ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM47607، CA163296 وNSF 1334493 لCET. نشكر أعضاء المختبر تيرنر لقراءة نقدية للمخطوطة. استنسخت كل البيانات الواردة في هذا التقرير بإذن من رمر وآخرون. 2014 11.

1. إعداد Durotaxis الدوائر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد احدة 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة، الفارغة التوازن مع أنبوب مخروطي 50 مل. تزن بها حوالي 10 غرام من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 50 مل (الحل هو لزج جدا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل90: 1 الركيزة (الامتثال لل~ 1 كيلو باسكال)، تقسيم الوزن يقاس من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 90 لتحديد المبلغ الصحيح من حل crosslinker الحاجة. إضافة كمية محسوبة من الحل crosslinker PDMS إلى نفس الأنبوب. مثال: 10 جم / 90 = 0.11 غرام. إضافة 0.11 غرام من حل crosslinker PDMS إلى حل قاعدة PDMS. كلاهما قدم قاعدة وcrosslinker الحلول في عدة PDMS: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بقوة PDMS خليط قاعدة / crosslinker لمدة 5 دقائق على RT باستخدام ملعقة صغيرة. في هذه المرحلة سوف تحتوي على خليط عدد كبير من فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الركيزة PDMS في جهاز للطرد المركزي الفوق لمدة 5 دقائق في 50 x ج في RT لإزالة صغيريBLES. إذا لا يزال هناك فقاعات بعد 5 دقائق، الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 مل 90: 1 PDMS الركيزة في كل بئر من زراعة الأنسجة المعالجة لوحة 6 جيدا. كل ما تبقى من فقاعات الهواء الموجودة في PDMS يمكن القضاء عليها في هذه المرحلة التي ظهرت عليها باستخدام إبرة 21 G. السماح للPDMS لنشر لمدة 30 دقيقة في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي 12 ملم الزجاج # 1 coverslips في الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر مرتين وتخزين لل coverslips في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد، ساترة المجففة في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة عن طريق لمس بلطف جانب واحد من ساترة في حل PDMS ثم إسقاط ساترة على PDMS. كما يستقر ساترة، وسوف تبدأ PDMS للانقضاض على حواف ساترة، ولكن لن تغطي بالكامل. وهذا يولد التفاعل بين PDMS والزجاج بعد المعالجة (انظر الشكل 1A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 70 درجة مئوية في الفرن لمدة 16 ساعة لعلاج (تصلب) وPDMS. وضع بلاته في غطاء خلية ثقافة والأشعة فوق البنفسجية تعقيم لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: فمن الأفضل أن تجعل من لوحات داخل بضعة أيام من الاستخدام. ومع ذلك، قد تكون ملفوفة لوحات في Parafilm دون أي العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع من دون أي انخفاض ملحوظ في الجودة. </li></ol> 2. خلية التصفيحات ملاحظة: إذا كان دراسة تأثير بوساطة سيرنا ضربة قاضية، نفذ ضربة قاضية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول الأمثل لنوع من الخلايا في الاختيار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف كل durotaxis الغرفة مع 1 مل من 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك، فبرونيكتين يمكن تطبيقها اليوم قبل التحليل التي يحتضنها PDMS مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. تأكد من المغمورة كامل السطح في فبرونيكتين في حل PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير للحرارة التشويه والتحريف 1٪ BSA. تزن 0.5 غرام BSA وحله في 50 مل من برنامج تلفزيوني.فلتر تعقيم الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون والحرارة على 80 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. ملاحظة: يعد هذا الحل اليوم قبل الخلية الطلاء وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح حل فبرونيكتين ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التشويه والتحريف الحرارة BSA في برنامج تلفزيوني على كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويعرض للتريبسين عدد الخلايا في الاختيار بينما الدوائر durotaxis يتم حظر مع الحرارة التشويه والتحريف BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1 × 10 5 الخلايا في حجم 2 مل في كل بئر من غرفة durotaxis، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المطلوبة لنوع خلية معينة في الاختيار. السماح للخلايا الالتزام وتنتشر على الركيزة لمدة 4 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تتم المحافظة على الخلايا U2OS بشكل روتيني في DMEM مع 10٪ FBS، على أن تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 10 وحدة دولية / مل البنسلين، 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين: ملاحظة. ملاحظة: عدد الخلايا المستخدمة في هذا المثال هو الأمثل لخلايا U2OS. قد تكون هناك حاجة الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. هذه الكثافة يعطي الخلايا مساحة كافية للهجرة دون تفاعلات كبيرة مع الخلايا الأخرى. </li></ol> التصوير 3. تعيش خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تصوير الخلايا الحية على مجهر مقلوب، وذلك باستخدام النقيض من المرحلة مع الهدف 10X. ينبغي تركيب المجهر مع، غرفة ترطيب البيئة المغلقة، والسماح السيطرة على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ خلال التصوير على المدى الطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انتشار الخلايا لمدة ما يقرب من 3.5 ساعة، تجميع لوحة في غرفة المجهر. السماح للعينة (ق) للتوازن في الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الآلية، متعددة نقطة الزائر على المجهر إن وجدت. التركيز على واجهة بين 90: 1 PDMS وساترة الزجاج واختيار نقاط لصورة في كل مكان واجهة بمتوسط ​​40 نقطة في durotaxis الغرفة. صورة الخلايا كل 10 دقيقة لمدة تصل إلى 16 ساعة. ملاحظة: إعادةسوف جيون من الفائدة تظهر كما سطرين، مع الخط الخارجي المقابل لحافة ساترة والخط الداخلي المقابلة إلى واجهة الفعلية بين PDMS وساترة. انظر الشكل 1B. </li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد جدول بيانات كما في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد عدد من الأحداث المعبر من PDMS على سطح الزجاج، والعكس بالعكس من كل فيلم ولدت. تسجيل عدد من الأحداث معبر في العمود المناسب في جداول اكسل. ملاحظة: يتم تعريف الحدث المعبر باعتباره نواة الخلية تمر عبر الحدود بين PDMS والزجاج في أي من الاتجاهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد المعابر متعددة، حساب عدد المرات الخلية عبرت الواجهة. يجب تسجيل هذا الرقم في العمود التفوق الموافق الركيزة التي كانت تقع الخلية في نهاية الفيلم. تكرار التحليل لكل خلية التي تعبر واجهة في تيانه الفيلم. استبعاد الخلايا التي تهاجر من مجال الرؤية أثناء التصوير. ملاحظة: من المهم أيضا للتحقق، من قبل خلية العد في بداية التجربة، أن الخلايا قادرة على الالتزام بالتساوي على PDMS المغلفة فبرونيكتين والواجهات الزجاجية ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النسبة المئوية للخلايا التي هاجرت من PDMS على سطح الزجاج (أي خضع durotaxis). إضافة عدد من عبور الأحداث من الصعب على لينة وأحداث معبر المتعددة التي انتهت يوم بجد والقسمة على العدد الإجمالي للأحداث المعبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النسبة المئوية للمعابر متعددة بقسمة عدد من المعابر متعددة من قبل عدد من المعابر. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+cell+migration+by+tugging.">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing.">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li><li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis.">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).</li><li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness.">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li><li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

