وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL44485 وHL28607.

بيان الأخلاق: تم استعراض جميع الإجراءات واعتمادها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. 1. تصنيع أولي بال micropipettes، Restrainers، والحاجزون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب عدة أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية نظيفة في نصف باستخدام مجتذب الإلكترونية تعديلها بحيث، عند سحبها، الجزء الممتد من الأنبوب حوالي 1 سم في الطول ونصفين هما متماثل إلى حد ما. تأكد من أن تفتق يتسق مع الأبعاد في الشكل 1. استخدام كل شطر عن بال micropipettes، restrainers وحاصرات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطبة على بال micropipettes باستخدام الهواء يحركها طحن عجلة 30 مع 0.5 ميكرون ورقة جلخ استحم بالماء. ضبط زاوية من حامل micropipette بحيث تكون حوالي 30 درجة من الأفقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغسل وجفف بال micropipettes باستخدام الشفط لسحب الأسيتون النظيفة من خلال طرف ويصل رمح. تفقد بال micropipettes (الشكل 1A) باستخدام مجهر تستقيم صغير مع 4 × 40 × والأهداف مزودة حامل micropipette مقطع التمساح والشبيكة العدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر بال micropipettes مع تلميح افتتاح حوالي 50 ميكرون طويل مع شطبة طوله / نسبة العرض ما بين 3.1 و 3.5 و مع نقطة مدبب بشكل حاد مما يساعد على اختراق ألياف الكولاجين صعبة في مساريق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين 15-20 بال micropipettes بمساحات مختلفة قليلا في مربع خالية من الغبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل restrainers باستخدام الأنابيب الشعرية سحبت أعدت في الخطوة 1.1). عقد أنبوب زجاجي الشعرية سحبت لفترة وجيزة قرب microflame لتشكيل نهاية حادة (الشكل 1B). تخزين عدة في مربع خالية من الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل microoccluders باستخدام الأنابيب الشعرية سحبت أعدت في الخطوة 1.1). عقد الأنابيب الشعرية سحبت تحت microflame وبلطف ثني (باستخدام محول الأنابيب، على سبيل المثال، 23G) غيض غرامة (حوالي 4 ملم من غيض) لجعل زاوية ما يقرب من 120 درجة إلى رمح ( <sترونج&gt; الشكل 1C). جعل وتخزين عدة. </li></ol> 2. إعداد الحيوانية وجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذكور (350-450 جم) أو إناث فئران سبراج داولي (200-300 غرام) مع الصوديوم بنتوباربيتال (80-100 ملغ / كغ، سيغما الدريخ، P3761) عن طريق الحقن تحت الجلد. حماية مساريق عن طريق عدم استخدام الحقن داخل الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في جميع أنحاء العمليات الجراحية التجريبية والبروتوكولات، والحفاظ على التخدير عن طريق الحقن التكميلية (30 ملغ / كلغ) حسب الحاجة. تحديد عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص القدمين أو منعكس القرنية. بعد الانتهاء من إجراء التجارب، الموت ببطء الفئران عن طريق جرعة زائدة بنتوباربيتال أو الحقن داخل القلب من كلوريد البوتاسيوم المشبعة تحت التخدير. </li></ol> 3. إعداد حلول والكريات الحمر لاستخدامها بوصفها علامات تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الثدييات قارع الأجراس لsuperfusate وحل التحكم الإرواء (عادة الثدييات حل رينغر تحتوي على 10 ملغ / مل الأحماض الدهنيةالحرة ألبومين المصل البقري، BSA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح الإرواء من خلال 0.2 ميكرون مرشحات حقنة لإزالة الجسيمات الصغيرة التي قد منع غيض micropipette. تصفية في حاوية نظيفة صغيرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكريات الحمراء عن طريق رسم حوالي 0.2 مل دم من الوريد ذيل فأر تخدير في إبرة 20G على حقنة صغيرة تحتوي على 0.05 مل الهيبارين (1000 U / مل)، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على حوالي 14 مل الثدييات حل حل رينغر . