עבודה זו נתמכת על ידי NIH R01 GM47607, CA163296 וNSF 1,334,493 למטח. אנו מודים לחברי המעבדה טרנר לקריאה ביקורתית של כתב היד. כל הנתונים שמוצגים בדוח זה היו מיוצרים באישור וורמר et al. 2,014 11.

1. הכנת לשכות Durotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחת תרבית רקמת 6-גם אחד, הטרה האיזון עם צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשקול את כ -10 גרם של פתרון PDMS הבסיס בצינור 50 מ&quot;ל (הפתרון הוא די צמיג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל90: מצע 1 (Compliance של ~ 1 kPa), לחלק את המשקל שנמדד של פתרון בסיס PDMS בצינור ב -90 כדי לקבוע את הסכום הנכון של פתרון crosslinker צורך. מוסיף את הכמות המחושבת של פתרון crosslinker PDMS לאותו צינור. לדוגמא: 10 גר &#39;/ 90 = 0.11 גרם. להוסיף 0.11 גרם של פתרון crosslinker PDMS לפתרון בסיס PDMS. הערה: פתרונות הבסיס וcrosslinker שניהם מסופקים בערכת PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לערבב את תערובת הבסיס / crosslinker PDMS 5 דקות בRT בעזרת מרית קטנה. בשלב זה התערובת תכיל מספר רב של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מצע PDMS בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות ב 50 XG ב RT להסיר את bubbles. אם עדיין יש בועות לאחר 5 דקות, צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 פיפטה מיליליטר של 90: 1 מצע PDMS לבאר כל תרבית הרקמה שטופל 6-גם צלחת. ניתן לבטל את כל בועות אוויר שנותרו כיום בPDMS בשלב זה על ידי פקיעתם באמצעות מחט 21 G. לאפשר PDMS להפיץ למשך 30 דקות בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רתיחה # זכוכית 12 מ&quot;מ 1 coverslips במים מזוקקים למשך 5 דקות. חזור על שתי פעמים ולאחסן את coverslips במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד coverslip מיובש, לבאר כל צלחת תרבית הרקמה על ידי בעדינות נוגע בצד אחד של coverslip לפתרון PDMS לאחר מכן שחרר את coverslip PDMS. כcoverslip מתיישב, PDMS יתחיל לנגוס על הקצוות של coverslip, אבל לא יכסה אותו לחלוטין. זה יפיק ממשק בין PDMS והזכוכית לאחר הריפוי (ראה איור 1 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 70 מעלות צלזיוס בתנור במשך 16 שעות כדי לרפא (להקשיח) PDMS. מניחים את פלאטדואר בשכונת תרבות התא וUV לעקר במשך 10 דקות. הערה: עדיף לעשות את הצלחות בתוך כמה ימים של שימוש. עם זאת, הצלחות יכולות להיות עטופות בParafilm ללא כל חיץ ומאוחסנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות ללא כל ירידה מורגשת באיכות. </li></ol> 2. תא ציפוי הערה: אם בוחן את ההשפעה של מציאה בתיווך siRNA, לבצע את מציאה באמצעות הוראות היצרן או הפרוטוקול מותאם לסוג התא של בחירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל כל durotaxis קאמרי עם 1 מיליליטר של 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS ללא סידן ומגנזיום לשעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, פיברונקטין ניתן להחיל היום לפני ניתוח על ידי דוגרים PDMS עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. ודא את כל פני השטח הוא שקוע בפיברונקטין בפתרון PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BSA 1% חום מפוגל. שוקל 0.5 גרם BSA ולפזר אותו ב 50 מיליליטר של PBS.סנן לעקר את הפתרון דרך פילטר וחום 0.22 מיקרומטר על 80 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. הערה: הכן את הפתרון הזה ביום שלפני תא ציפוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון פיברונקטין ולשטוף 3 פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר של BSA-מפוגל חום בPBS לכל היטב דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ולספור תאים של בחירה תוך תאי durotaxis חוסמים עם BSA החום מפוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 x 10 5 תאים בנפח של 2 מיליליטר לכל טוב של חדר durotaxis, באמצעות התקשורת הנדרשת לסוג תא המסוים של בחירה. אפשר התאים לדבוק ולהתפשט על המצע במשך 4 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: תאי U2OS נשמרים באופן שיגרתי בDMEM עם 10% FBS, בתוספת L- גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, ו -10 IU / פניצילין מיליליטר, 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. הערה: מספר התאים המשמש בדוגמא זו היא מותאמת לתאי U2OS. ייתכן שתהיה צורך אופטימיזציה לסוגי תאים אחרים. צפיפות זה נותנת את התאים מספיק מקום להעביר ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. </li></ol> הדמיה 3. Live- תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה תא חי על מיקרוסקופ הפוכה, באמצעות ניגוד שלב עם מטרת 10X. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד עם תא humidified, סגור סביבתי, המאפשר שליטה על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במהלך הדמיה לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים התפשטו לכ 3.5 שעות, להרכיב את הצלחת בתא מיקרוסקופ. לאפשר המדגם (ים) לאזן בתא למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ריבוי נקודות אוטומטיות, ביקור במיקרוסקופ אם זמין. דגש על הממשק שבין 90: 1 PDMS וcoverslip הזכוכית ולבחור נקודות לתמונה בכל רחבי הממשק עם ממוצע של 40 נקודות לdurotaxis קאמרית. תמונת התאים כל 10 דקות עד 16 שעות. הערה: מחדשגיון של עניין יופיע כשני קווים, עם הקו החיצוני המקביל לקצה של coverslip והקו הפנימי המקביל לממשק בפועל בין PDMS וcoverslip. ראה איור 1. </li></ol> ניתוח נתונים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור גיליון אלקטרוני כמו בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר אירועי מעבר מPDMS למשטח הזכוכית ולהיפך מכל סרט שנוצר. רשום את מספר אירועי מעבר בעמודה המתאימה בגיליון האלקטרוני Excel. הערה: אירוע מעבר מוגדר כגרעין התא עובר על הגבול בין PDMS והזכוכית בכל כיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת מעברים מרובים, לספור את מספר הפעמים שהתא חצה את הממשק. מספר זה צריך להיות מוקלט בעמודת Excel המתאימה למצע שעליו התא היה ממוקם בסוף הסרט. חזור על הניתוח לכל תא שחוצה את הממשק בtסרטו. תכלול תאים שנודדים משדה הראייה במהלך הדמיה. הערה: חשוב גם כדי לוודא, על ידי תא לספור בתחילת הניסוי, שהתאים מסוגלים לדבוק באותה מידה לPDMS מצופה פיברונקטין ומשטחי הזכוכית coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז התאים שהגרו מPDMS למשטח הזכוכית (כלומר, עבר durotaxis). הוסף את מספר חציית אירועים מרכים לקשה ואירועי המעבר המרובים שהסתיימו ביום קשה ולחלק במספר הכולל של אירועי מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי המעברים מרובים על ידי חלוקת מספר המעברים מרובים במספר הכולל של מעברים. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+cell+migration+by+tugging.">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing.">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li><li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis.">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).</li><li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness.">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li><li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

