الكتاب مدينون بشكل خاص لهاريس وديبورا ماكاي دانيال. وقدم الدعم لهذا العمل من قبل دائرة علم الأحياء وكلية الآداب والعلوم CWRU ، وعبر منح عدد HHMI 52005866 لدعم التعليم الجامعي في مجال العلوم البيولوجية

1. التصوير المنهجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب الجليسرين هلام الاستحمام في 55 درجة مئوية الماء لمدة 20-30 دقيقة حتى يصبح سائلا متجانس. الدوامة ، ولكن لا يهز زجاجة لتجنب تشكيل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن يذوب الهلام ، وتطبيق طبقة رقيقة من الجلسرين باستخدام Kimwipe على شريحة زجاجية نظيفة (اختياري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1-1،5 مل من الجليسرين ذاب باستخدام هلام ماصة P1000 غيض قطع على سطح الشريحة لخلق طبقة رقيقة أولا. ماصة بعناية لتجنب الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ هلام لمدة 5 دقائق على سطح أفقي ، ثم ضع الشريحة في -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والشروع في محاذاة الجنين. بدلا من ذلك ، مع تغطية الشريحة التفاف ساران ووضعه في درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة قطرة صغيرة من الجلسرين الأجنة الملون في 70 ٪ / برنامج تلفزيوني أو غيره من antifade الجلسرين وسائل الاعلام المتزايدة (على سبيل المثال أو Slowfade Vectashield) على جانب من الفراش هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ قبل محاذاة الأجنة عن طريق نقل لهم بشكل فردي من الهبوط على سطح هلام. نقلها باستخدام إبرة تحت الجلد المائلة ، وذلك باستخدام الجانب مائلة كما ملعقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تقريبا على طول الأجنة 2-3 الأعمدة. إذا كان الجنين يحصل عالقا في الإبرة ، وإثارة ذلك في الانخفاض الذي يحتوي على أجنة أخرى لتحريرها. لا تضيعوا الوقت مواءمة بعناية عند هذه النقطة. ترك بعض المسافة بين الأعمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة الأجنة التي ينزلق عليها أفقيا على المدى المتوسط ​​هلام مع المعونة من الإبرة تحت الجلد. في حين ينزلق ، توجيه الرؤوس والذيول في نفس الاتجاه. جعلها موازية لبعضها البعض على طول العمود. إزالة الزائدة من الجلسرين PBS اليسار كما درب بقطعة من Kimiwipe الملتوية. ملاحظة : الجلسرين الزائد يؤدي إلى تكون الأجنة المغطى فضفاضة داخل الجل ، مما أدى إلى انفصال طبقات هلام اثنين ، مما يجعل من الصعب خفض وجبل. على العكس ، فإن إزالة الكثير من الجلسرين الجافة وتتسطح الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض قطع صفراء لانتشار طبقة رقيقة من هلام على الأجنة (50-150 ميكرولتر ، اعتمادا على كيفية العديد من الانحياز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة مكان في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة أو تخزينه في 4 درجات مئوية خلال الليل. تأكد من هلام جامدة تماما قبل عدة قطاعات. خلاف ذلك ، فإن كتلة من الأجنة يكون من الصعب جدا المكوس. ويتم الحصول على أفضل النتائج لقطع في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت نطاق تشريح ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع تماما من خلال هلام على كلا الجانبين من أجنة الانحياز. الاستمرار على شفرة حلاقة بزاوية 90 درجة لجعل التخفيضات على التوالي. وينبغي بذل تخفيضات قريبة جدا من القطبين الأمامي والخلفي من الأجنة الزائدة لتجنب هلام التي قد تعيق التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100-200 ميكرولتر من PBT الباردة (4 درجات مئوية ، في برنامج تلفزيوني +0.1 ٪ توين 20) المقبل إلى خفض وكشط بعناية قبالة هلام بين أجنة باستخدام الملعقة. ملاحظة : والمنظفات في PBT يساعد على إزالة هلام من الشريحة دون الإضرار الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة ، ونقل كتلة من الهلام مع جزءا لا يتجزأ من الأجنة إلى شريحة نظيفة لقطع أخرى. قطع كتل صغيرة مع الأجنة 5-7. استخدام PBT من التحرك بسهولة حول الكتلة الهلامية. بدلا من ذلك ، وضع كتلة على سطح الزجاج الجافة لندعه نعلق على الزجاج ، مما يخلق المزيد من الاستقرار لتقليم بدقة وهلام ، واذا لزم الامر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه تستقيم الأجنة جزءا لا يتجزأ من هلام مع المعونة من شفرة الحلاقة وإبرة. لتصور تحت المجهر ، والمضي قدما مع أي