ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM47607، CA163296 وNSF 1334493 لCET. نشكر أعضاء المختبر تيرنر لقراءة نقدية للمخطوطة. استنسخت كل البيانات الواردة في هذا التقرير بإذن من رمر وآخرون. 2014 11.

1. إعداد Durotaxis الدوائر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد احدة 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة، الفارغة التوازن مع أنبوب مخروطي 50 مل. تزن بها حوالي 10 غرام من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 50 مل (الحل هو لزج جدا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل90: 1 الركيزة (الامتثال لل~ 1 كيلو باسكال)، تقسيم الوزن يقاس من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 90 لتحديد المبلغ الصحيح من حل crosslinker الحاجة. إضافة كمية محسوبة من الحل crosslinker PDMS إلى نفس الأنبوب. مثال: 10 جم / 90 = 0.11 غرام. إضافة 0.11 غرام من حل crosslinker PDMS إلى حل قاعدة PDMS. كلاهما قدم قاعدة وcrosslinker الحلول في عدة PDMS: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بقوة PDMS خليط قاعدة / crosslinker لمدة 5 دقائق على RT باستخدام ملعقة صغيرة. في هذه المرحلة سوف تحتوي على خليط عدد كبير من فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الركيزة PDMS في جهاز للطرد المركزي الفوق لمدة 5 دقائق في 50 x ج في RT لإزالة صغيريBLES. إذا لا يزال هناك فقاعات بعد 5 دقائق، الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 مل 90: 1 PDMS الركيزة في كل بئر من زراعة الأنسجة المعالجة لوحة 6 جيدا. كل ما تبقى من فقاعات الهواء الموجودة في PDMS يمكن القضاء عليها في هذه المرحلة التي ظهرت عليها باستخدام إبرة 21 G. السماح للPDMS لنشر لمدة 30 دقيقة في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي 12 ملم الزجاج # 1 coverslips في الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر مرتين وتخزين لل coverslips في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد، ساترة المجففة في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة عن طريق لمس بلطف جانب واحد من ساترة في حل PDMS ثم إسقاط ساترة على PDMS. كما يستقر ساترة، وسوف تبدأ PDMS للانقضاض على حواف ساترة، ولكن لن تغطي بالكامل. وهذا يولد التفاعل بين PDMS والزجاج بعد المعالجة (انظر الشكل 1A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 70 درجة مئوية في الفرن لمدة 16 ساعة لعلاج (تصلب) وPDMS. وضع بلاته في غطاء خلية ثقافة والأشعة فوق البنفسجية تعقيم لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: فمن الأفضل أن تجعل من لوحات داخل بضعة أيام من الاستخدام. ومع ذلك، قد تكون ملفوفة لوحات في Parafilm دون أي العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع من دون أي انخفاض ملحوظ في الجودة. </li></ol> 2. خلية التصفيحات ملاحظة: إذا كان دراسة تأثير بوساطة سيرنا ضربة قاضية، نفذ ضربة قاضية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول الأمثل لنوع من الخلايا في الاختيار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف كل durotaxis الغرفة مع 1 مل من 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك، فبرونيكتين يمكن تطبيقها اليوم قبل التحليل التي يحتضنها PDMS مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. تأكد من المغمورة كامل السطح في فبرونيكتين في حل PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير للحرارة التشويه والتحريف 1٪ BSA. تزن 0.5 غرام BSA وحله في 50 مل من برنامج تلفزيوني.