במסמך זה אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis בתאים נודדים. כוח עיקרי של assay זה הוא הקלות של הכנת תאי durotaxis באמצעות PDMS. הנוקשות של מצעים ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי היחס של פתרון בסיס PDMS לcrosslinker כדי לאפשר המחקר של קשיחויות שונות בassay. עם זאת, הגבלת פוטנציאל אחד של המערכת היא ...

מטריקס (ECM) מורכב ממערך מורכב של חלבונים מבניים וcrosslinking כולל קולגן, פיברונקטין וlaminin. למרות שזה מבוסס היטב כי ECM מספק תמיכה מבנית חשובה לרקמות סלולריות, יש ראיות גוברים למצביעות על כך שתאים באופן פעיל להגיב לשינויים פיזיים בסביבת ECM להסדיר תהליכים תאיים שונים כולל הישרדות תא, התמיינות ונדידת תאים. לדוגמא, הבדלים בקשיחות של ECM יכולים לנהוג בתאי גזע mesenchymal כלפי שושלות שונות, עם מצעים רכים (~ 1 kPa) קידום שושלות עצביות בעוד מצעים נוקשה (~ 25 kPa) לקדם בידול osteogenic 1. כמו כן, עלייה בקשיחות מטריצת סטרומה הוכחה לקדם tumorigenesis החלב אפיתל תאים ופלישה ל2,3 הרקמה הסובב. היבט מעניין במיוחד של mechanosign זהתוצאות פעילות aling בתהליך המכונה durotaxis, שבו תאים לנדוד מועדף כלפי מצע קשיח יותר 4,5. תאים לחוש כל הזמן את המאפיינים הפיזיים של הסביבה תאית שלהם באמצעות קולט integrin מחייבים את ECM. זה, בתורו, מקדם את ההצטברות של חלבונים מבניים ואיתות רבים לתחומים cytoplasmic לנהוג ההיווצרות של מבנים דבקים הידועים כהידבקויות מוקד או אנשי קשר מוקדי 6,7. מאז יש לי integrins אין פעילות האנזימטית טבועה, אותות מועברים מECM דרך חלבוני אבזר אלה כדי לתאם את התגובה של התא לסביבה המשתנה שלהם 8. בהתאם לכך, זיהוי והאפיון של חלבוני מפתח מעורבים בויסות mechanosignaling וdurotaxis הוא אזור חשוב של חקירה. מערכות מודל שונות פותחו כדי ללמוד durotaxis במבחנה, אך רוב יש לימצעים מנוצלים מצופה קולגן polyacrylamide 4. עם זאת, ההכנה של מצעי polyacrylamide יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית וקולגן המשמש במבחנים אלה חייב להיות כימיים crosslinked למצע 9. Polydimethylsiloxane מצעים (PDMS) הוכחו תערוכה תכונות מכאניות דומות למצעי polyacrylamide 10. עם זאת, מצעי PDMS מוכנים על ידי ערבוב פשוט יחס של הבסיס לcrosslinker ויכולים להיות מצופים מצעים אלה עם חלבוני ECM ללא הצורך בcrosslinking הכימי, ובכך PDMS כלי קל יותר לחקור את ההשפעות של נוקשות בהתנהגות תא. בזאת, אנו מתארים כיצד להכין קאמרי durotaxis פשוט שבמצע PDMS רך משולב עם coverslip זכוכית נוקשה. Assay, כמפורט להלן, מספק שיטה מהירה ופשוטה ללמוד durotaxis. במחקר זה השתמשנו בתאים אנושיים אוסטאוסרקומה U2OS בשילוב עם תיווך siRNAמציאה של cdGAP כדי ללמוד את התפקיד של חלבון הידבקות מוקד זה בdurotaxis 11. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לדרישות פרט. סוגי תאים אחרים יכולים להחליף את תאי U2OS וכל חלבון יכול להיות הפיל או ביטוי יתר כדי לקבוע את ההשפעות על התנהגות תא במהלך durotaxis. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשלב חלבונים מתויגים fluorescently לנתח את הדינמיקה שלהם וFRAP באמצעות התנהגות או סריג גישות.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>#1 Cover glass 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

