The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. يطير الجيل الخط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد اثنين من بنيات مختلفة. في بناء أول، RpL10A كدنا] (الريباسي البروتين الوحيدات L10a) يتم استنساخ المصب من GFP إلى pUASP-PL-GFP-Nter البلازميد (نسخة معدلة من 32). استخدام المروج سلالة الجرثومية يسمح استخدام أكثر متعدد التكافؤ من خط المعدلة وراثيا. ملاحظة: الحصول على بناء الثاني عن طريق الاستنساخ التسلسل التنظيمي القيادة التعبير الأنسجة محددة من الجين ترهل المنبع من GAL4 (TF) باستخدام pPTGAL4 البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن البلازميدات على حدة إلى 1118 ث الذباب وإدراج يبني في الجينوم الذبابة التي كتبها P-عنصر الإدراج (وفقا للإجراءات القياسية) 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر transformants من أجل استعادة خطوط الطيران مع يبني على اثنين من الكروموزومات مختلفة. يتم إنشاء خط TRAP النهائي من خلال الجمع بين هذين الخطين (الصلبان الوراثية) من أجل الحصول على خط واحد ثابت المزدوج المعدلة وراثيا. F0: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. MKRS / TM6Bس W-؛ CYO / المجلس الأعلى للجامعات، التهدل GAL4 / TM6B. F1: W-. CYO، UAS EGFP :: RpL10A. ترهل GAL4 / TM6B. كبير تضخيم هذا الخط، وجمع الأجنة نظموا المطلوب. </li></ol> 2. جمع الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 8 أقفاص السكان اسطوانية كبيرة تحتوي على حوالي 40 غراما من الذباب الشباب في قفص (حوالي 180،000 الذباب / القفص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في ما يسمى ما قبل الأناشيد التي تسمح الذباب لمسح الأجنة النامية من ناقلة البيضات بهم. لذلك، ووضع الذباب لمدة 1 ساعة على طبقين 11 سم القطر بتري تحتوي على خليط من طدت أجار وعصير العنب وتغطية ⅓ من السطح مع طازجة من صنع عجينة الخميرة. بعد 3 تبادل العنب لوحات عصير جمع الأجنة حقيقية على مماثلة لوحات مصنوعة حديثا. وتختلف فترة حضانة وفقا لالتنموي الوقت النافذة درس: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من أقفاص وتركهم في نفس درجة الحرارة للمدة الزمنية اللازمة للحصول على مرحلة تنموية الصحيحة (على سبيل المثال، 3 ساعة من وضع البيض + 10 ساعة من الخا<html> IONAL حضانة يعطي الأجنة من مرحلة 10-13 ساعة بعد وضع البيض (AEL)). Resuspend والمحتوى لوحة (الأجنة، معجون الخميرة، الذباب الميت) مع 50 مل من الماء باستخدام الفرشاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذهب من خلال سلسلة من المناخل (700 ميكرون، 355 ميكرون، 112 ميكرون) لفصل الأجنة من الذباب الميت وتبقى أجزاء الجسم وجمع الأجنة المتبقية على منخل قطرها أصغر، ثم تغسل لفترة وجيزة في الماء منزوع الأيونات. لا تستخدم أكثر من 18 لوحات في جمع لأنها يمكن أن تسد المناخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة Dechorionate في 4.5٪ التبييض في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة ويشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات لمدة 30-60 ثانية. احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20، 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد، لمدة 5-10 دقيقة في RT في إطار التحريض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الجافة على السليلوز ورقة ماصة ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. وزن الأنابيب وفلاش تجميد الأجنة عن طريق الغمر في النيتروجين السائل. في هذه المرحلة، والأجنة المجففة ويمكن تخزينها لعدة أشهر في -80 ° C. </li></ol>الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. إعداد الخرز المغناطيسي إلى جانب لGFP الضد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend بدقة بروتين G حبات مغناطيسية في زجاجة الأصلية عن طريق الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 90 ميكرولتر من الخرز لأنبوب ريبونوكلياز خالية وجمعها على المغناطيس (30-60 ثانية). 