עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות המענקים HL44485 וHL28607.

הצהרת אתיקה: כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. 1. ייצור ראשוני של Micropipettes, Restrainers, וחוסמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה צינורות נימי הזכוכית בורוסיליקט נקיים במחצית באמצעות חולץ אלקטרוני מותאם כך, כאשר משכו, החלק המתוח של הצינור הוא כ 1 ס&quot;מ האורך ושני חצאים הם סימטריים במידה מסוימת. ודא שלהתחדד עולה בקנה אחד עם הממדים באיור 1. השתמש בשני חצאים לmicropipettes, restrainers וחוסמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוע micropipettes באמצעות גלגל שחיקה אוויר מונע 30 עם 0.5 מיקרומטר נייר מחוספס רחץ במים. הגדר את הזווית של בעל micropipette כך שזה בערך 30 מעלות מאופקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף ולייבש את micropipettes באמצעות יניקה למשוך אצטון הנקי באמצעות הקצה ועד הפיר. בדוק את micropipettes (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ זקוף קטן עם 4 × 40 × מטרות מצוידות בבעל micropipette קליפ התנין וreticle עינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipettes בחר עם פתיחת טיפ כ -50 מיקרומטר ארוכים עם שיפוע שאורכו / רוחב יחס הוא בין 3.1 ו -3.5 ועם נקודה בחדות מחודדת אשר מסייעת לחדור את סיבי הקולגן הקשים בלפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן 15-20 micropipettes בגדלים שונים מעט בתיבה נטולת אבק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך restrainers באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימי זכוכית משך זמן קצר ליד microflame כדי ליצור קצה קהה (איור 1). אחסן כמה בקופסא ללא אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך microoccluders באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימים משך תחת microflame ועדינות לכופף (באמצעות מתאם צינור, למשל., 23G) טיפ הנאה (כ 4 מ&quot;מ מקצה) כדי להפוך את הזווית של קרוב ל 120 מעלות לפיר ( <sטרונג&gt; איור 1 ג). הפוך ולאחסן כמה. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זכר (350-450 גר &#39;) או Sprague-Dawley חולדות נקבות (200-300 גרם) עם נתרן pentobarbital (80-100 מ&quot;ג / קילוגרם, סיגמא אולדריץ, P3761) באמצעות הזרקה תת עורית; להגן לפדר על ידי לא באמצעות זריקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוניים, לשמור על הרדמה על ידי זריקות משלימות (30 מ&quot;ג / קילוגרם) לפי צורך. לקבוע עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן או קרני. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, להרדים את העכברוש באמצעות מנת יתר של pentobarbital או הזרקה תוך לב של אשלגן כלורי רווי בהרדמה. </li></ol> 3. להכין פתרונות ואריתרוציטים לשימוש כסמני זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של רינגר היונקים לsuperfusate ופתרון perfusate השליטה (בדרך כלל הפתרון של רינגר המכיל 10 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת שומן יונקיםאלבומין החופשי שור בסרום, BSA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> perfusate סינון באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים זעירים שעלולה לחסום את קצה micropipette; לסנן לתוך מיכל נקי קטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אריתרוציטים על ידי ציור על 0.2 מיליליטר דם מוריד הזנב של העכברוש הרדים למחט 20G במזרק קטן המכיל 0.05 מיליליטר הפרין (1000 U / ml) ולהעביר לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות המכיל כ -14 פתרון של רינגר יונקים מ&quot;ל פתרון . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לארוז בעדינות תאים אדומים (כ 200 גרם × מקסימום 7 דקות). לצייר את supernatant מחדש להשעות את התאים האדומים בפתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה והסרת שלוש פעמים supernatant לעזוב את התאים אדומים ארוזים בחלק התחתון של הצינור לשימוש מאוחר יותר. שים לב שהליך זה מפחית טסיות perfusates הסופי פחות מ -0.1% מרמות נורמליות 31. </li></ol></li></ol> 4. מסדרים את רקמות בבעלי החייםמגש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן של החולדה הרדים ממתחת לטבור לתהליך xiphoid. ודא שהאזור המגולח משתרע סביב הצד הימני (לעכברוש הניח בצד ימין), כך ששיער אינו מהווה פתיל לצייר superfusate מתוך הרקמה היטב. להסיר שערות חתך עם תחבושת רטובה או רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את העור עם מלקחיים משוננים בוטים ולעשות חתך מרכז-קו (ארוך 2-3 סנטימטר) דרך העור באמצעות מספריים חסון. באמצעות קנס מספריים (איריס) לעשות חתך דומה באמצעות alba Linea, הרמת דופן הבטן עם מלקחיים משוננים כדי למנוע נזק למעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם בעלי החיים בצד השני שלה על המגש של בעלי החיים, משוך בעדינות את הבטן מחלל הבטן באמצעות החלת כותנה שקצה (עץ מקל) ספוגה בתמיסת רינגר ומלקחיים משוננים בוטים. מסדרים את הבטן ברקמה כל כך טוב שלפדרו מונח על העמוד לצפייה מבעד למיקרוסקופ לטפל כדי למנוע נגיעה לפדר (potentially נזק microvessels) עם או מלקחיים או כותנה. הערה: מגש בעלי החיים (איור 2 א) ניתן לבנות מפלסטיק ודורשת רקמות היטב (למשל, קוורץ המלוטש בערך 2 סנטימטרים קוטר 5 מ&quot;מ וגבוה.) (כ -3 מ&quot;מ עמוק), עמוד ברור אופטי, וכרית חימום הותאם כדי לשמור על הטמפרטורה של בעל החיים. העובי של העמוד לא יעלה על מרחק העבודה של המטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את מגש בעלי החיים על הבמה מיקרוסקופ כדי שלפדר גלוי דרך העיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם קו טפטוף כובד-הפד Superfuse לפדר עם הפתרון של רינגר היונקים שמרו על 35-37 מעלות צלזיוס ברציפות. השתמש פדה גזה להחזיק הבטן במקום, לעזור לשמור על לחות, ופתיל הפתרון של רינגר העודף מעל פני השטח. התאם את הזרימה ולשאוב את השפכים כדי לשמור על עובי superfusate עקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות microvessels venular היעד, שהםמגזרי unbranched במורד הזרם של זרימה מתכנס, ענפים אחד או שניים דיסטלי לנימים האמיתיות. מצא את כלי unbranched (באופן אידיאלי, 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך) שיש זרימת דם מהירה וחופשית של תאים לבנים דבק על קיר הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את כלי-דם קטנים מבחן במרכז שדה מיקרוסקופ ולעבור עוצר לעמדה בסמוך לאתר cannulation בחר. </li></ol> 5. מילוי micropipette והר במחזיק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני cannulating, להשעות את