فلتر تعقيم الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون والحرارة على 80 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. ملاحظة: يعد هذا الحل اليوم قبل الخلية الطلاء وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح حل فبرونيكتين ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التشويه والتحريف الحرارة BSA في برنامج تلفزيوني على كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويعرض للتريبسين عدد الخلايا في الاختيار بينما الدوائر durotaxis يتم حظر مع الحرارة التشويه والتحريف BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1 × 10 5 الخلايا في حجم 2 مل في كل بئر من غرفة durotaxis، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المطلوبة لنوع خلية معينة في الاختيار. السماح للخلايا الالتزام وتنتشر على الركيزة لمدة 4 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تتم المحافظة على الخلايا U2OS بشكل روتيني في DMEM مع 10٪ FBS، على أن تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 10 وحدة دولية / مل البنسلين، 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين: ملاحظة. ملاحظة: عدد الخلايا المستخدمة في هذا المثال هو الأمثل لخلايا U2OS. قد تكون هناك حاجة الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. هذه الكثافة يعطي الخلايا مساحة كافية للهجرة دون تفاعلات كبيرة مع الخلايا الأخرى. </li></ol> التصوير 3. تعيش خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تصوير الخلايا الحية على مجهر مقلوب، وذلك باستخدام النقيض من المرحلة مع الهدف 10X. ينبغي تركيب المجهر مع، غرفة ترطيب البيئة المغلقة، والسماح السيطرة على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ خلال التصوير على المدى الطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انتشار الخلايا لمدة ما يقرب من 3.5 ساعة، تجميع لوحة في غرفة المجهر. السماح للعينة (ق) للتوازن في الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الآلية، متعددة نقطة الزائر على المجهر إن وجدت. التركيز على واجهة بين 90: 1 PDMS وساترة الزجاج واختيار نقاط لصورة في كل مكان واجهة بمتوسط ​​40 نقطة في durotaxis الغرفة. صورة الخلايا كل 10 دقيقة لمدة تصل إلى 16 ساعة. ملاحظة: إعادةسوف جيون من الفائدة تظهر كما سطرين، مع الخط الخارجي المقابل لحافة ساترة والخط الداخلي المقابلة إلى واجهة الفعلية بين PDMS وساترة. انظر الشكل 1B. </li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد جدول بيانات كما في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد عدد من الأحداث المعبر من PDMS على سطح الزجاج، والعكس بالعكس من كل فيلم ولدت. تسجيل عدد من الأحداث معبر في العمود المناسب في جداول اكسل. ملاحظة: يتم تعريف الحدث المعبر باعتباره نواة الخلية تمر عبر الحدود بين PDMS والزجاج في أي من الاتجاهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد المعابر متعددة، حساب عدد المرات الخلية عبرت الواجهة. يجب تسجيل هذا الرقم في العمود التفوق الموافق الركيزة التي كانت تقع الخلية في نهاية الفيلم. تكرار التحليل لكل خلية التي تعبر واجهة في تيانه الفيلم. استبعاد الخلايا التي تهاجر من مجال الرؤية أثناء التصوير. ملاحظة: من المهم أيضا للتحقق، من قبل خلية العد في بداية التجربة، أن الخلايا قادرة على الالتزام بالتساوي على PDMS المغلفة فبرونيكتين والواجهات الزجاجية ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النسبة المئوية للخلايا التي هاجرت من PDMS على سطح الزجاج (أي خضع durotaxis). إضافة عدد من عبور الأحداث من الصعب على لينة وأحداث معبر المتعددة التي انتهت يوم بجد والقسمة على العدد الإجمالي للأحداث المعبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النسبة المئوية للمعابر متعددة بقسمة عدد من المعابر متعددة من قبل عدد من المعابر. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+cell+migration+by+tugging.">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing.">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li><li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis.">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).</li><li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness.">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li><li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