هنا نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis في الخلايا المهاجرة. A القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو سهولة إعداد غرف durotaxis باستخدام PDMS. صلابة من ركائز يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير نسبة PDMS حل قاعدة لcrosslinker للسماح للدراسة الجمود المختلفة في الفحص. ومع ذلك، واحدة الحد المحت...

وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية ويشابك بما في ذلك الكولاجين، فبرونيكتين و laminin. على الرغم من أنها راسخة بأن ECM يوفر الدعم الهيكلي المهم لأنسجة الخلوية، وهناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تستجيب بشكل فعال للتغيرات الفيزيائية في البيئة ECM لتنظيم العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك بقاء الخلية، التمايز والهجرة الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن الاختلافات في صلابة ECM تدفع الخلايا الجذعية الوسيطة نحو الأنساب مختلفة، مع ركائز لينة (~ 1 كيلو باسكال) تعزيز الأنساب العصبية بينما شديدة (~ 25 كيلو باسكال) ركائز تعزيز التمايز عظمي المنشأ 1. وبالمثل، قد أظهرت زيادة في صلابة انسجة مصفوفة لتعزيز الثدي تكون الأورام الخلايا الظهارية والغزو إلى 2،3 الأنسجة المحيطة بها. مما يثير الاهتمام في هذا mechanosignنتائج النشاط aling في عملية تعرف باسم durotaxis، التي تهاجر الخلايا بشكل تفضيلي نحو الركيزة أكثر جمودا 4،5. الخلايا تستشعر باستمرار الخصائص الفيزيائية للبيئتهم خارج الخلية من خلال إنتغرين مستقبلات ملزمة لECM. وهذا، بدوره، ويشجع على تراكم العديد من البروتينات الهيكلية ويشير إلى المجالات الخاصة بهم حشوية لدفع تشكيل هياكل لاصقة المعروفة باسم التصاقات تنسيق أو اتصالات التنسيق 6،7. منذ integrins ليس لها النشاط الأنزيمي الأصيل، يتم ترحيل الإشارات من ECM من خلال هذه البروتينات التبعي لتنسيق استجابة الخلية لتغيير بيئتهم 8. وفقا لذلك، وتحديد وتوصيف البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم mechanosignaling وdurotaxis هو مجال هام من مجالات التحقيق. وقد تم تطوير نظم نموذج مختلف لدراسة durotaxis في المختبر، ولكن معظم لديهاتستخدم المغلفة الكولاجين ركائز بولي أكريلاميد 4. ومع ذلك، فإن إعداد ركائز بولي أكريلاميد يمكن أن يكون تحديا فنيا ويجب أن يكون الكولاجين المستخدمة في هذه المقايسات crosslinked كيميائيا لالركيزة 9. وقد ثبت Polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز لعرض خصائص ميكانيكية مشابهة لركائز بولي أكريلاميد 10. ومع ذلك، يتم ببساطة عن طريق خلط نسبة من القاعدة إلى crosslinker إعداد ركائز PDMS ويمكن أن تطلى هذه ركائز مع بروتينات ECM دون الحاجة إلى يشابك الكيميائي، مما يجعل PDMS أداة أسهل لدراسة آثار صلابة على سلوك الخلية. هنا، نحن تصف كيفية إعداد غرفة durotaxis بسيطة التي تم دمج PDMS الركيزة لينة مع ساترة الزجاج جامدة. الفحص، على النحو المبين أدناه، يوفر طريقة سريعة وبسيطة لدراسة durotaxis. لهذه الدراسة استخدمنا خلايا عظمية U2OS الإنسان جنبا إلى جنب مع سيرنا بوساطةضربة قاضية من cdGAP لدراسة دور هذا البروتين التصاق التنسيق في durotaxis 11. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. قد تكون بديلا أنواع الخلايا الأخرى للخلايا U2OS ويمكن طرقت أي بروتين أسفل أو overexpressed لتحديد الآثار المترتبة على سلوك الخلية أثناء durotaxis. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لإدراج البروتينات الموسومة fluorescently لتحليل ديناميتها والسلوك باستخدام FRAP أو الحنق النهج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Cover glass 12mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