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لحزمة بلطف خلايا الدم الحمراء (حوالي كحد أقصى 200 × ز لمدة 7 دقائق). رسم من طاف واعادة تعليق الخلايا الحمراء في حل رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي وإزالة طاف ثلاث مرات تترك الخلايا الحمراء معبأة في الجزء السفلي من أنبوب لاستخدامها لاحقا. لاحظ أن هذا الإجراء يقلل من الصفائح الدموية في perfusates النهائي إلى أقل من 0.1٪ من المستويات العادية 31. </li></ol></li></ol> 4. ترتيب الأنسجة على الحيوانصينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق البطن من الفئران تخدير من أسفل السرة إلى عملية الخنجري. تأكد من أن منطقة حلق تمتد في جميع أنحاء الجانب الأيمن (على الفئران وضعت على الجانب الأيمن) حتى أن الشعر لا تشكل الفتيل لرسم superfusate من الأنسجة بشكل جيد. إزالة الشعر قطع مع الشاش المبللة أو الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الجلد مع ملقط مسنن حادة وجعل شق خط الوسط (2-3 سم) من خلال الجلد باستخدام مقص قوي. باستخدام غرامة (القزحية) مقص جعل شق مماثل من خلال الخط ألبا، ورفع جدار البطن مع ملقط مسنن لتجنب إتلاف القناة الهضمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الحيوان على جانبها على علبة الحيوان، وسحب بلطف خارج القناة الهضمية من تجويف البطن باستخدام أدوات تطبيقها من القطن ذات الرؤوس (عصا خشبية) غارقة في حل قارع الأجراس وملقط مسنن حادة. ترتيب القناة الهضمية في الأنسجة بشكل جيد بحيث يتم رايات مساريق على عمود للعرض من خلال المجهر مع الحرص على تجنب لمس مساريق (بوتيهإتلاف ntially microvessels) مع أي ملقط أو القطن. ملاحظة: علبة الحيوان (الشكل 2A) يمكن بناؤها من زجاجي ويتطلب الأنسجة بشكل جيد (حوالي 3 ملم العميقة)، ركنا واضحا بصريا (على سبيل المثال، الكوارتز المصقول حوالي 2 سم ديا و 5 ملم عالية)، ومنصة الاحترار تعديل للحفاظ على درجة حرارة الحيوان. سمك عمود يجب ألا تتجاوز المسافة عمل الهدف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع علبة الحيوان على المسرح المجهر بحيث مساريق مرئيا من خلال العدسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع خط بالتنقيط بالجاذبية لsuperfuse باستمرار مساريق مع حل الثدييات رينغر الحفاظ على 35-37 درجة مئوية. استخدام قطع من الشاش لعقد الأمعاء في المكان، وتساعد على الاحتفاظ بالرطوبة، والفتيل حل الزائدة رينغر من السطح. ضبط تدفق ونضح المخلفات للحفاظ على سمك superfusate ثابت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الهدف microvessels venular، والتي هيقطاعات غير متفرع المصب من تدفق متقاربة، واحد أو اثنين من الفروع البعيدة إلى الشعيرات الدموية الحقيقية. العثور على سفينة غير متفرع (من الناحية المثالية، 600 إلى 1000 ميكرومتر في الطول) وجود تدفق الدم السريع وخالية من الخلايا البيضاء إصرارها على جدار الوعاء الدموي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اختبار microvessel في وسط الميدان المجهر ونقل رادع في موقف بالقرب من موقع إقناء؛ إدخال القنية المختار. </li></ol> 5. تعبئة Micropipette وجبل في حامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل cannulating، تعليق الخلايا الحمراء في الإرواء. إضافة 7 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء معبأة إلى 0.5 مل سائل الإرواء في نظيفة أنبوب اختبار البورسليكات. ملاحظة: Hematocrits من 1-3٪ يمكن استخدامها، ولكن