90 ميكرولتر من الخرز ضروري لأداء مناعي (IP) مع 1 مل من المحللة التي تحتوي على 60-80 ملغ / مل البروتينات. احترام نسب لمنع حبة التشبع. استخدام العديد من الأنابيب وفقا لكمية البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مع 1 × PBS 0.01٪ توين 20 (500 ميكرولتر) وجمع حبات على مغناطيس لتجاهل طاف. إضافة 30 ميكروغرام من GFP الأضداد في 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 0.01٪ توين 20 إلى الخرز واحتضان مع نهاية بطيئة على نهاية خلط لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس (30-60 ثانية)، ونبذ طاف وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome (HEPES 10 مم، 150 مم بوكل، MgCl 2 5 ملم، DTT 0.5 ملم، تريتون 1٪، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل ، العلاقات العامةotease المانع 1 ×، ريبونوكلياز المانع 100 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس وإضافة 500 ميكرولتر من عرقلة العازلة (BSA 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، الحمض الريبي النووي النقال الخميرة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر، جليكوجين 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر في polysome استخراج العازلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في RT وكرر هذه الخطوة مرة واحدة مع عازلة تمنع الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس وشطف في 500 ميكرولتر من استخراج العازلة polysome، ثم يتذكر الخرز والشروع فورا في خطوة immunopurification (المادة 6). </li></ol> 4. المحللة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء، وإعداد البرنامج على حبات السرعة متعددة الاتجاهات طاحونة: 2 × 10 ثانية في 5000 دورة في الدقيقة، 15 ثانية وقفة. نقل الأجنة المجففة (1.5 غرام) إلى 15 مل أنابيب prechilled على الجليد التي تحتوي على استخراج العازلة polysome، والتجانس على الفور. التجانس 1.5 غرام من الأجنة في 4 مل من استخراج العازلة polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتشار المتجانس الأجنة في اثنين prechilled 2 مل أنابيب وطحن امبرينظام التشغيل عن طريق تشغيل برنامج الخالط. نقل المحللة إلى أنابيب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد وإعداد طاف خلف النواة بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 غرام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لأنبوب microcentrifuge prechilled جديدة على الجليد، إضافة 1/100 حجم العينة من 10٪ Nonidet P-40 لطاف (تركيز النهائي = 0.1٪)، وتخلط برفق بواسطة قلب الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبض الطرد المركزي العينة في minifuge لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب، إضافة 09/01 حجم عينة من 300 ملي 1،2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) (تركيز النهائي = 30 ملم )، ومزجها بلطف بواسطة قلب الأنبوب، واحتضان الخليط على الجليد لمدة 5 دقائق (مزيج من قبل قلب عدة مرات خلال الحضانة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طاف بعد الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20000 ز. قياس تركيز البروتين بواسطة الأسلوب برادفورد: يجب أن يكون التركيز في المحللة بين 60-80 ملغ / مل. تيأك طاف لجديد أنبوب microcentrifuge prechilled جديدة والشروع فورا في الخطوة ما قبل امتصاص (القسم 5). </li></ol> 5. قبل امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما resuspend والخرز المغناطيسي من قبل الإثارة لطيف ونقل 30 ميكرولتر من الخرز في أنبوب microcentrifuge في RT (30 ميكرولتر من الخرز / 1 مل المحللة الجنينية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات على مغناطيس، ماصة قبالة طاف، و resuspend حبات في استخراج العازلة polysome (500 ميكرولتر). جمع حبات على مغناطيس، إضافة المحللة الجنينية، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية على محور دوار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخرز والحفاظ على طاف على الجليد للخطوة immunopurification. قبل immunopurification، والحفاظ على 100 ميكرولتر من طاف (المدخلات) لمقارنة عينة الحمض النووي الريبي العالمية مع عينة الحمض النووي الريبي التي تم جمعها بعد immunopurification، من خلال RT-QPCR على سبيل المثال. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل (الموافق 60-80 ملغ / مل بروتين) ل-استيعابها قبل المحللة إلى أنبوب خالية من ريبونوكلياز تحتوي على 90 ميكرولتر من الخرز منعت بالإضافة إلى GFP الأضداد. احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع طيف خلط نهاية الإفراط في نهاية في محور دوار أنبوب. بدلا من ذلك، نفذ حضانة O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة، وجمع حبات على مغناطيس. استخدام minifuge لتدور باستمرار الخرز، resuspend ثم لهم في 500 ميكرولتر من غسل العازلة (HEPES 10MM، بوكل 350MM، MgCl 2 5MM، Nonidet P-40 1٪، DTT 0.5 ملم، سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل، ريبونوكلياز المانع 100 U ) وجمعها على المغناطيس. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير حبات لprechilled أنبوب ريبونوكلياز خالية الجديد ويغسل مرتين. جمع حبات على مغناطيس، والشروع في استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 1 مل TRiZol مباشرة إلى الخرز واتبع تعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> 7. RNA التنظيف وتقييم الجودة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدة RNeasy مايكرو حسب تعليمات الشركة الصانعة. في الإنجاز، elutالبريد RNA مع (س) ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه. دافئ لمدة 2 دقيقة عند 60 درجة مئوية، وتخزين العينات المجمدة الإضافية في -80 ° C. تحقق RNA الجودة باستخدام bioanalyzer (اتبع تعليمات الشركة الصانعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار خصوصية TRAPed RNA، نفذ النسخ العكسي في 3 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى (المدخلات وIP) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (مرتفع III). استخدام كدنا] التي تم الحصول عليها عن QPCR باستخدام مجموعات التمهيدي الجينات المحددة. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

توضح هذه الورقة المعدلة الترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية البروتوكول (يطلق عليها اسم &quot;TRAP-الصليب الأحمر&quot;) مخصصة لدراسة السكان الخلية نادرة في الأجنة ذبابة الفاكهة. يتم توفير معلومات عن الخطوات الرئيسية لعزل ناجحة من الحمض النووي الريبي معين مع تحقيق عائد مناسب لميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها، أي 1) كمية من المواد البيولوجية المطلوبة وإجراء الأمثل للتحلل الجنين واستخراج polysome. 2) الخرز / نسب للمناعي الأمثل المحللة الأجسام المضادة ل؛ 3) خطوات السماح الحد من الخلفية بما في ذلك غسل تكوين عازلة وذلك لتشغيل تجارب TRAP RC مع خصوصية عالية وحساسية. هذا البروتوكول غلة البيانات استنساخه مما يجعل تطبيقها بسهولة إلى أي نوع من أنواع الخلايا الأخرى. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لتحليل الفرق التعبير الجيني على مستوى مرنا بنشاط-ترجمة وبالتالي تمهيد الطريق لفهم البروتين التعبير في المواصفات<html> IFIC نوع من الخلايا في إطار زمني محدد. ومع ذلك نلاحظ أن وفرة البروتين سيعتمد على معدل عمليات الترجمة والتدهور. العيوب الرئيسية للطريقة TRAP هو عدم قدرتها على قياس محتوى البروتين بطريقة كمية دقيقة أو للكشف عن تعديل آخر متعدية. يمكن تحسين الكمي عن طريق قياس كثافة الريبوسوم على طول الجسم مرنا، وعند القيام بذلك، بطريقة الخلية من نوع معين جعل TRAP جنبا إلى جنب مع الريبوسوم البصمة أداة قوية جدا. في ورقة حديثة 34، تم إجراء هذا المزيج في الجنينية الكلى 293 الخلايا البشرية. ونشرت الكتاب البصمة نوكلياز تليها تنقية تقارب من شكل المعقدة البيروكسيديز محرض من RpL10A باستخدام الخرز streptavidin. هذا هو دليل على مبدأ أنه من الممكن لأداء البصمة الريبوسوم في الحي كله في حين استهدفت نوع خلية معينة، وتقييد يجري كمية المواد البيولوجية اللازمة لهذا الغرض. &quot;&gt; إجراء التجارب TRAP بالتوازي مع التحليلات transcriptomic العالمية سوف تجعل من الممكن لتتبع النسب بين حديثا كتب وactively- ترجمة RNA، وهذا سيكون بالمعلومات عميق لآليات ما بعد النسخي المحتملة التي تجري في سياقات تنموية محددة أو السكان خلية معينة microRNAs بقلم على سبيل المثال. في الختام، TRAP يعد طريقة فعالة للغاية ومحددة وحساسة لتحديد الرنا بد أن بنشاط-ترجمة ريبوسوم بطريقة خلية محددة. هذه الطريقة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية وأنواع الأنسجة. وكان محسن بروتوكول TRAP-الصليب الأحمر الجديد هو موضح هنا للالسكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا) وكمية من المواد النهائية كافية للتحليلات لاحقة على مستوى كامل الجينوم. A الحد الممكن من هذا الأسلوب هو شرط دافعا قويا لإنتاج ريبوسوم الموسومة في كمية كافية لتراكبمؤسسة التدريب الأوروبية بأخرى لازال المحلية في نوع من الخلايا المستهدفة. في دراسة حديثة 25، قدرت الكتاب إلى 10-30٪ نسبة الموسومة مقابل ريبوسوم لازال. للتغلب على هذه المشكلة زيادة UAS-RpL10A-EGFP عدد نسخة من شأنه أن يحسن بشكل كبير هذا التوازن. بدلا من ذلك، إضافة إلى خلفية وراثية وصف التحوير UAS-GAL4 وتضخيم إنتاج البروتين GAL4 وغير مباشرة زيادة التعبير عن RpL10A-EGFP. وهذا ينبغي أن تحبذ عقد الإشغال أفضل للريبوسوم الموسومة على مرنا. لاحظ أن هذا نهج فعال بالفعل ويمكن إجراء أكثر قوة وتكييف الأساليب المكملة لجلب المزيد من الجانب الكمي أو لاكتشاف وكشف الآليات الجزيئية التي تعد ضرورية للسيطرة على التعبير الجيني.