هنا نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis في الخلايا المهاجرة. A القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو سهولة إعداد غرف durotaxis باستخدام PDMS. صلابة من ركائز يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير نسبة PDMS حل قاعدة لcrosslinker للسماح للدراسة الجمود المختلفة في الفحص. ومع ذلك، واحدة الحد المحت...

وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية ويشابك بما في ذلك الكولاجين، فبرونيكتين و laminin. على الرغم من أنها راسخة بأن ECM يوفر الدعم الهيكلي المهم لأنسجة الخلوية، وهناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تستجيب بشكل فعال للتغيرات الفيزيائية في البيئة ECM لتنظيم العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك بقاء الخلية، التمايز والهجرة الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن الاختلافات في صلابة ECM تدفع الخلايا الجذعية الوسيطة نحو الأنساب مختلفة، مع ركائز لينة (~ 1 كيلو باسكال) تعزيز الأنساب العصبية بينما شديدة (~ 25 كيلو باسكال) ركائز تعزيز التمايز عظمي المنشأ 1. وبالمثل، قد أظهرت زيادة في صلابة انسجة مصفوفة لتعزيز الثدي تكون الأورام الخلايا الظهارية والغزو إلى 2،3 الأنسجة المحيطة بها. مما يثير الاهتمام في هذا mechanosignنتائج النشاط aling في عملية تعرف باسم durotaxis، التي تهاجر الخلايا بشكل تفضيلي نحو الركيزة أكثر جمودا 4،5. الخلايا تستشعر باستمرار الخصائص الفيزيائية للبيئتهم خارج الخلية من خلال إنتغرين مستقبلات ملزمة لECM. وهذا، بدوره، ويشجع على تراكم العديد من البروتينات الهيكلية ويشير إلى المجالات الخاصة بهم حشوية لدفع تشكيل هياكل لاصقة المعروفة باسم التصاقات تنسيق أو اتصالات التنسيق 6،7. منذ integrins ليس لها النشاط الأنزيمي الأصيل، يتم ترحيل الإشارات من ECM من خلال هذه البروتينات التبعي لتنسيق استجابة الخلية لتغيير بيئتهم 8. وفقا لذلك، وتحديد وتوصيف البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم mechanosignaling وdurotaxis هو مجال هام من مجالات التحقيق. وقد تم تطوير نظم نموذج مختلف لدراسة durotaxis في المختبر، ولكن معظم لديهاتستخدم المغلفة الكولاجين ركائز بولي أكريلاميد 4. ومع ذلك، فإن إعداد ركائز بولي أكريلاميد يمكن أن يكون تحديا فنيا ويجب أن يكون الكولاجين المستخدمة في هذه المقايسات crosslinked كيميائيا لالركيزة 9. وقد ثبت Polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز لعرض خصائص ميكانيكية مشابهة لركائز بولي أكريلاميد 10. ومع ذلك، يتم ببساطة عن طريق خلط نسبة من القاعدة إلى crosslinker إعداد ركائز PDMS ويمكن أن تطلى هذه ركائز مع بروتينات ECM دون الحاجة إلى يشابك الكيميائي، مما يجعل PDMS أداة أسهل لدراسة آثار صلابة على سلوك الخلية. هنا، نحن تصف كيفية إعداد غرفة durotaxis بسيطة التي تم دمج PDMS الركيزة لينة مع ساترة الزجاج جامدة. الفحص، على النحو المبين أدناه، يوفر طريقة سريعة وبسيطة لدراسة durotaxis. لهذه الدراسة استخدمنا خلايا عظمية U2OS الإنسان جنبا إلى جنب مع سيرنا بوساطةضربة قاضية من cdGAP لدراسة دور هذا البروتين التصاق التنسيق في durotaxis 11. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. قد تكون بديلا أنواع الخلايا الأخرى للخلايا U2OS ويمكن طرقت أي بروتين أسفل أو overexpressed لتحديد الآثار المترتبة على سلوك الخلية أثناء durotaxis. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لإدراج البروتينات الموسومة fluorescently لتحليل ديناميتها والسلوك باستخدام FRAP أو الحنق النهج.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>#1 Cover glass 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