واحدة من الخطوتين التاليتين ، اعتمادا على نوع المجهر الوقوف المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهر مقلوب : الانتهاء من وضع الجنين في الصعود إلى كتل ساترة طويلة ، مع الأجنة في وضع مستقيم. تأكد من أن الجانب الجنين مع أقل قدر من هلام ستكون في اتصال أوثق مع الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهر تستقيم : تقديم اثنين من مداخن مع coverslips # 1 four صقها مع superglue لاستخدامه ك &quot;يدعم&quot; ووضع الجنين في كتلة الجلسرين في بين &quot;تؤيد&quot;. جسر الكدسات باستخدام ساترة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل مبائر ، والتحقق من مسافة عمل الأهداف التي يمكن استخدامها لمعرفة ما إذا كان يمكنك صورة كل وسيلة من خلال الجنين أو جزئيا فقط. على سبيل المثال ، D. وقد الأجنة melanogaster ~ 0.55 ملم في الطول ، ويمكن تصوير تماما باستخدام زايس 20X بخطة آبو أو 40X LD الهدف النيو فلور. الموقع التالي يحتوي على معلومات عن أهداف زايس المتاحة ويعطيك الخيار للبحث الأهداف وفقا للمسافات العمل : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. ممثل النتائج لأن ترك أجنة سليمة ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لاجراء قياسات دقيقة لحجم الجنين والمسافات بين أنماط التعبير الجيني. في الشكل 1 ، ونحن أجنة تظهر مرحلة الأريمة ملطخة دابي وصمة النووي (الأزرق) ، ومكافحة الظهرية البروتين (الحمراء) ، مرنا SOG (الصفراء) والتحالف الوطني الصومالي مرنا (الخضراء). المورفولوجية بروسسSES ، يمكن مثل انغلاف من الأديم المتوسط ​​(الشكل 2A ، B) ، والهجرة من خلايا أرومية متوسطة (الشكل 3 و 4) كما تصور أن استخدام هذا الأسلوب. ويمكن الحصول على وظائف مختلفة Z - DV على طول محور طريق تغيير الطائرة التنسيق ، كما هو مبين في الأرقام 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. شريحة تستقيم البصري للجنين في مرحلة الأريمة سليمة. تلطيخ مزدوج لمرنا والبروتين. يشار mRNAs هدفا لتحقيقات في الموقع (مجموعة العمليات الخاصة والتحالف الوطني الصومالي) والبروتين التي اتسخت بسبب الأجسام المضادة الأولية (المضادة للالظهرية) في الشكل. كان يستخدم لتسمية دابي النوى. علما أن تقع على التعبير عن مجموعة العمليات الخاصة والتحالف الوطني الصومالي apically في السيتوبلازم ، في حين أن التعبير عن الظهرية والنووية. ويمكن أيضا إشارات قوية من النصوص SOG الوليدة الموجودة في نوى أن ينظر في هذا التكبير. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تحقيقات مرنا التصوير تستقيم من الجنين سليما gastrulating. المستعملة ويشار إلى الألوان كل منها في الشكل. أ) يتم التعبير عنها لاحظ أنه في هذه المرحلة ، ثلاثة جينات ملطخة ثر نفسه (SNA ، SOG والنيابة العامة ، والأخضر) ، في مجالات يفصل مكانيا. والأديم المتوسط ​​invaginating عن SNA ، وطبقة neuroblast عن دائرة الهجرة والجنسية والأديم الظاهر عن النيابة العامة ، في حين SOG التعبير لا تزال موجودة في مناطق البطني للجهاز العصبي. ب) في طائرة مبائر أعمق من الجنين نفسه ، نلاحظ قاعدة الأديم المتوسط ​​invaginating بقوة عن نظام الحسابات القومية ، ولكن منطقتها القمي عن أدنى المستويات. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. مددت رأسي من تصوير الجنين سليما مع الفرقة الجرثومية SOG الحمض النووي الريبي (الأصفر) ؛ الحلزون ، الهند وmRNAs DPP (الخضراء) والبروتين الظهرية (الحمراء). وكانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). أ) بالقرب من الطائرة البؤري رئيس الجنين. ب) طائرة أخرى للتنسيق في المنطقة جذع الجنين نفسه. علما الشامل خلايا أرومية متوسطة قبل الهجرة الجانبية (مقارنة الشكل 4) الكذب على مقربة من خط الوسط البطني على جانبي الجنين الجرثومية الفرقة الموسعة. وصفت neuroblasts Delaminating باللون الأخضر (دائرة الهجرة والجنسية وSNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تستقيم تصوير الجنين سليما خلال تمديد الفرقة الجرثومية SOG الحمض النووي الريبي (الأصفر) ؛ الحلزون ، الهند وmRNAs DPP (الخضراء) والبروتين الظهرية (الحمراء). أ) لاحظ neuroblasts delaminating من الظهارة (السهم) ، على حد سواء الملون للصناعات والتحالف الوطني الصومالي في هذه المرحلة (الخضراء). نلاحظ أيضا التعبير مقيدة من مجموعة العمليات الخاصة في خط الوسط بطني (الصفراء). ويمكن رؤية التعبير عن النيابة العامة في هذه المرحلة في الجانبين الوحشي للجنين (النجمة). ب) القسم البصري في الجنين نفسه يظهر في قرب نهاية طول الجنين ، وهو ما يقابل منتصف الخلفي المنطقة. هي ملطخة الخلايا البطنية خط الوسط لمجموعة العمليات الخاصة.