فهم كيفية الخلايا تكتسب خصائص محددة خلال التنمية أمر بالغ الأهمية من أجل إدراك تعقيد الأجهزة وتطورها المحتمل تجاه الحالات المرضية. هناك دفعة كبيرة لبحث فك شبكات الجينات التنظيمية تشكل أساس مواصفات الخلايا والتمايز التي كتبها unrevealing ملامح التعبير الجيني العالمية، ووضع ملزمة بول الثاني، شغل النسخ عامل في تسلسل التنظيمية أو التعديلات بعد متعدية من الهستونات. لتقييم التعبير الجيني في ميكروأرس على الصعيد العالمي وتستخدم نهج RNA وما يليها. ميكروأرس تسمح للكشف عن وفرة مرنا، في حين RNA وما يليها هو أفضل موجهة لإعلام على أنواع مختلفة من الرنا بما في ذلك الترميز وغير المرمزة noncoding الموجودة الرنا مثل microRNAs، lncRNAs أو snRNAs. ومع ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا تفرق نسخه بنشاط، حالة استقرار مرنا، بنشاط-ترجمة مرنا، ومرنا دخول عملية التحلل. قياس ثابت-شارع<html> تناولوا مستويات مرنا أنه من المعروف أن تقدير ضعف تكوين بروتيوم 1-3. في العكس من ذلك، تحديد بنشاط-ترجمة مرنا يعطي صورة أكثر دقة لإنتاج البروتين. ومع ذلك، فقد تم أساسا أدت الدراسات transcriptomic على مستوى كامل الحي من خلال مقارنة بالربح أو الخسارة من وظيفة عامل محدد لمن النوع البري شرط 4-7 أو على تشريح الأنسجة، مما يجعل ملامح التعبير الجيني يصعب تفسيرها. التطورات الحديثة في أدوات استهداف الخلايا، وتنقية تقارب وتحسن حساسية تسمح الآن لإجراء تحليلات واسعة الجينوم على السكان خلية أو خلايا صغيرة حتى واحدة في الكائن الحي. في ذبابة الفاكهة، مجموعات كبيرة من خطوط المعدلة وراثيا تمكن محددة تستهدف الزمني والمكاني من الأنسجة المختلفة والفئات السكانية الخلية عن طريق نظام GAL4 / UAS 10/08 العائد الكمي أكثر دقة من الآليات الجزيئية المطلوبة لوظيفة الخلية. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; ومن بين المناهج المطورة حديثا polysome وقد وصفت التنميط التي كتبها تجزئة كوسيلة لالتقاط بنشاط-ترجمة RNA 11. هذا الأسلوب يعتمد على السكروز التدرج الطرد المركزي يسمح اختيار جزء polysome وتحديد مرنا ترجمت على نطاق الجينوم عند تحليلها مع ميكروأرس أو التسلسل عميق. ويمكن أن يقترن Polysome العزلة مع نوكلياز الهضم لتحديد آثار أقدام الريباسي المقابلة لشظايا الحمض النووي الريبي التي يحميها ريبوسوم خلال عملية الترجمة 12. البصمة الريباسي يزيد من دقة التحديد الكمي للترجمة RNA وقرار RNA على مستوى تسلسل وتحديد المواقع الريبوسوم، يجعل من الممكن لقياس معدل الترجمة. إلا أنه حتى اليوم لم يتم تطبيقه على عزل خلية محددة من translatomes، ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض قوي في الغلة RNA التي تم الحصول عليها في نهاية عملية البصمة الريبوسوم. وبالنظر إلى أن اختيار حجم RNA قد تولد المحتملين كاذبة صositives من RNPs المختلفة التي يمكن أيضا حماية RNA بطريقة مماثلة، وهناك حاجة إلى مزيد من التطورات لتحسين الريباسي البصمة وتكييفها مع النهج خلية محددة. واحد من هذه الأساليب، ودعا وصفت في ترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية (TRAP) في عام 2008 من قبل هيمان وآخرون. وتطبق