سوف الهيماتوكريت ثابت يؤدي إلى تركيزات الإرواء متسقة من أي المواد التي تطلق من خلايا الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب حقنة 1 مل مع محول 23G أنابيب وأنابيب PE 50 (5-15 سم طول). رسم سائل الإرواء / أحمر خليط الخلية إلى المحقنة. عكس حقنة لخلط وطرد جميع فقاعات من أنابيب ومحول. لزيادة الكفاءة، وتناسب أنابيب لعدة الحقن قبل بدء التجربة والاحتفاظ بها في مربع مجانا الغبار أو كيس من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء micropipette من خلال دفع الأنابيب في نهاية كبيرة من micropipette حتى يتاخم المنطقة مدبب. تطبيق دفعة سريعة لطيف على المكبس حقنة لملء غيض micropipette. ملاحظة: هناك تيار صغير أو قطرات يجب أن يكون مرئيا في تلميح إلى أدلة تعبئة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الأنبوب في حين دفع بلطف على المكبس لملء جزء أوسع من رمح micropipette. إزالة الفقاعات الصغيرة في رمح واسع من قبل عبها بعناية رمح micropipette. ملاحظة: تم توضيح إجراء مماثل 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع micropipette في حامل ماصة مع منفذ الجانب الذي يسمح اتصال السائل المستمر لمقياس الماء. تأكد من أن حامل، والتي يتم تركيبها على محرك هيدروليكي تستخدم للسيطرة على النهوض بشكل جيد جدا من micropipette، هو في زاوية طفيف (15-25 درجة)إلى أفقي بحيث حافة تفتق micropipette لا تصل القناة الهضمية أو صينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب محرك هيدروليكي على micromanipulator المنقولة، التي لديها X، Y، Z ومحركات لتمكين محاذاة قريبة من وعاء الاختبار (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الضغط الهيدروستاتيكي تطبيقها على السوائل في micropipette باستخدام حقنة أو مملوءة بالماء لمبة المطاط لتغيير ارتفاع السوائل في عمود الماء لمقياس ضغط الدم إلى نحو 40 شركة بيت إدارة المال 2 O فوق مساريق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية في microvessel في أقرب وقت ممكن بعد ملء ماصة. خلايا الدم الحمراء تترسب في القاع من ماصة، وذلك بعد حوالي 40 دقيقة عدد قليل جدا من خلايا الدم الحمراء سوف تتدفق في الإناء. </li></ol> 6. Microcannulation والاوعية الدموية الدقيقة قياس الضغط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحديد المواقع micropipette شغل تحت المجهر، اضغط بلطف رادع على الأنسجة بالقرب من microvessel استخدام القوة الكافية لقبضة الأنسجة. رسمرادع الظهر، وتمتد قليلا الأنسجة تمشيا مع microvessel بحيث يتم الانحياز تشدد في ألياف الكولاجين المساريقي مع السفينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة micropipette مع السفينة وخفضه إلى عرض من خلال العدسات. مكان غيض فقط المنبع للموقع إقناء؛ إدخال القنية المختار وخفضه على النسيج بحيث يعرقل جزئيا التدفق داخل السفينة، ولكن لا تسد عليه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية السفينة من قبل القيادة طرف ماصة ببطء في التجويف سفينة باستخدام محرك هيدروليكي. يجب الحرص على عدم المضي قدما في الجانب السفلي من السفينة. ملاحظة: كما يدخل micropipette التجويف، والإرواء يغسل بسرعة الدم في الأوعية من التجويف وسائل الإرواء بحرية تدفقات للتداول القاصي الحيوان لاختبار microvessel مما أدى إلى تهجير بعض نضح الدم الطبيعي في الأوعية المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض ضغط التروية من خلال تعديل مقياس ضغط الدم إلى الدم (كما هو مبينبواسطة خلايا الدم الحمراء الحيوان) ويوجه مرة أخرى في الجزء perfused. يحدد هذا الضغط التوازن فيها خلايا الدم الحمراء تتذبذب برفق في التجويف السفينة ويقيس الضغط الهيدروستاتيكي