מאפייני הרכב ומכאני של מטריקס הם משתנה מאוד בין סוגי רקמות. גיוון זה חיבור סטרומה הרקמה מאוד תא השפעות התנהגות להסדיר תהליכים נורמלים ופתולוגיים כוללים התפשטות תאים, התמיינות, איתות הידבקות והגירה כיוונית. בהקשר זה, היכולת המולדת של סוגים מסוימים של תאים לנדוד לכיוון מצע מטריצה ​​נוקשה, פחות או תואם נקרא durotaxis. תופעה זו ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, תיקון פצע ופלישה של תאים סרטניים. כאן אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis, במבחנה, באמצעות polydimethylsiloxane מצעים (PDMS). הכנת תאר durotaxis תאים יוצרת ממשק בין נוקשות ג&#39;ל PDMS הרך יחסית וcoverslip זכוכית נוקשה. בדוגמא בתנאי, השתמשנו תאי durotaxis אלה להפגין תפקיד לCdc42 הגנה של מחזור / Rac1 GTPase הפעלהב, cdGAP, בmechanosensing וdurotaxis רגולציה בתאי אוסטאוסרקומה U2OS אנושיים. assay זה הוא בקלות להתאמה לסוגי תאים אחרים ו / או מציאה של חלבונים אחרים של אינטרסים לחקור התפקידים שלהם בmechanosignaling וdurotaxis.

סכמטי של תא durotaxis מוצג באיור 1 א. מצע PDMS רך (90: תערובת 1 של בסיס PDMS לcrosslinker פתרונות) היא להפיץ בצלחת 6 היטב וcoverslip זכוכית מונח על גבי PDMS, אשר לאחר מכן באופן חלקי מכסה את פני השטח העליונים של coverslip, ובכך ליצור ממשק בין שני מצעים של ציות שונה. הקשיחות של מצע PDMS הרך היא ~ 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro at JoVE.com

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis<em&gt; במבחנה</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.2K Views.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Developmental Biology

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Behavior

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Neuroscience

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Bioengineering

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such as aspiration or coverslip compression have been used to mechanically stimulate whole embryos. These approaches limit experimental design as they are imprecise, require manual handling, and can process only a couple of embryos simultaneously. Microfluidic systems have great potential for automating such experimental tasks while increasing throughput and precision. This article describes a microfluidic system developed to precisely compress whole Drosophila melanogaster (fruit fly) embryos. This system features microchannels with pneumatically actuated deformable sidewalls and enables embryo alignment, immobilization, compression, and post-stimulation collection. By parallelizing these microchannels into seven lanes, steady or dynamic compression patterns can be applied to hundreds of Drosophila embryos simultaneously. Fabricating this system on a glass coverslip facilitates the simultaneous mechanical stimulation and imaging of samples with high-resolution microscopes. Moreover, the utilization of biocompatible materials, like PDMS, and the ability to flow fluid through the system make this device capable of long-term experiments with media-dependent samples. This approach also eliminates the requirement for manual mounting which mechanically stresses samples. Furthermore, the ability to quickly collect samples from the microchannels enables post-stimulation analyses, including -omics assays which require large sample numbers unattainable using traditional mechanical stimulation approaches. The geometry of this system is readily scalable to different biological systems, enabling numerous fields to benefit from the functional features described herein including high sample throughput, mechanical stimulation or immobilization, and automated alignment.

The present protocol describes the design, fabrication, and characterization of a microfluidic system capable of aligning, immobilizing, and precisely compressing hundreds of Drosophila melanogaster embryos with minimal user intervention. This system enables high-resolution imaging and recovery of samples for post-stimulation analysis and can be scaled to accommodate other multicellular biological systems.

מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video