على عزل translatome من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الفئران. قبل حاتمة العنونة بروتين الريباسي بطريقة الخلية من نوع معين، polysomes يمكن تنقيته بشكل انتقائي دون خطوة شاقة من التفكك الخلية والفرز. في هذه الحالة، 60S البروتين الريباسي L10a على سطح الريبوسوم كانت المعلمة مع EGFP 13. منذ عام 2008، وقد استخدمت العديد من الدراسات هذه الطريقة في أنواع مختلفة من الفئران 14-19 إلى العاشرة المورق 20،21، 22،23 الزرد ونبات الأرابيدوبسيس thaliana 24. كما تم تكييف طريقة TRAP للنموذج ذبابة الفاكهة وتستخدم لبوريمن mRNAs من الخلايا العصبية 25 و 26 النجمية السنة المالية المحددة من نوع الخلية. تم استخدام ثنائي نظام GAL4 / UAS متعددة للتعبير عن RpL10A GFP الموسومة بطريقة الأنسجة محددة. تم تشريح رؤساء الذباب الكبار لأداء اختيار polysome من الخلايا العصبية (التي تستهدفها عموم العصبي سائق Elav-GAL4) والرنا المعزولة والتسلسل. يتفق عدد كبير من الجينات تنظم يصل إلى أن يعرف أن يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي، مشيرا إلى أن النهج خصوصية جيدة ودفع لنا لتكييفه مع السكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من الخلايا) الحاضر في وضع الأجنة ذبابة الفاكهة . ضمن نموذج ذبابة الفاكهة، والمرحلة الجنينية هي نموذج للاختيار لدراسة العمليات التنموية، والجهات الفاعلة الجزيئية والحركات التخلق يتم حفظها التطورية. وقد تم تنفيذ النهج transcriptomic الوحيدة الأنسجة محددة التي أجريت حتى الآن في هذا النموذج باستخدام خلايا أو حتى النوويةrting وكانت فقط قادرة على دراسة Transcriptome على الحالة المستقرة 27-31، وخلق الحاجة إلى طرق مخصصة لالأنسجة / خلية محددة translatome التنميط في الجنين الطاير. نحن هنا تقرير أول بروتوكول TRAP مخصصة لأجنة ذبابة الفاكهة. مع هذا الأسلوب، وتشارك في الترجمة مرنا في السكان الخلية محدودة جدا من حوالي 100 خلايا العضلات في جنين تم عزل بنجاح مع جودة عالية وخصوصية. يتم استخدام GAL4 / نظام UAS ثنائي لدفع التعبير عن RpL10A الموسومة GFP في حيوانية من العضلات دون أي سمية، لا الظواهر الواضحة أو تأخر في النمو كما هو موضح سابقا 25. أجنة ذبابة الفاكهة تمتلك 30 العضلات في hemisegment التي من شأنها أن تؤدي إلى الجهاز العضلي من اليرقة. باستخدام المنطقة التنظيمية التي اكتشفت في المنطقة المجاورة للهوية الجينات ترهل، 6 من 30 العضلات متعددة الأنوية هي المستهدفة. في هذا الاختبار، وثبتوا ريبوسوم على مرنا باستخدام استطالة الترجمةالمانع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم استخدام مقتطفات عصاري خلوي لتنقية تقارب مع حبات مغناطيسية المغلفة الأجسام المضادة GFP. تم التحقق نوعية RNA تنقيته باستخدام bioanalyzer. وقد استخدم الكمي عكس النسخ PCR (RT-QPCR) لتحديد خصوصية وحساسية مرنا العزلة وأثبتت أن لدينا بروتوكول الأمثل هو كفاءة عالية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