microvessel (P ج) في نهاية البعيدة للقطاع microvessel. الحفاظ على سفينة نضح في كل الضغوط فوق هذا الضغط التوازن. </li></ol> 7. Microocclusion وجمع البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة اختيارية: قبل استخدام مطبق الصغير لمنع السفينة، اضغط عليه في الأنسجة في منطقة غير المستخدمة من مساريق بعيدا عن أي سفينة بحيث غيض يتراكم لوحة رائعة من الأنسجة التي تحمي السفينة التجريبية خلال الدقيقة المتكررة انسداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مانع فوق السفينة perfused بالقرب من الحافة السفلى من مجال المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل يلي مع الفيديو والصوت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فظيا تسجيل موقع لموقع كتلة وانخفاض حافة الشاشة كما يظهر من خلال الشبيكة العدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع طرفمن مانع وضعت للتو فوق microvessel، استخدام جهاز التحكم ض غرامة من micromanipulator لخفض بلطف مانع حتى يتم المغطي تدفق في السفينة. ملاحظة الضغط مقياس ضغط الدم (P ج) على الصوت. تطبيق انسداد عادة ل3-10 ثانية، ثم الإفراج عنهم، استعادة التروية مجانا. نقل الموقع كتلة تصل السفينة نحو غيض ماصة في 5-10 ميكرون خطوات على أساس الوقت (&gt; 5 دقائق بعد كتلة الأولي في موقع)، وعدد من انسداد (3-5)، لمنع سفينة أضرار الجدار في موقع كتلة . </li></ol></li></ol> 8. تحليل البيانات وقياس L ص (نفاذية المياه) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء تشغيل الفيديو، تحديد المسافة الأولية (ℓ 0) من خلية حمراء علامة لموقع الانسداد باستخدام صورة لميكرومتر المرحلة والمواقف المعروفة على الصور. تحديد السرعة الأولية (dℓ / دينارا) للخلية علامة من موقفها في عدة إطارات خلال ثانية 3-10 من الصور المسجلة. ردعالألغام في دائرة نصف قطرها السفينة (ص) من الصور التي التقطت خلال الانسداد (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب J ت / S لكل انسداد باسم (dℓ / دينارا) × (1 / ℓ 0) × (ص / 2). حساب L ص في الضغط المستمر باسم (J ت / S) مقسوما على ضغط القيادة (الضغط microvessel - الضغط الاسموزي الغروانية فعال، وانظر مناقشة). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تفاصيل L الحسابات ص. على الرغم من أن تحدث حركة السوائل transvascular بينما perfused السفينة بحرية، وهذا التبادل هو أبعد ما يكون صغير جدا بحيث لا يمكن قياسها خلال نضح الحرة لأنها عادة ما تكون أقل من 0.01٪ من معدل نضح السفينة. ومع ذلك، عندما نضح توقف عابر التي تسد microvessel، و?...

تروية دقيقة في الأوعية الدموية يستلزم إنشاء تسيطر تدفق وسائل الإرواء الاصطناعي للتكوين المعروفة عبر micropipette في أحد الأوعية الدموية عادة ما تكون أقل من 40 ميكرون في القطر. ولا تزال السفينة perfused ضمن بيئة الأنسجة الطبيعية، ويتم مع perfused الدم حتى الحيوان لوقت إقناء؛ إدخال القنية. عندما تستخدم بالاقتران مع مجموعة من تصوير الفيديو أو تقنيات فلوروميتريك، تروية دقيقة في الموقع يتيح قياس الماء والمذاب التدفقات عبر جدران microvessels في ظل الظروف التي لا يعرف القوى الدافعة لهذه التدفقات وخصائص نفاذية جدار الأوعية الدموية يمكن أن يكون تقييم مباشرة. وعلاوة على ذلك، من خلال التحكم في تكوين السائل المحيط microvessel في الأنسجة (الإرواء وsuperfusate)، وتنظيم نفاذية microvessel وتبادل يمكن التحقيق من خلال تمكين الخلايا البطانية التي تشكل الجدار microvessel أن تتعرض لمجموعة متنوعة من البريدشروط xperimental (منبهات، وظروف نضح تعديلها، مؤشرات لقياس الفلورسنت تكوين الخلايا والإشارات) لفترات قياسها بدقة من الزمن (ثانية إلى ساعة). بالإضافة