمية مزدوجة مع rtTA (انظر الشكل 1).في غياب الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام بربط TRE والعمل بنشاط على إيقاف أي النسخ المتبقية. في ظل وجود الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام تنأى عن TRE وrtTA بربط حمل في وقت واحد التعبير عن الجينات المستهدفة. هذه طبقة إضافية من الصرامة ضرورية في كثير من الأحيان للتعبير عن البروتينات السامة للخلايا نشطة للغاية 31-34. باستخدام هذا النظام المزدوج المنظم لرقابة مشددة، ويمكن البدء في سلسلة أفكارك في خطوة محددة تسمح بتحليل ما إذا كان البروتين المستجيب معينة يمكن أن تتداخل مع الخلايا الاستقراء. لا يمكن استخدام هذا الأسلوب فقط لدراسة النشاط المضادة للأفكارك البروتينات المستجيب البكتيرية ولكن أيضا للتعبير عن محرض من البروتينات الموالية لأفكارك أو السامة أو لتشريح التدخل في مسارات إشارات أخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

تقنية المعروضة هنا يسمح احد لتحليل في الخطوة التي بروتين الهدف، أو بدلا من ذلك جزيء صغير، تتفاعل مع مكونات مسار الإشارات. وتستند هذه الطريقة، من جهة، على التعبير عن محرض من بروتين معين لبدء الحدث الإشارات في خطوة محددة ومقررة مسبقا في شلال يشير المحدد. التعبير يصاحب ذلك، من ناحية أخرى، من الجينات في المصالح ثم يسمح للمحقق لتقييم ما إذا كان النشاط من البروتين المستهدف أعرب يقع المنبع أو المصب لهذا الحدث مما يشير بدأت، اعتمادا على قراءات من مسار الإشارات التي يتم الحصول عليها. هنا، تم اختيار سلسلة أفكارك كمسار إشارات محددة لإثبات وظائف البروتوكول. البكتيريا المسببة للأمراض، مثل الكوكسيلا البورنيتية، نقل من البروتينات المستجيب التي تتداخل مع الحث موت الخلايا المضيفة في الخلية المضيفة لضمان بقاء البكتيريا في الخلية وللترويج لنشر في الكائن الحي. وC. بروتين المستجيب البورنيتية CaeB يمنع بشكل فعال موت الخلايا المضيفة بعد استحثاث موت الخلايا المبرمج مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو مع staurosporine. لتضييق على الخطوة التي CaeB يتداخل مع انتشار الإشارة أفكارك، وأعرب عن البروتينات المحددة مع جيدا اتسم بالنشاط المساعد على أفكارك عابر بطريقة الدوكسيسيكلين محرض. إذا يعمل CaeB المنبع من هذه البروتينات، وموت الخلايا المبرمج المضي قدما دون عوائق. إذا يعمل CaeB المصب، سيتم تحول دون موت الخلايا. كانت البروتينات الاختبار المختارة باكس، الذي يعمل على مستوى الميتوكوندريا، وكاسباس 3، وهو الأنزيم البروتيني الجلاد كبير. CaeB يتداخل مع موت الخلايا الناجم عن باكس التعبير، ولكن ليس عن طريق كاسباس 3 التعبير. CaeB، وبالتالي يتفاعل مع تتالي أفكارك بين هذه البروتينات اثنين.

أولا، تم إنشاء خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت وبروتين من الفائدة (CaeB) كما بروتين GFP الانصهار. كعنصر تحكم، قد تولدت أيضا خطوط الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت GFP. تم التحقق من التعبير عن GFP وGFP-CaeB عن طريق تحليل طخة مناعية. لطخة مناعية ممثل (الشكل 4A) يوضح التعبير مستقر...

Watch this Scientific Journal Video about Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling at JoVE.com

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Views.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Video: Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

تربية وحقن<em&gt; ماندوكا سيكستا</em&gt; اليرقات لتقييم الفوعة البكتيرية

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

التالية في الوقت الحقيقي تأثير العوامل الالتهاب الرئوي الحاد الفوعة في نموذج الفأر الالتهاب الرئوي عن طريق البكتيريا للإضاءة الحيوية

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

في Vivo العدوى مع الأمازون الليشمانيا لتقييم الفش الطفيلي في الفئران

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...