התאים האדומים בperfusate. להוסיף 7 μl של תאים אדומים ארוזים 0.5 מיליליטר perfusate במבחנה ורוסיליקט נקייה. הערה: Hematocrits של 1-3% יכול לשמש, אבל המטוקריט עקבי יביא לריכוזי perfusate עקביים של כל חומרים שוחררו מהתאים האדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים מזרק 1 מיליליטר עם מתאם צינור 23G וצינורות PE 50 (אורך סנטימטר 5-15). צייר את תערובת perfusate / אדום התא לתוך המזרק. הפוך מזרק לערבב ולגרש את כל הבועות מצינורות ומתאם. להתייעלות, צינורות לנכון כמה מזרקים לפני תחילת הניסוי ולשמור אותם בקופסא ללא אבק או שקית ניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipette על ידי קידום צינורות לתוך הסוף הגדול של micropipette עד שנוגע באזור המחודד. החל לדחוף מהיר עדין על בוכנת המזרק כדי למלא את קצה micropipette. הערה: זרם או טיפה זעיר צריך להיות גלוי בקצה לראיות מילוי מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך את צינורות תוך דחיפה קלה על הבוכנה כדי למלא את החלק הרחב יותר של פיר micropipette. הסר בועות קטנות בפיר הרחב על ידי מצליף פיר micropipette בזהירות. הערה: הליך דומה כבר מאויר 32. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את micropipette לבעל פיפטה עם יציאת צד המאפשר חיבור רציף לנוזל מד לחץ מים. ודא שבעל, שמצורף לדיסק הידראולי משמש לשליטה קידום יפה מאוד של micropipette, הוא בזווית קלה (15-25 מעלות)לאופקי כך שהקצה של להתחדד micropipette לא פגע בבטן או מגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הכונן ההידראולי על micromanipulator ניד, שבו יש x, y, z וכוננים כדי לאפשר קרוב יישור לכלי בדיקה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הלחץ ההידרוסטטי להחיל את הנוזל בmicropipette באמצעות מזרק או הנורה גומי מלא מים כדי לשנות את גובה נוזל בעמודת המים של מד הלחץ לכ -40 CMH 2 O מעל לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate כלי-דם קטנים בהקדם האפשרי לאחר מילוי פיפטה; תאים אדומים ליישב לתחתית של פיפטה, כך שלאחר כ -40 דקות מעט מאוד תאים אדומים יזרמו לתוך הכלי. </li></ol> 6. מדידת לחץ Microcannulation וכלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מיצוב micropipette המלא תחת מיקרוסקופ, לחץ בעדינות על עוצר את הרקמה ליד כלי-דם קטנים הפעלת כוח מספיק כדי אחיזת הרקמה. צייר אתעוצר בחזרה, מעט מתיחת הרקמה בקנה אחד עם כלי-דם קטנים, כך שהלחצים בסיבי קולגן mesenteric מיושרים עם הכלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את micropipette עם הכלי ולהוריד אותו לעין דרך העיני. הנח את הקצה רק במעלה הזרם של אתר cannulation נבחר ומוריד אותה אל הרקמה, כך שהוא חוסם באופן חלקי זרימה בתוך הכלי, אבל לא לחסום אותו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate הכלי על ידי הנהיגה קצה פיפטה לאט לתוך לום הכלי באמצעות הכונן ההידראולי. היזהר שלא לדחוף דרך הצד התחתון של כלי השיט. הערה: כmicropipette נכנס ללום, perfusate מהירות שוטף את הדם בכלי מחוץ ללום וperfusate חופשיות זורם לתוך דיסטלי מחזור של בעלי החיים לכלי-הדם הקטן מבחן, עקירת חלק מזלוף הדם הנורמלי בכלי מורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את לחץ זלוף על ידי התאמת מד הלחץ עד הדם (כפי שמצויןעל ידי התאים האדומים של בעלי החיים) נמשך