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يمكن التقاط صور المقطع العرضي للأجنة ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون تحديا ، لأنه يتطلب إما تشريح دقيق لجهة شرائح 2 أو استخدام وسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من لتجهيز مشراح ، التي عادة ما تكون مضرة لstainings الفلورسنت. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Z - مداخن المحرز في متحد البؤر المجهر لجعل إعادة الإعمار 3D عبر قسم الصور. ومع ذلك ، فإنه يستغرق وقتا طويلا لجعل عدة شرائح رقيقة متحد البؤر لإعادة الإعمار و 3D دقيقة وphotobleaching يصبح إشكالية. مصدر آخر للقلق عند الأجنة التصوير التي تقام طوليا هو تشتت الضوء الذي يحدث عند الوصول إلى أعمق أجزاء من الجنين ، مما يعقد أيضا أخذ قياسات دقيقة للإشارات الفلورسنت لغرض تقدير مستويات بروتين تعبير أو مرنا 1. حتى مع وجود مجهر ثنائي الفوتون مبائر ، تشتت الضوء لا يزال مصدر قلق نظرا لغموض المادة صفار في منتصف الجنين ، مما يجعل اختيار وسائل الإعلام عن تزايد الشفافية المثلى من العينة أن تكون محدودة. للتحايل على هذه المشاكل ، وهي تقنية جديدة تسمى &quot;النهائي على&quot; تصوير الأجنة المواقع عموديا وضعت مؤخرا لصورة كل من يعيش وعينات ثابتة 4. في هذه الورقة ، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للأجنة عموديا الذي يسمح لإعداد تصور بسيط وثابت للأجنة أو أنسجة من أي حجم والشكل الذي هي ملطخة تحقيقات متعددة في الموضع 3. تتكون لدينا وسيلة لاستخدام وسائل الإعلام مع تصاعد الاتساق هلامي التي تستخدم لمحاذاة يغلف الاجنة في داخلها. يمكن وضع قطع من كتل هذه الوسائط التي تحتوي على أجنة متزايدة جزءا لا يتجزأ من تستقيم قبل التصوير في أي نوع من متحد البؤر المجهر. عن طريق تضمين الأجنة في هلام ووضعهم عموديا ، ونحن قادرون على اتخاذ المقاطع العرضية الأفقية باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتي تعرض الخلايا على طول المحور الظهري البطني للجنين في وقت واحد. هذا هو تحسنا كبيرا منذ لأغراض القياس الكمي مشاكل تشتت الضوء وphotobleaching من الأصباغ الفلورية التي تحدث في إعادة الإعمار Z - المكدس التقليدية للأجنة التي شنت طوليا يتم القضاء الآن. وهكذا ، القياس الكمي لمستويات التعبير الجيني أو البروتين على طول المحور الظهري البطني غير دقيقة ، حيث يتم تصوير الخلايا الموجودة في مواقع الظهري البطني العكس في نفس الوقت وعلى نفس مبائر Z - الموقف. بالإضافة إلى ذلك ، وصف الأسلوب يتيح لنا الحصول على كامل 2 - D صورة عبر المحور الظهري البطني من جنين 3 - D من دون استخدام أساليب معقدة تتفتح الحسابية لتصور خلايا في مواقع مختلفة على طول المحور DV 6. بعض الخطوات الهامة تشمل إزالة الزائدة بعد الجلسرين محاذاة الأجنة ، لتجنب الانقسام بين طبقتين من جيلي. ومع ذلك ، إذا كانت العينة المجففة جدا ، فإن الصورة الناتجة تكون ممسوخ والتشكل وغير صحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم خفض متوسط ​​هلام حول الجنين في زاوية مستقيمة بدلا من ذلك ، قد تظهر الصورة الناتجة أقل المستديرة وأكثر في شكل البيضة ، ويرجع ذلك إلى وضع غير صحيح من الأجنة في زاوية أخرى من 90 درجة. أخيرا ، إذا لم يتم خفض هلام عن كثب بما فيه الكفاية لالجنين على نهايات الأمامي / الخلفي ، فإنه ليس من الممكن الحصول على صورة مناسبة لأن تكون المسافة الهدف يعمل تستخدم أساسا للتركيز في هلام وليس الجنين. خطوة هامة أخرى قد تكون ضرورية عند تصوير الجنين في وقت متأخر gastrulating هو فرز دقيق للمراحل ضمن نطاق الاهتمام قبل مواءمتها. عادة ، يتم وفقا لنظم الأجنة الصفات المورفولوجية التي يمكن بسهولة المعترف بها عندما تكون في وضع يمكنها الطولية. من بين التعديلات البديلة التي يمكن إجراؤها مع هذا الأسلوب هو كاشف لتشمل مكافحة تتلاشى (على سبيل المثال ف Phenylenediamine أو PPD) في الطبقة الثانية من هلام للمساعدة في حماية ضد photobleaching من الأصباغ الفلورية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

