עבודה זו נתמכת על ידי NIH R01 GM47607, CA163296 וNSF 1,334,493 למטח. אנו מודים לחברי המעבדה טרנר לקריאה ביקורתית של כתב היד. כל הנתונים שמוצגים בדוח זה היו מיוצרים באישור וורמר et al. 2,014 11.

1. הכנת לשכות Durotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחת תרבית רקמת 6-גם אחד, הטרה האיזון עם צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשקול את כ -10 גרם של פתרון PDMS הבסיס בצינור 50 מ&quot;ל (הפתרון הוא די צמיג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל90: מצע 1 (Compliance של ~ 1 kPa), לחלק את המשקל שנמדד של פתרון בסיס PDMS בצינור ב -90 כדי לקבוע את הסכום הנכון של פתרון crosslinker צורך. מוסיף את הכמות המחושבת של פתרון crosslinker PDMS לאותו צינור. לדוגמא: 10 גר &#39;/ 90 = 0.11 גרם. להוסיף 0.11 גרם של פתרון crosslinker PDMS לפתרון בסיס PDMS. הערה: פתרונות הבסיס וcrosslinker שניהם מסופקים בערכת PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לערבב את תערובת הבסיס / crosslinker PDMS 5 דקות בRT בעזרת מרית קטנה. בשלב זה התערובת תכיל מספר רב של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מצע PDMS בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות ב 50 XG ב RT להסיר את bubbles. אם עדיין יש בועות לאחר 5 דקות, צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 פיפטה מיליליטר של 90: 1 מצע PDMS לבאר כל תרבית הרקמה שטופל 6-גם צלחת. ניתן לבטל את כל בועות אוויר שנותרו כיום בPDMS בשלב זה על ידי פקיעתם באמצעות מחט 21 G. לאפשר PDMS להפיץ למשך 30 דקות בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רתיחה # זכוכית 12 מ&quot;מ 1 coverslips במים מזוקקים למשך 5 דקות. חזור על שתי פעמים ולאחסן את coverslips במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד coverslip מיובש, לבאר כל צלחת תרבית הרקמה על ידי בעדינות נוגע בצד אחד של coverslip לפתרון PDMS לאחר מכן שחרר את coverslip PDMS. כcoverslip מתיישב, PDMS יתחיל לנגוס על הקצוות של coverslip, אבל לא יכסה אותו לחלוטין. זה יפיק ממשק בין PDMS והזכוכית לאחר הריפוי (ראה איור 1 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 70 מעלות צלזיוס בתנור במשך 16 שעות כדי לרפא (להקשיח) PDMS. מניחים את פלאטדואר בשכונת תרבות התא וUV לעקר במשך 10 דקות. הערה: עדיף לעשות את הצלחות בתוך כמה ימים של שימוש. עם זאת, הצלחות יכולות להיות עטופות בParafilm ללא כל חיץ ומאוחסנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות ללא כל ירידה מורגשת באיכות. </li></ol> 2. תא ציפוי הערה: אם בוחן את ההשפעה של מציאה בתיווך siRNA, לבצע את מציאה באמצעות הוראות היצרן או הפרוטוקול מותאם לסוג התא של בחירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל כל durotaxis קאמרי עם 1 מיליליטר של 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS ללא סידן ומגנזיום לשעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, פיברונקטין ניתן להחיל היום לפני ניתוח על ידי דוגרים PDMS עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. ודא את כל פני השטח הוא שקוע בפיברונקטין בפתרון PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BSA 1% חום מפוגל. שוקל 0.5 גרם BSA ולפזר אותו ב 50 מיליליטר של PBS.סנן לעקר את הפתרון דרך פילטר וחום 0.22 מיקרומטר על 80 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. הערה: הכן את הפתרון הזה ביום שלפני תא ציפוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון פיברונקטין ולשטוף 3 פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר של BSA-מפוגל חום בPBS לכל היטב דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ולספור תאים של בחירה תוך תאי durotaxis חוסמים עם BSA החום מפוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 x 10 5 תאים בנפח של 2 מיליליטר לכל טוב של חדר durotaxis, באמצעות התקשורת הנדרשת לסוג תא המסוים של בחירה. אפשר התאים לדבוק ולהתפשט על המצע במשך 4 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: תאי U2OS נשמרים באופן שיגרתי בDMEM עם 10% FBS, בתוספת L- גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, ו -10 IU / פניצילין מיליליטר, 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. הערה: מספר התאים המשמש בדוגמא זו היא מותאמת לתאי U2OS. ייתכן שתהיה צורך אופטימיזציה לסוגי תאים אחרים. צפיפות זה נותנת את התאים מספיק מקום להעביר ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. </li></ol> הדמיה 3. Live- תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה תא חי על מיקרוסקופ הפוכה, באמצעות ניגוד שלב עם מטרת 10X. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד עם תא humidified, סגור סביבתי, המאפשר שליטה על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במהלך הדמיה לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים התפשטו לכ 3.5 שעות, להרכיב את הצלחת בתא מיקרוסקופ. לאפשר המדגם (ים) לאזן בתא למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ריבוי נקודות אוטומטיות, ביקור במיקרוסקופ אם זמין. דגש על הממשק שבין 90: 1 PDMS וcoverslip הזכוכית ולבחור נקודות לתמונה בכל רחבי הממשק עם ממוצע של 40 נקודות לdurotaxis קאמרית. תמונת התאים כל 10 דקות עד 16 שעות. הערה: מחדשגיון של עניין יופיע כשני קווים, עם הקו החיצוני המקביל לקצה של coverslip והקו הפנימי המקביל לממשק בפועל בין PDMS וcoverslip. ראה איור 1. </li></ol> ניתוח נתונים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור גיליון אלקטרוני כמו בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר אירועי מעבר מPDMS למשטח הזכוכית ולהיפך מכל סרט שנוצר. רשום את מספר אירועי מעבר בעמודה המתאימה בגיליון האלקטרוני Excel. הערה: אירוע מעבר מוגדר כגרעין התא עובר על הגבול בין PDMS והזכוכית בכל כיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת מעברים מרובים, לספור את מספר הפעמים שהתא חצה את הממשק. מספר זה צריך להיות מוקלט בעמודת Excel המתאימה למצע שעליו התא היה ממוקם בסוף הסרט. חזור על הניתוח לכל תא שחוצה את הממשק בtסרטו. תכלול תאים שנודדים משדה הראייה במהלך הדמיה. הערה: חשוב גם כדי לוודא, על ידי תא לספור בתחילת הניסוי, שהתאים מסוגלים לדבוק באותה מידה לPDMS מצופה פיברונקטין ומשטחי הזכוכית coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז התאים שהגרו מPDMS למשטח הזכוכית (כלומר, עבר durotaxis). הוסף את מספר חציית אירועים מרכים לקשה ואירועי המעבר המרובים שהסתיימו ביום קשה ולחלק במספר הכולל של אירועי מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי המעברים מרובים על ידי חלוקת מספר המעברים מרובים במספר הכולל של מעברים. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+cell+migration+by+tugging.">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing.">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li><li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis.">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).</li><li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness.">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li><li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