ويتكون نظام العضلات الجسدية الجنينية ذبابة الفاكهة من 30 العضلات في hemisegment، وكل العضلات لديها مجموعة محددة من خصائص: كود الجينات الهوية، والموقف، وعدد من الفعاليات الانصهار، ومواقع الحجز وتعصيب. وتحديد ترجم مرنا في مجموعة فرعية محددة من العضلات إعطاء معلومات عن البروتينات اللازمة لتشكيل هذه الخصائص محددة من العضلات. باستخدام طريقة القائم على TRAP، RNA من جزء من السكان من عضلات التعبير عن ترهل الجينات الهوية وتنقيته (الشكل 1A-B). ومصدر القلق الرئيسي لهذا النهج هو نوعية وخصوصية الحمض النووي الريبي معزولة. بروتوكول الأمثل ذكرت هنا مكن انتعاش منهجية عالية الجودة RNA المقررة مع التحليل bioanalyzer. وتظهر الصورة التي تم الحصول عليها أي تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 1C). في الدراسات التي وضعت حول طريقة TRAP، أثيرت تساؤلات بشأن خصوصية البيانات. هنا نحن طmprove طريقة لقمع الخلفية المرتبطة ملزم من الحمض النووي الريبي لحبات أو أنابيب غير محددة والاستفادة المثلى من غسل العازلة. من أجل تقييم مستوى الخلفية وكفاءة عزل الخلايا، معربا عن ترهل، ونحن أدت التجارب RT-QPCR على 3 مكررات من نفس المرحلة الجنينية. أضعاف التخصيب من 4 جينات مختلفة (mef2، ترهل، بروسبيرو، soxNeuro) حسبت مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32 (1D الشكل). وأظهرت هذه النتائج تخصيب 2.3 أضعاف من mef2 الجينات عموم العضلات وتخصيب 5.6 أضعاف من الجين ترهل. في المقابل، الجينين أعرب في النظام العصبي وقد المنضب مقارنة المدخلات. لوحظ تغيير القيم أضعاف مشابهة جدا على 3 مكررات البيولوجية، مما يدل على أن البروتوكول هو القوي. مع سائق التهدل-GAL4 وبدءا من 1.5 غرام، حول 1.5x10 ^ 6 أجنة تم الحصول عليها التي تحتوي على 100 خلية GFP / جنين (ما مجموعه 150 × 10 ^ 6 إيجابيةالخلايا). بعد تشغيل التجربة TRAP، العائد حوالي 25-45 نانوغرام من الحمض النووي الريبي محدد اعتمادا على مرحلة من الفائدة. هذه المواد هي كافية لتشغيل تحليل ميكروأري أو RNA وما يليها باستخدام بروتوكول التضخيم لبناء مكتبة RNA وما يليها. سوف الكفاءة تعتمد بشدة على قوة السائق تستخدم للتعبير عن RpL10A-EGFP. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> الشكل 1. الجودة وتقييم نوعية من الحمض النووي الريبي معزولة TRAP من التهدل-GAL4&gt; الأجنة UASRpL10A-EGFP. (AB) صور متحد البؤر لمرحلة 16 الجنين تظهر RpL10A-EGFP التعبير على وجه التحديد في ست خلايا العضلات التهدل في hemisegment (A). لوحظ شارك في توطين RpL10A-EGFP مع الجنرال علامة العضلات Beta3tubulin على الصورة دمج (B). (C) مراقبة الجودة من TRAPed RNA ران على bioanalyzer تبين سلامة مثالية للالريباسي 18S 28S و. تحليل (D) RT-QPCR يظهر نوعية عالية من التجارب مرنا معزولة TRAP في 3 مكررات البيولوجية المرحلة 16 الأجنة. ويتم احتساب تغيير أضعاف مقارنة المدخلات وتطبيع ضد الجين RpL32. Mef2 النصوص موجودة في كل الأنساب العضلات هي إثراء 2.3 أضعاف مقارنة لإدخال النصوص في حين ترهل أكثر تقييدا ​​هي المخصب 5.6 أضعاف. تنضب الخلايا العصبية معربا عن بروسبيرو والجينات soxN 2.2 أضعاف و 5.5 أضعاف على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (ن = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...