عدة معروفة تخلقية التدرجات والحركات الخلوية يحدث على طول المحور الظهري / البطنية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين. ومع ذلك ، فإن التقنيات الحالية المستخدمة لعرض مثل هذه العمليات محدودة نوعا ما. بروتوكول التالية توضح تقنية جديدة لتركيب ثابت والمسمى<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أجنة للعرض مع التصوير مبائر الاكليلية. يتكون هذا الأسلوب من تضمين الأجنة بين طبقتين من وسائل الاعلام هلام الغليسرين المتصاعدة ، وشرائط التصوير هلام المتمركزة في وضع مستقيم. الخطوة الأولى ليقحم الأجنة هو جعل الفراش رقيقة من هلام الغليسرين على شريحة. المقبل ، يتم محاذاة الأجنة بعناية على هذا السطح ، ومغطاة بطبقة ثانية من جيلي. بعد توطد الطبقة الثانية ، يتم قطع شرائح من هلام وانقلبت تستقيم للتصوير. موصوفة بدائل لتصور الأجنة تبعا لنوع من الوقوف المجهر لاستخدامه. حيث يتم تصوير كل الخلايا على طول المحور الظهري البطني داخل احد مبائر Z - الطائرة ، لدينا وسيلة تسمح للقياس والمقارنة الدقيقة للإشارات الفلورسنت دون تشتت الضوء أو photobleaching مشتركة لإعادة بناء 3D الأجنة التي شنت طوليا.

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Embryos

هنا نطرح على بروتوكول لتصاعد الملون<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة في وضع رأسي يسمح التصوير من المقاطع العرضية باستخدام المجهر متحد البؤر.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K Views.  Case Western Reserve University. هنا نطرح على بروتوكول لتصاعد الملون ذبابة الفاكهة الأجنة في وضع رأسي يسمح التصوير من المقاطع العرضية باستخدام المجهر متحد البؤر.

Video: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

تعيش تشريح ذبابة الفاكهة الأجنة : طرق مبسطة للفحص من قبل مجموعات المسخ تلطيخ جسم

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...