במסמך זה אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis בתאים נודדים. כוח עיקרי של assay זה הוא הקלות של הכנת תאי durotaxis באמצעות PDMS. הנוקשות של מצעים ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי היחס של פתרון בסיס PDMS לcrosslinker כדי לאפשר המחקר של קשיחויות שונות בassay. עם זאת, הגבלת פוטנציאל אחד של המערכת היא ...

מטריקס (ECM) מורכב ממערך מורכב של חלבונים מבניים וcrosslinking כולל קולגן, פיברונקטין וlaminin. למרות שזה מבוסס היטב כי ECM מספק תמיכה מבנית חשובה לרקמות סלולריות, יש ראיות גוברים למצביעות על כך שתאים באופן פעיל להגיב לשינויים פיזיים בסביבת ECM להסדיר תהליכים תאיים שונים כולל הישרדות תא, התמיינות ונדידת תאים. לדוגמא, הבדלים בקשיחות של ECM יכולים לנהוג בתאי גזע mesenchymal כלפי שושלות שונות, עם מצעים רכים (~ 1 kPa) קידום שושלות עצביות בעוד מצעים נוקשה (~ 25 kPa) לקדם בידול osteogenic 1. כמו כן, עלייה בקשיחות מטריצת סטרומה הוכחה לקדם tumorigenesis החלב אפיתל תאים ופלישה ל2,3 הרקמה הסובב. היבט מעניין במיוחד של mechanosign זהתוצאות פעילות aling בתהליך המכונה durotaxis, שבו תאים לנדוד מועדף כלפי מצע קשיח יותר 4,5. תאים לחוש כל הזמן את המאפיינים הפיזיים של הסביבה תאית שלהם באמצעות קולט integrin מחייבים את ECM. זה, בתורו, מקדם את ההצטברות של חלבונים מבניים ואיתות רבים לתחומים cytoplasmic לנהוג ההיווצרות של מבנים דבקים הידועים כהידבקויות מוקד או אנשי קשר מוקדי 6,7. מאז יש לי integrins אין פעילות האנזימטית טבועה, אותות מועברים מECM דרך חלבוני אבזר אלה כדי לתאם את התגובה של התא לסביבה המשתנה שלהם 8. בהתאם לכך, זיהוי והאפיון של חלבוני מפתח מעורבים בויסות mechanosignaling וdurotaxis הוא אזור חשוב של חקירה. מערכות מודל שונות פותחו כדי ללמוד durotaxis במבחנה, אך רוב יש לימצעים מנוצלים מצופה קולגן polyacrylamide 4. עם זאת, ההכנה של מצעי polyacrylamide יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית וקולגן המשמש במבחנים אלה חייב להיות כימיים crosslinked למצע 9. Polydimethylsiloxane מצעים (PDMS) הוכחו תערוכה תכונות מכאניות דומות למצעי polyacrylamide 10. עם זאת, מצעי PDMS מוכנים על ידי ערבוב פשוט יחס של הבסיס לcrosslinker ויכולים להיות מצופים מצעים אלה עם חלבוני ECM ללא הצורך בcrosslinking הכימי, ובכך PDMS כלי קל יותר לחקור את ההשפעות של נוקשות בהתנהגות תא. בזאת, אנו מתארים כיצד להכין קאמרי durotaxis פשוט שבמצע PDMS רך משולב עם coverslip זכוכית נוקשה. Assay, כמפורט להלן, מספק שיטה מהירה ופשוטה ללמוד durotaxis. במחקר זה השתמשנו בתאים אנושיים אוסטאוסרקומה U2OS בשילוב עם תיווך siRNAמציאה של cdGAP כדי ללמוד את התפקיד של חלבון הידבקות מוקד זה בdurotaxis 11. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לדרישות פרט. סוגי תאים אחרים יכולים להחליף את תאי U2OS וכל חלבון יכול להיות הפיל או ביטוי יתר כדי לקבוע את ההשפעות על התנהגות תא במהלך durotaxis. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשלב חלבונים מתויגים fluorescently לנתח את הדינמיקה שלהם וFRAP באמצעות התנהגות או סריג גישות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Cover glass 12mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

