يمكن أن تساعد هذه الطريقة في اكتشاف سمية العظام التي تسببها المواد الكيميائية في الزرد. أليزارين الأحمر يولد تلطيخ الأنسجة الثابتة سجلا دائما للتغيرات الهيكلية التي يمكن أن تسهل مقارنات عدة عينات. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لدراسة هشاشة العظام في نموذج الزرد ، لأن إحدى خصائص هشاشة العظام هي انخفاض كتلة العظام.
قم بإزالة 10 يرقات من أسماك الزرد بشكل عشوائي من كل مجموعة بعد تسعة أيام من الإخصاب ، وقم بتثبيت الأسماك في ملليلتر واحد من 2٪ ألدهيد بارافورم و 1X PBS لمدة ساعتين. صب المحلول واغسل يرقة الزرد باستخدام 100 ملليمولار تريس هيدروكلورايد مع درجة حموضة 7.5 أو 10 مليمولار كلوريد المغنيسيوم. لإزالة البقع ، صب المحلول واحتضان اليرقة لمدة خمس دقائق في سلسلة من الحلول كما هو موضح في المخطوطة.
بعد الحضانة النهائية ، صب المحلول وإزالة الصباغ عن طريق التبييض بمحلول يتكون من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين و 0.5٪ هيدروكسيد البوتاسيوم. لاحظ مرة واحدة كل 10 دقائق حتى تتم إزالة الصباغ تماما. شطف يرقة الزرد عدة مرات مع 25 ٪ من الجليسرين ، 0.1 ٪ هيدروكسيد البوتاسيوم لمدة 10 دقائق لكل منهما حتى لا تكون هناك فقاعات.
وصمة عار في اليرقة عن طريق نقع في ملليلتر واحد من 0.01 ٪ اليزارين. صب المحلول ، وأضف ملليلتر واحد من 50٪ جليسرين أو 0.1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم لمسح الخلفية. قم بتخزين السمك في 50٪ جليسرين طازج أو 0.1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم للمراقبة اللاحقة.
انقل يرقة واحدة في كل مرة على الشريحة الزجاجية مع إبقاء اليرقة في منتصف قطرة السائل. مراقبة اليرقة تحت مجهر ستيريو. قم بتشغيل الكاميرا.
افتح البرنامج واحتفظ بالإعدادات الافتراضية. انقر فوق AE واختر وقت التعرض المناسب للحصول على أفضل صورة. التقط جميع الصور تحت نفس الإعدادات.
احفظ الصور بتنسيق dot tiff لتحليلها لاحقا. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز imageJ. لتحليل الصور المحفوظة ، انقر فوق ملف ، ثم افتح ، ثم انقر فوق الصورة ، ثم اكتب وحدد ثمانية بت.
انقر فوق تحرير ، وعكس. انقر فوق تحليل ، ثم معايرة. حدد التطوير التنظيمي غير المعاير في الواجهة المنبثقة.
تحقق من المعايرة العامة في الجزء السفلي الأيسر من الواجهة السفلية ، وانقر فوق موافق. انقر فوق تحليل ، واضبط المقياس ، ثم قم بإزالة المقياس. تحقق من العالمية أدناه ، وانقر فوق موافق.
انقر فوق تحليل ، ثم اضبط القياسات. حدد منطقة العنصر في الواجهة المنبثقة. تحقق من الحد الأدنى أدناه لقياس النطاق المحدد فقط ، وانقر فوق موافق.
انقر فوق الصورة ، واضبط ، ثم العتبة ، وحرك شريط التمرير في منتصف الواجهة المنبثقة. لتحديد العتبة المناسبة بحيث يتم تحديد جميع الأهداف المراد اختبارها في صورة واحدة. وانقر فوق تعيين.
انقر فوق تحليل ، ثم قم بالقياس ، واحفظ التواريخ. Alizarin Red Staining هي طريقة حساسة ومحددة لقياس التغيرات في تمعدن العظام في يرقات الزرد. في تسعة أيام بعد الإخصاب ، يتم تمعدن العديد من عظام الهيكل العظمي للرأس مثل parasphenoid و opercular و ceratobranchial و notochord وبالتالي ملطخة باللون الأحمر.
في المقابل ، تظهر الهياكل غير العظمية مثل otoliths باللون البني الأسود. أظهر التحليل الرقمي الذي تم إجراؤه لتحديد إجمالي المساحة الملطخة انخفاضا كبيرا في المنطقة الملطخة ل 10 و 20 ملليغرام لكل لتر من مجموعات معالجة أسيتات الرصاص. أظهرت التغييرات في تمعدن العظام الاعتماد على الجرعة.
للحصول على تأثير تلطيخ وملاحظة أفضل ، من المهم إزالة الصبغة الأصلية ليرقات الزرد ، وإزالة الفقاعات بعد التبييض.