בחזרה למגזר perfused; זה קובע את לחץ האיזון שבו התאים האדומים בעדינות להתנדנד בלומן הכלי ומודד את הלחץ ההידרוסטטי כלי-דם קטנים (P ג) בקצה הדיסטלי של מגזר כלי-דם קטנים. לשמור זלוף כלי בכל הלחצים מעל לחץ איזון זה. </li></ol> 7. Microocclusion ואיסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לפני השימוש במייקרו-occluder לחסום את הכלי, לחץ עליו לתוך הרקמה באזור בשימוש שאינו של לפדר רחוק מכל כלי, כך שהקצה מצטבר כרית קנס של רקמה שמגנה על הכלי הניסיוני במהלך מייקר חזר חסימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החוסם מעל כלי perfused ליד הקצה התחתון של שדה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הבא עם וידאו ואודיו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילולי להקליט את מיקומו של האתר ולחסום קצה המסך נמוך יותר כפי שניתן לראות בreticle העינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טיפשל החוסם ממוקם בדיוק מעל כלי-דם קטנים, להשתמש בשליטת z הקנס של micromanipulator להוריד בעדינות את החוסם עד הזרימה בכלי הוא יחסום. שים לב ללחץ מד הלחץ (P ג) באודיו. החל חסימה בדרך כלל עבור 3-10 שניות, ולאחר מכן שחרר, שחזור זלוף החופשי. הזז את האתר לחסום את כלי לעבר קצה פיפטה ב5-10 מיקרומטר צעדים המבוססים על זמן (&gt; 5 דקות אחרי בלוק ראשוני באתר), מספר החסימות (3-5), כדי למנוע נזק קיר כלי באתר הבלוק . </li></ol></li></ol> 8. ניתוח של נתונים ומדידה של p L (חדירות מים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הפעלת וידאו, לקבוע את המרחק הראשוני (ℓ 0) מתא אדום סמן לאתר החסימה על ידי שימוש בתמונה של מיקרומטר במה והעמדות הידועות על התמונות. לקבוע את המהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של תא הסמן מתפקידו בכמה מסגרות בשנייה 3-10 של תמונות שתועדו. להרתיעשלי רדיוס הכלי (r) מהתמונות שצולמו במהלך חסימה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב J נ / S עבור כל חסימה כ× (dℓ / DT) (1 / ℓ 0) × (R / 2). חישוב p L בלחץ מתמיד כ( v J / S) מחולק בלחץ הנהיגה (לחץ כלי-דם קטנים - לחץ האוסמוטי קולואיד יעיל; ראה דיון). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרטים של חישובי p L. למרות שתנועת נוזל transvascular מתרחשת בזמן שהספינה היא perfused בחופשיות, משא ומתן כזה הוא קטן מכדי להימדד בזלוף החופשי משום שהוא בדרך כלל פחות מ 0.01% משיעור זלוף הכלי. עם זאת, כאשר זלוף הוא נעצר על ידי הגורם לחסימה זמני כלי-דם קטנים, זרימת transvascular (...

Microperfusion בכלי הדם כרוך בהקמה מבוקרת זרימה של perfusate המלאכותי של הרכב ידוע באמצעות micropipette בכלי דם בדרך כלל פחות מ -40 מיקרומטר קוטר. כלי perfused נשאר בסביבת הרקמות הנורמלית שלה, והוא perfused עם הדם של החיה עד למועד cannulation. הפועל בשיתוף עם מגוון רחב של הדמיה וידאו או טכניקות fluorometric, בmicroperfusion האתר מאפשר מדידה של מים זורמים ומומס פני קירות microvessels בתנאים בהם הכוחות המניעים לזרמים אלה ידועים ותכונות החדירות של כלי דם הקיר יכולות להיות העריך באופן ישיר. יתר על כן, על ידי שליטה על הרכב הנוזלים המקיפים את כלי-דם קטנים ברקמות (perfusate וsuperfusate), הרגולציה של חדירות כלי-דם קטנים ובשערי חליפין יכולה להיחקר על ידי הפעלת תאי האנדותל המרכיבים את קיר