إلى ذلك، التقييمات التركيبية أو cytochemical الهياكل الجزيئية الخلوية الأساسية التي تنظم حاجز يمكن التحقيق في نفس microvessels التي يقاس نفاذية مباشرة. النهج مما يشكل جسرا بين التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتعديل وظيفة حاجز غشائي في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانية والتحقيق في microvessels سليمة. راجع ما يلي استعراض لمزيد من التقييم 1-6. وجود قيود على تروية دقيقة هو أنه لا يمكن أن تستخدم إلا في سرير الاوعية الدموية الدقيقة التي هي رقيقة وشفافة ولها السلامة الهيكلية كافية لتمكين إقناء؛ إدخال القنية مع micropipette الزجاج. بينما التحقيقات في وقت مبكر تستخدم microvessels الضفدع في مساريق ورقيقة الجلدي الذبحة مuscle 7،8، حتى الآن إعداد الأكثر استخداما في نماذج الثدييات هو مساريق الفئران 9-15. وقد ركزت معظم الدراسات على التغيرات الحادة في نفاذية الأوعية الدموية درس على مدى فترات من 1-4 ساعة، ولكن تم تمديد مزيد من التحقيقات الأخيرة لقياسات على السفن الفردية 24-72 ساعة بعد نضح الأولي 12،16. التكنولوجيا كريسبر وضعت مؤخرا، والتي وعود لجعل نماذج الفئران المعدلة وراثيا أكثر المتاحة لدراسة الأوعية الدموية تنظيم نفاذية 17 ينبغي تمكين الطرق الموضحة في هذه الاتصالات ليتم تطبيقها في microvessels venular من مساريق في هذه النماذج الهامة الفئران الجديدة. يتطلب أسلوب مجهر مقلوب مجهزة مرحلة المجهر عرف بني كبيرة بما يكفي لاحتواء كل من اعداد الحيوانات وثلاثة على الأقل micromanipulators تستخدم لموقف microtools بالقرب من السفينة perfused ومحاذاة micropipette نضح مع السفينةالتجويف. يمكن على سبيل المثال أن ملفقة منصة مخصصة لمرحلة المجهر XY (حوالي 90 × 60 سم) من مسطحات الصلب 1 سم مع طلاء مقاوم للصدأ. يتم إرفاق مرحلة إلى جدول مؤشر الهندسة أو شريحتين-حمامة ذيل شنت في الزوايا وعلى أعمدة تفلون أو نقل الكرة للحركة في المستوى الأفقي. A تلاعب نموذجي (انظر الشكل 2) لديه الكثير من القواسم المشتركة مع المجهر وmicropositioning المعدات المستخدمة لمجموعة من التجارب دوران الأوعية الدقيقة حيوي داخلي مثل تلك لقياس واحد تدفق الأوعية الدموية والهيماتوكريت، والتسليم الأكسجين المحلي microvessels الدم perfused، وتنظيم الأوعية الدموية على نحو سلس قوة العضلات، وتراكم الاوعية الدموية الدقيقة المحلي لاستشفاف الفلورية حقنها في الدورة الدموية بأكمله. 18-26 الجانب الأساسي من هذه التقنية هو قياس حجم التدفق (J ت) عبر مساحة محددة (S) من الجدار microvessel. لإنجازهذا عبر تقنية انديس تعديل الموصوفة هنا المجهر المقلوب بسيط هو كاف. هي التي شنت كاميرا فيديو صغيرة على المنفذ صورة وإشارة الفيديو، مع قاعدة الوقت المحتسب بدل الضائع، يتم عرضها على شاشة الفيديو وتسجيلها إما في شكل رقمي على الكمبيوتر أو إشارة رقمية أو التناظرية على مسجل الفيديو. بمجرد مقنى وmicrovessel جزء من microvessel مرئية للكاميرا يمكن تغيير عن طريق تحريك خشبة المسرح والمتلاعبين كوحدة دون تعطيل إقناء؛ إدخال القنية. قياس التدفقات transvascular يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع التحقيقات أكثر تفصيلا باستخدام مجهر مضان متطورة مع الفلاتر المناسبة مثل الحفارات المستخدمة لقياس نفاذية المذاب، ورصد نسبة الفلورسنت من الكالسيوم حشوية أو الآليات الخلوية الأخرى، ومتحد البؤر التصوير 6،12،13، 27. والميزة الرئيسية لجميع المناهج تروية دقيقة هي القدرة على اتخاذ تدابير المتكررة، على السفينة نفسها، في ظل تغير تسيطر عليها القوة الدافعة مثل الضغوط الهيدروستاتيكي وoncotic، أو تغيير يتسبب في ردود السفينة إلى حالات الالتهابات. التصميم الأكثر شيوعا هو المقترنة المقارنة من