تكوين والميكانيكية خصائص المصفوفة خارج الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة. هذا الضام سدى النسيج التنوع إلى حد كبير سلوك الخلية الآثار لتنظيم عمليات طبيعية ومرضية بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، التصاق الإشارات والهجرة الاتجاه. في هذا الصدد، والقدرة الفطرية لبعض أنواع الخلايا إلى الهجرة نحو أشد، أو أقل المتوافقة ويشار إلى durotaxis الركيزة المصفوفة. هذه الظاهرة تلعب دورا مهما أثناء التطور الجنيني وإصلاح الجرح وغزو الخلايا السرطانية. هنا، نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis، في المختبر، وذلك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز. إعداد وصف durotaxis غرف يخلق واجهة صلابة بين هلام PDMS لينة نسبيا وساترة الزجاج جامدة. في المثال المقدمة، وقد استخدمنا هذه durotaxis غرف لإثبات دور للcdc42 / RAC1 GTPase تفعيل المتواجدفي، cdGAP، في mechanosensing وdurotaxis التنظيم في خلايا عظمية U2OS الإنسان. هذا الاختبار هو قابلية للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى و / أو ضربة قاضية للبروتينات أخرى من المصالح لاستكشاف دور كل منهما في mechanosignaling وdurotaxis.

ويرد التخطيطي للغرفة durotaxis في الشكل 1A. لينة PDMS الركيزة: ينتشر (90 خليط 1 من قاعدة PDMS إلى crosslinker الحلول) في صحن 6 جيدا ويوضع ساترة الزجاج على رأس PDMS، الذي ثم يغطي جزئيا السطح العلوي للساترة، وبالتالي خلق واجهة بين اثنين من ركائز الامتثال مختلفة. صلابة من PD...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro at JoVE.com

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em&gt; في المختبر</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.2K Views.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Bioengineering

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Developmental Biology

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

النسخ في والسلوكية الفحص لMechanosensation من MARCM المستندة<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Neuroscience

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

استشعار ميكانو-نود-مسام: منصة سريعة وخالية من الملصقات لقياسات لزجة مرنة أحادية الخلية متعددة المعلمات

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such as aspiration or coverslip compression have been used to mechanically stimulate whole embryos. These approaches limit experimental design as they are imprecise, require manual handling, and can process only a couple of embryos simultaneously. Microfluidic systems have great potential for automating such experimental tasks while increasing throughput and precision. This article describes a microfluidic system developed to precisely compress whole Drosophila melanogaster (fruit fly) embryos. This system features microchannels with pneumatically actuated deformable sidewalls and enables embryo alignment, immobilization, compression, and post-stimulation collection. By parallelizing these microchannels into seven lanes, steady or dynamic compression patterns can be applied to hundreds of Drosophila embryos simultaneously. Fabricating this system on a glass coverslip facilitates the simultaneous mechanical stimulation and imaging of samples with high-resolution microscopes. Moreover, the utilization of biocompatible materials, like PDMS, and the ability to flow fluid through the system make this device capable of long-term experiments with media-dependent samples. This approach also eliminates the requirement for manual mounting which mechanically stresses samples. Furthermore, the ability to quickly collect samples from the microchannels enables post-stimulation analyses, including -omics assays which require large sample numbers unattainable using traditional mechanical stimulation approaches. The geometry of this system is readily scalable to different biological systems, enabling numerous fields to benefit from the functional features described herein including high sample throughput, mechanical stimulation or immobilization, and automated alignment.

The present protocol describes the design, fabrication, and characterization of a microfluidic system capable of aligning, immobilizing, and precisely compressing hundreds of Drosophila melanogaster embryos with minimal user intervention. This system enables high-resolution imaging and recovery of samples for post-stimulation analysis and can be scaled to accommodate other multicellular biological systems.

التحفيز الميكانيكي للكائنات متعددة الخلايا من خلال نظام ضغط الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

فحص القص الموحد للصفيحات البشرية ومستقبلات سطح الخلية عبر اللوحة المخروطية

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

استخدام الميكروسكيل السيليكون الكابولي لتقييم مقلص الخلوية وظيفة