כלי-דם קטנים להיחשף למגוון רחב של דוארתנאי xperimental (אגוניסטים, תנאי זלוף שונה, אינדיקטורים ניאון כדי למדוד את הרכב תאיים ואיתות) לתקופות שנמדדו בדיוק זמן (שניות לשעה). בנוסף, הערכות ultrastructural או cytochemical של מבנים מולקולריים תאיים מפתח המסדירים את המחסום יכולות להיחקר באותו microvessels בי חדירות נמדדות ישירות. הגישה ובכך יוצרת גשר בין החקירה של המנגנונים התאיים ומולקולריים לשנות תפקוד מחסום אנדותל בתרבית monolayers אנדותל תא והחקירה בmicrovessels שלמה. ראה את הביקורות להערכה נוספת 1-6 הבאה. הגבלה של microperfusion היא שניתן להשתמש בו רק במיטות כלי דם, כי הם דקים, שקופים ויש לי שלמות מבנית מספיק כדי לאפשר cannulation עם micropipette זכוכית. בעוד חקירות מוקדמות משמשות microvessels צפרדע בלפדר ומטר אנגינה עורית דקuscle 7,8, בהרבה ההכנה הנפוצה ביותר במודלים של יונקים היא לפדר עכברוש 9-15. רוב החקירות התמקדו בשינויים חריפים בחדירות כלי דם למדו על פני תקופות של 1-4 שעות, אבל יותר חקירות האחרונות הורחבו למדידות על כלי פרט 24-72 שעות לאחר זלוף ראשוני 12,16. הטכנולוגיה שפותחה לאחרונה CRISPR, אשר מבטיחה להפוך את המודלים של עכברים מהונדסים גנטי יותר זמינים ללימוד תקנת חדירות כלי דם 17 צריכים לאפשר השיטות שתוארו בתקשורת זה להיות מיושמת בmicrovessels venular של לפדר במודלים של העכברים חדשים החשובים אלה. השיטה דורשת מיקרוסקופ הפוך מצוידים בבמת מיקרוסקופ נבנה מותאם אישית גדולה מספיק כדי להכיל שתי הכנת בעלי החיים ולפחות שלוש micromanipulators משמשת לmicrotools העמדה קרוב לכלי perfused וליישר micropipette זלוף עם הכלילומן. לדוגמא פלטפורמה מותאמת אישית לבמת מיקרוסקופ XY (כ -90 × 60 סנטימטרים) יכולה להיות מפוברקת מפלדה בעובי 1 סנטימטר עם ציפוי חלודה הוכחה. השלב מחובר לשולחן מדד הנדסה או שתי שקופיות יונה-זנב רכובים בזוויות ישרות ונתמכות על עמודי טפלון או העברות כדור לתנועה במישור האופקי. אסדה טיפוסית (ראה איור 2) יש הרבה מן המשותף עם ציוד מיקרוסקופ וmicropositioning משמש למגוון רחב של ניסויי זרימת דם intravital כגון אלה כדי למדוד את זרימת דם חד כלי והמטוקריט, אספקת חמצן מקומית על ידי microvessels דם perfused, רגולציה של חלק בכלי דם טונוס שרירים, והצטברות כלי הדם המקומית של קליעים נותבים ניאון הוזרקו לכל מחזור. 18-26 ההיבט הבסיסי של הטכניקה הוא המדידה של נפח זרימה (J v) על פני שטח מוגדר שטח (S) של קיר כלי-דם קטנים. כדי להשיגזה באמצעות הטכניקה לנדיס שונה שתוארה במסמך זה מיקרוסקופ ההפוך פשוט הוא נאות. מצלמת וידאו קטנה היא רכובה על נמל התמונה ואות וידאו, עם בסיס זמן הוסיף, מוצג על צג וידאו ונרשם גם בצורה דיגיטלית במחשב או כאות דיגיטלית או אנלוגי במצלמת וידאו. ברגע שהכלי-הדם הקטן הוא cannulated החלק מהכלי-הדם הקטן הגלוי למצלמה ניתן לשנות על ידי הזזת הבמה ומניפולטורים כיחידה מבלי לשבש את cannulation. מדידה של תזרימי transvascular יכולה גם להיות משולבת עם חקירות מפורטות יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוחכם עם מסננים מתאימים כגון אסדות המשמשות למדידות של חדירות מומסות, ניטור יחס ניאון של סידן cytoplasmic או מנגנונים תאיים אחרים, והדמיה confocal 6,12,13, 27. יתרון עיקרי של כל גישות microperfusion הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות, על אותו הכלי, תחת שינוי מבוקר של כוח מניע כגון לחצים ההידרוסטטי וoncotic, או שינוי מושרה בתגובות כלי למצבים דלקתיים. העיצוב הנפוץ ביותר הוא השוואה לזווג של מוליכות הידראוליות נמדדו (עמ &#39;יב) באותו כלי עם הכלי perfused הראשון באמצעות micropipette מלא perfusate שליטה והשעית התא האדום להקמת מדינת חדירות תחילת המחקר, ולאחר מכן עם טפטפת שני עם סוכן מבחן נוסף לperfusate. cannulations מרובה אפשרי עם המחזור חזר לאחר reperfusion עם פיפטה השליטה. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את cannulation וmicroperfusion של כלי venular בלפדר עכברוש להקליט והנתיבים מים על פני קיר כלי-דם קטנים ולמדוד את p L של קיר הכלי, מדד שימושי של החדירות של המסלול המשותף למים ומומסים פני שלם מחסום אנדותל. ההליך נקרא techniq נדיס שונהUE כי העיקרון המקורי לנדיס של שימוש בתנועה היחסית של תאים אדומים כמדד להחלפת נוזל transvascular לאחר זלוף חסום נשמרה 28, אבל מגוון של תנאי ניסוי (למשל, הבדלים בלחץ ההידרוסטטי oncotic ואלבומין פני קיר כלי-דם קטנים) זמין לאחר microperfusion הוא הרבה יותר גדול מאשר בmicrovessels דם perfused uncannulated 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

ניסויים כדי למדוד את תכונות חדירות של microvessels perfused בנפרד מספקים גשר בין החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים המסדירים חדירות כלי דם בmonolayers תרבית התא אנדותל ומאפייני תמורה הפונקציונליות של מיטות כלי דם שלמות. שיטה לcannulate וינקב microvessels venular של לפדר עכברוש ולמדוד את המוליכות הידראוליות של קיר microvessel מתוארת. הציוד העיקרי הדרוש כולל מיקרוסקופ intravital עם במה גדולה שונה, התומכת micromanipulators למצב את שלוש microtools שונה: (1) micropipette זכוכית משופעת לcannulate וינקב כלי-דם קטנים; (2) מיקרו-occluder זכוכית לחסום זמנית זלוף ולאפשר מדידה של זרימת מים בתנועת transvascular לחץ ההידרוסטטי נמדד, ו- (3) מוט זכוכית בוטה כדי לייצב את רקמות mesenteric באתר של cannulation. Techniq מיקרו-החסימה שונה לנדיסUE משתמש בתאים אדומים התלויים בperfusate המלאכותי כסמנים של תנועת נוזל transvascular, וגם מאפשר מדידות חוזרות ונשנות של זרמים אלה תנאי ניסוי כמשתנים והבדל לחץ האוסמוטי ההידרוסטטי וקולואיד פני microvessels נשלטות בזהירות. מדידות של מוליכות הידראוליות באמצעות ראשון perfusate שליטה, אז אחרי מחדש cannulation של אותו כלי-דם קטנים עם perfusates הבדיקה מאפשרות לזווג השוואות של תגובת microvessel בתנאים מבוקרים היטב אלה. ניסיונות להאריך את השיטה לmicrovessels בלפדר של עכברים עם שינויים גנטיים צפויים לשנות חדירות כלי דם היו מוגבלים בגלל היעדר microvessels ישר וunbranched הארוך בלפדר עכבר, אבל הזמינות האחרונה של החולדות עם שינויים גנטיים דומים באמצעות הטכנולוגיה / Cas9 CRISPR צפויה לפתוח אזורים חדשים של חקירה שבו ניתן ליישם השיטות שתוארו במסמך זה. </p&gt;

איור 4 מראה את התוצאות מהמדידה במהלך השינויים בעמ L הזמן בחולדת venular microvessel cannulated ברציפות עם ארבע perfusates. 33 עמ &#39;גודל L מחושב בלחץ מתמיד שימש כמדד לשינויים בקיר חדירות כלי-דם קטנים, ראשון במדינה עם שליטת perfusate המכיל 1% אלבומין בסרום שור לאחר מכן ...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video