قياس التوصيل الهيدروليكي (L ص) على نفس السفينة مع السفينة perfused أولا عن طريق micropipette مليئة الإرواء السيطرة وتعليق الخلايا الحمراء لإقامة دولة نفاذية خط الأساس، ثم مع ماصة الثانية مع وكيل اختبار تضاف إلى الإرواء. cannulations المتعددة ممكنة مع دورة متكررة بعد ضخه مع ماصة السيطرة. يوضح هذا البروتوكول إقناء؛ إدخال القنية وتروية دقيقة من سفينة venular في مساريق الفئران لتسجيل تدفقات المياه عبر الجدار microvessel وقياس L p من جدار الوعاء الدموي، وهو مؤشر مفيد للنفاذية مسار مشترك للمياه والأملاح عبر سليمة حاجز غشائي. يتم استدعاء الإجراء لانديس TECHNIQ تعديلرق لأن المبدأ لانديس الأصلي من استخدام الحركة النسبية للخلايا الدم الحمراء كإجراء الصرف السائل transvascular بعد حظره هو الحفاظ على 28 التروية، ولكن مجموعة من الظروف التجريبية (على سبيل المثال، فإن الاختلافات ضغط oncotic الهيدروستاتيكي وزلال عبر الجدار microvessel) تتوفر بعد تروية دقيقة هي أكبر بكثير مما كانت عليه في uncannulated الدم perfused microvessels 8،29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

تجارب لقياس خصائص نفاذية microvessels perfused بشكل فردي توفر جسرا بين التحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية تنظيم نفاذية الأوعية الدموية في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانية وخصائص الصرف الوظيفية للأسرة بأكملها الاوعية الدموية الدقيقة. ووصف طريقة ليقني؛ يدخل القنية ويروي microvessels venular من مساريق الفئران وقياس التوصيل الهيدروليكي للجدار microvessel. المعدات الرئيسية اللازمة تشمل مجهر حيوي داخلي مع مرحلة كبيرة المعدلة التي تدعم micromanipulators وضع ثلاث microtools مختلفة: (1) micropipette مشطوف زجاج ليقني؛ يدخل القنية ويروي microvessel. (2) كوب الصغرى مطبق لمنع عابر نضح وتمكين قياس transvascular حركة تدفق الماء عند الضغط الهيدروستاتيكي قياس، و (3) قضيب زجاج حادة لتحقيق الاستقرار في أنسجة المساريقي في موقع إقناء؛ إدخال القنية. وتعديل لانديس الصغرى انسداد TECHNIQرق يستخدم خلايا الدم الحمراء المعلقة في الإرواء الصناعي كعلامات لحركة السوائل transvascular، وأيضا تمكن يتم التحكم بدقة القياسات المتكررة لهذه التدفقات يتم تغيير الظروف التجريبية كما والهيدروستاتيكي والغروي فرق الضغط الأسموزي عبر microvessels. قياسات التوصيل الهيدروليكي لأول مرة باستخدام الإرواء التحكم، ثم بعد إعادة إقناء؛ إدخال القنية من نفس microvessel مع perfusates اختبار تمكين إقران مقارنات بين استجابة microvessel في ظل هذه الظروف تسيطر عليها بشكل جيد. وكانت محاولات لتمديد طريقة لmicrovessels في مساريق الفئران مع التعديلات الجينية المتوقع أن تعديل نفاذية الأوعية الدموية محدودة للغاية بسبب غياب microvessels طويلة مستقيمة وغير متفرع في مساريق الماوس، ولكن مؤخرا بالاطلاع على الفئران مع التعديلات الجينية مماثلة تستخدم ومن المتوقع أن فتح مجالات جديدة للتحقيق حيث الطرق الموضحة في هذه الوثيقة يمكن تطبيقها على كريسبر التكنولوجيا / Cas9. </P&gt;

ويبين الشكل 4 نتائج قياس مدار الساعة من التغييرات في L ص في الفئران venular microvessel مقنى تباعا مع أربعة perfusates 33 تم استخدام حجم L ص محسوبة على الضغط المستمر كمقياس للتغييرات في microvessel جدار النفاذية، لأول مرة في سيطرة الدولة مع الإرواء تحتوي على 1٪ أ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

إعداد 2 - dGuo المعاملة الثقافات الجهاز الغدة الصعترية

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

الفئران الفحص مساريق الأوعية الدموية

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...