מאפייני הרכב ומכאני של מטריקס הם משתנה מאוד בין סוגי רקמות. גיוון זה חיבור סטרומה הרקמה מאוד תא השפעות התנהגות להסדיר תהליכים נורמלים ופתולוגיים כוללים התפשטות תאים, התמיינות, איתות הידבקות והגירה כיוונית. בהקשר זה, היכולת המולדת של סוגים מסוימים של תאים לנדוד לכיוון מצע מטריצה ​​נוקשה, פחות או תואם נקרא durotaxis. תופעה זו ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, תיקון פצע ופלישה של תאים סרטניים. כאן אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis, במבחנה, באמצעות polydimethylsiloxane מצעים (PDMS). הכנת תאר durotaxis תאים יוצרת ממשק בין נוקשות ג&#39;ל PDMS הרך יחסית וcoverslip זכוכית נוקשה. בדוגמא בתנאי, השתמשנו תאי durotaxis אלה להפגין תפקיד לCdc42 הגנה של מחזור / Rac1 GTPase הפעלהב, cdGAP, בmechanosensing וdurotaxis רגולציה בתאי אוסטאוסרקומה U2OS אנושיים. assay זה הוא בקלות להתאמה לסוגי תאים אחרים ו / או מציאה של חלבונים אחרים של אינטרסים לחקור התפקידים שלהם בmechanosignaling וdurotaxis.

סכמטי של תא durotaxis מוצג באיור 1 א. מצע PDMS רך (90: תערובת 1 של בסיס PDMS לcrosslinker פתרונות) היא להפיץ בצלחת 6 היטב וcoverslip זכוכית מונח על גבי PDMS, אשר לאחר מכן באופן חלקי מכסה את פני השטח העליונים של coverslip, ובכך ליצור ממשק בין שני מצעים של ציות שונה. הקשיחות של מצע PDMS הרך היא ~ 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro at JoVE.com

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis<em&gt; במבחנה</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.1K Views.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

הערכת השפעות פיטוכימיות על Helicoverpa armigera באמצעות בדיקת האכלה

Developing a Feeding Assay System for Evaluating the Insecticidal Effect of Phytochemicals on Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and agricultural productivity. In response, plants produce several phytochemicals that negatively impact the insect's growth and survival. This protocol demonstrates an obligate feeding assay method to evaluate the effect of a phytochemical (quercetin) on insect growth, development, and survival. Under controlled conditions, the neonates were maintained until the second instar on a pre-defined artificial diet. These second-instar larvae were allowed to feed on a control and quercetin-containing artificial diet for 10 days. The insects' body weight, developmental stage, frass weight, and mortality were recorded on alternate days. The change in body weight, the difference in feeding pattern, and developmental phenotypes were evaluated throughout the assay time. The described obligatory feeding assay simulates a natural mode of ingestion and can be scaled up to a large number of insects. It permits one to analyze phytochemicals' effect on the growth dynamics, developmental transition, and overall fitness of H. armigera. Furthermore, this setup can also be utilized to evaluate alterations in nutritional parameters and digestive physiology processes. This article provides a detailed methodology for feeding assay systems, which may have applications in toxicological studies, insecticidal molecule screening, and understanding chemical effects in plant-insect interactions.

מחבר זרקור: התפתחות ואתגרים של בדיקות האכלה להדברת חרקים 

This protocol describes the obligate feeding assay to evaluate the potentially toxic effect of a phytochemical on the lepidopteran insect larvae. This is a highly scalable insect bioassay, easy to optimize the sublethal and lethal dose, deterrent activity, and physiological effect. This could be used for screening eco-friendly insecticides.

פיתוח מערכת בדיקת האכלה להערכת ההשפעה קוטלת החרקים של פיטוכימיקלים על Helicoverpa armigera

Helicoverpa armigera, a lepidopteran insect, is a polyphagous pest with a worldwide distribution. This herbivorous insect is a threat to plants and ...