تكوين والميكانيكية خصائص المصفوفة خارج الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة. هذا الضام سدى النسيج التنوع إلى حد كبير سلوك الخلية الآثار لتنظيم عمليات طبيعية ومرضية بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، التصاق الإشارات والهجرة الاتجاه. في هذا الصدد، والقدرة الفطرية لبعض أنواع الخلايا إلى الهجرة نحو أشد، أو أقل المتوافقة ويشار إلى durotaxis الركيزة المصفوفة. هذه الظاهرة تلعب دورا مهما أثناء التطور الجنيني وإصلاح الجرح وغزو الخلايا السرطانية. هنا، نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis، في المختبر، وذلك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز. إعداد وصف durotaxis غرف يخلق واجهة صلابة بين هلام PDMS لينة نسبيا وساترة الزجاج جامدة. في المثال المقدمة، وقد استخدمنا هذه durotaxis غرف لإثبات دور للcdc42 / RAC1 GTPase تفعيل المتواجدفي، cdGAP، في mechanosensing وdurotaxis التنظيم في خلايا عظمية U2OS الإنسان. هذا الاختبار هو قابلية للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى و / أو ضربة قاضية للبروتينات أخرى من المصالح لاستكشاف دور كل منهما في mechanosignaling وdurotaxis.

ويرد التخطيطي للغرفة durotaxis في الشكل 1A. لينة PDMS الركيزة: ينتشر (90 خليط 1 من قاعدة PDMS إلى crosslinker الحلول) في صحن 6 جيدا ويوضع ساترة الزجاج على رأس PDMS، الذي ثم يغطي جزئيا السطح العلوي للساترة، وبالتالي خلق واجهة بين اثنين من ركائز الامتثال مختلفة. صلابة من PD...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro at JoVE.com

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em&gt; في المختبر</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.1K Views.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

يعاير Proteasomal تدهور في نظام خالية من الخلايا في النباتات

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

فحص Durotaxis خلية واحدة لتقييم السيطرة الميكانيكية للحركة الخلوية والأحداث الإشارات ذات الصلة

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

تقييم التأثيرات الكيميائية النباتية على Helicoverpa armigera من خلال فحص التغذية

Developing a Feeding Assay System for Evaluating the Insecticidal Effect of Phytochemicals on Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and agricultural productivity. In response, plants produce several phytochemicals that negatively impact the insect's growth and survival. This protocol demonstrates an obligate feeding assay method to evaluate the effect of a phytochemical (quercetin) on insect growth, development, and survival. Under controlled conditions, the neonates were maintained until the second instar on a pre-defined artificial diet. These second-instar larvae were allowed to feed on a control and quercetin-containing artificial diet for 10 days. The insects' body weight, developmental stage, frass weight, and mortality were recorded on alternate days. The change in body weight, the difference in feeding pattern, and developmental phenotypes were evaluated throughout the assay time. The described obligatory feeding assay simulates a natural mode of ingestion and can be scaled up to a large number of insects. It permits one to analyze phytochemicals' effect on the growth dynamics, developmental transition, and overall fitness of H. armigera. Furthermore, this setup can also be utilized to evaluate alterations in nutritional parameters and digestive physiology processes. This article provides a detailed methodology for feeding assay systems, which may have applications in toxicological studies, insecticidal molecule screening, and understanding chemical effects in plant-insect interactions.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير وتحديات فحوصات التغذية لإدارة الآفات الحشرية 

This protocol describes the obligate feeding assay to evaluate the potentially toxic effect of a phytochemical on the lepidopteran insect larvae. This is a highly scalable insect bioassay, easy to optimize the sublethal and lethal dose, deterrent activity, and physiological effect. This could be used for screening eco-friendly insecticides.

تطوير نظام فحص التغذية لتقييم تأثير المبيدات الحشرية للمواد الكيميائية النباتية على Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and ...