ويتم تمويل هذا العمل من قبل جائزة الباحث ERC المتقدم لAMA (DAT، TB) مع مساهمة من منحة المشروع من ويلكوم ترست لAMA، وهو studentship EPSRC لPB-J وإيراسموس، مؤسسة Stichting د. هندريك مولر Vaderlandsch فون وFundatie فان دي Vrijvrouwe فان Renswoude الشركة المصرية للاتصالات &#39;S-GRAVENHAGE إلى SCvdB. نريد ان نشكر J. بريسكو، S. مونيوز Descalzo، C. شروتر، وT. رودريجيز، لإجراء مناقشات وانتقادات بناءة، خواكين دي Navascués لبروتوكول المتوسط ​​تصاعد وكلا AK Hadjantonakis وC. Budjan لتبادل البروتوكولات المخبرية الخاصة بهم المتعلقة تلطيخ الأجنة كلها جبل. إصدار سابق من هذه المادة وقدم متاحة في السابق على bioRxiv ورقة خادم 29.

1. شروط الثقافة قبل التجميع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على mESCs في ESLIF المتوسطة (انظر الجدول مواد محددة والمعدات اللازمة لصياغة) على قوارير المغلفة الجيلاتين 25 سم 2 يعالج الأنسجة الثقافة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 21-25 فبراير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة سنتين على الأقل الممرات الرد على ذوبان الجليد قبل استخدامها في هذا البروتوكول. الخلايا في الممرات السفلية عادة ما تكون أكثر نجاحا في توليد خصائص قابلة للتكرار في جميع أنحاء مكررات التجريبية (أي، أي أكثر من 15 فقرات في الثقافة)، والتباين مهما كان طفيفا بين مختلف ES خلية خطوط أمر متوقع (انظر الجدول 2 للخطوط الخلايا اختبار ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا إلى 40-60٪ confluency. لا تستخدم خلايا الإفراط في متموجة لتجميع. </li></ol> 2. جيل من المجاميع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS قبل الدافئة (+ كا 2+، + المغنيسيوم 2+)، ESLIF، N2B27 26،27 </suP&gt; والتربسين-EDTA في 37 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح مستنبت من قارورة زراعة الأنسجة (الخطوة 1.3). شطف القارورة بلطف مع 5 مل PBS، مرتين. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 1-2 مل من قبل تحسنت التربسين-EDTA (0.25٪) لفصل الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قارورة في الحاضنة لمدة &lt;مدة 5 دقائق أو حتى الخلايا قد فصل تماما من سطح القارورة. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 1 مل لتوليد تعليق خلية واحدة لحساب دقيق وتشكيل موحدة حجم الكلي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد التربسين مع 5-10 مل ESLIF. غسل أسفل سطح النمو لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخلية ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إزالة قسامة 1 مل من أنبوب الطرد المركزي وعدد الخلايا مع haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم تعليق المطلوبة لتوفير 10 خلية / ميكرولتر (كلها لوحة 96-جيدا تتطلب 5X10 4 الخلايا في 5 مل تعليق). عدد الخلايا بدقة، كما deviat كبيرةالأيونات من عدد الخلايا ذكر يمكن أن يؤثر سلبا على استجابة المجاميع للمؤثرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5X10 4 الخلايا إلى 5 مل PBS قبل تحسنت في الطازج 50 مل أنبوب الطرد المركزي وتدور في ~ 170 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية PBS وإضافة 5 مل قبل تحسنت PBS بلطف. لا تعكير صفو بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في ~ 170 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية PBS للمرة الثانية. إزالة PBS أكبر قدر ممكن من دون إزعاج بيليه كما PBS المرحل يمكن أن تؤثر سلبا التجميع. resuspend الكرية أولا في 1 مل N2B27 دافئة مع ماصة P1000 لتوليد تعليق خلية متجانسة، تليها أخرى إضافة N2B27 إلى الحجم المطلوب (على سبيل المثال، إضافة 4 مل ل5X10 4 خلايا / 5 مل تعليق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى خزان معقم وماصة قطرات 40 ميكرولتر في الجزء السفلي من كل بئر من غير الأنسجة الثقافة المعالجة، &#39;U&#39;القاع-96-Wالذراع لوحة باستخدام ماصة الأقنية. تغطية لوحة 96-جيدا مع غطاء المقابل، وتأكد من وجود الخلايا مع مقلوب مقعد بين كبار المجهر (الشكل 1B). ملاحظة: من الضروري أن يتم استخدام هذه اللوحات للحد من إمكانية خلايا الانضمام. لا معطف أسفل لوحة 96-جيدا مع الجيلاتين، فيبرونكتين] أو أي طلاء الأخرى التي تعزز التصاق الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لتجميع. </li></ol> 3. تطبيق المحفزات وتغيير المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة 48 ساعة، نلاحظ ظهور mESCs داخل كل بئر من لوحة 96-جيدا لتأكيد تجميع ناجحة (الشكل 1E). ملاحظة: سوف تظهر المجاميع كروية في الطبيعة، وحوالي 150-200 ميكرون في القطر. الرجوع إلى قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها إذا كانت المشاكل تنشأ (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">0؛ إضافة 150 متوسطة الثانوي الطازجة ميكرولتر (3 ميكرومتر Chi99021 (تشي) في N2B27 19؛ الأسهم التي أعدت في 10 ملم في DMSO) إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. ماصة مع ما يكفي من القوة لطرد أي المجاميع التي ربما تكون قد بدأت في الانضمام إلى الجزء السفلي من الآبار. احتضان المجاميع في المتوسط ​​الثانوي لمدة 24 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (الشكل 1A). ملاحظة: يتم إنشاء المجاميع ممدود والاستقطاب للإنتاج باستخدام هذه الوسيلة الثانوي. كما يمكن استخدام التراكيب المتوسطة الثانوية الأخرى حسب الظروف التجريبية المطلوبة ويتم عرض الأمثلة في الشكل (3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغييرات المتوسطة لاحقة، واستخدام ماصة الأقنية التي عقدت في زاوية (حوالي 30 درجة) لإزالة بلطف 150 ميكرولتر من المتوسط ​​الثانوي من جانب كل بئر. ثم، ماصة 150 ميكرولتر جديدة N2B27 في كل بئر مع ما يكفي من القوة لطرد أي المجاميع التي قد يكون لها بدايةإد على الانضمام إلى الجزء السفلي من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نقطة 3. 3 كل 24 ساعة حتى للدوام كاملة (طول نموذجي من تجربة ثقافة الإجمالية 120 ساعة). ملاحظة: تأكد من الركام وتتحرك بحرية بعد التغييرات المتوسطة لضمان استنساخ والاتساق داخل وبين كل لوحة 96-جيدا. يجب تغيير المتوسطة يوميا بعد فترة التجميع. </li></ol> 4. إعداد المجاميع المناعية وتحليل من قبل متحد البؤر المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت والابتدائي جسم الحضانة ملاحظة: تم تعديل بروتوكول صفها AK Hadjantonakis 28 لتناسب المناعية من مسك المجاميع. لالأجسام المضادة المستخدمة عادة في دراساتنا والتخفيفات، وتشير إلى سبق نشرها العمل 19،21،24،25،29 والجدول 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة الأقنية التي عقدت في زاوية (حوالي 30 درجة) لإزالة بلطف 150 ميكرولتر المتوسطة من الجانب سو كل بئر من لوحة 96-جيدا. يغسل مرتين من قبل pipetting 150 PBS ميكرولتر في كل بئر. ترك بضع دقائق بين كل غسل للسماح المجاميع ليستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ماصة P1000 الاستغناء 200 ميكرولتر، ونعلق المقابلة طرف ماصة وقطع حوالي 3 ملم من نهاية طرف مع زوج من مقص العقيمة. رسم جزء من برنامج تلفزيوني داخل كل بئر من لوحة 96-جيدا بطريقة قصير في تلميح وطرد لتستنهض الهمم مجموع المباراتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نفس تلميح إلى وضع وحدة التخزين بالكامل داخل البئر بما في مجموع المباراتين وماصة صغيرة (30 مم) الزجاج ذبابة الفاكهة تشريح جيدا. نقل جميع المجاميع من لوحة 96-جيدا أن سيخضع الأنظمة المناعية متطابقة في نفس الزجاج تشريح جيدا. ملاحظة: استخدام قطع ماصة جديدة طرف عند نقل الركام من ظروف تجريبية مختلفة لمنع ترحيل للركام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جيد الزجاج الذي يحتوي على aggregatوفاق على المجهر تشريح. دوامة الزجاج جيدا لإجبار المجاميع إلى المركز ونضح PBS من جانب واحد من البئر مع كوب ماصة باستير. استخدام المجهر لضمان عدم يستنشق المجاميع. ترك كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني داخل البئر الزجاج لتغطية الركام لمنعهم من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل الطازجة الفورمالديهايد (4٪) الذائب في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة. ومن المعروف امتصاص العرق لتكون حساسية، مسرطنة وسامة: الحذر. ارتداء الحماية المناسبة أثناء المناولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت، نضح الحل الفورمالديهايد بنفس الطريقة كما هو موضح في القسم 4. 1. 4 وغسل الركام مع 1 مل PBS ثلاث مرات، و 10 دقيقة لمع كل غسل، على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS كما هو موضح في القسم 4. 1. 4 وإجراء ثلاثة، 10 دقيقة يغسل مزيد مع PBS تحتوي على 10٪ من الجنين مصل بقري و 0.2٪ تريطن X-100 (PBSFT). أداء دقيقة يغسل 10 على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة. ملاحظة: استخدام من الجنين مصل بقري (FBS) النتائج في غسل العازلة واضح، والحد من عدد من المجاميع التي لولاها أن تضيع خلال بروتوكول إذا تم استخدام الحليب. ومن المهم أن نلاحظ أنه بعد التثبيت، إجراءات المناعى يمكن القيام بها بطرق مختلفة غير تلك المفصلة أدناه وينبغي تحديد والأمثل من قبل المحقق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع المجاميع لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية في PBSFT على الروك المداري لتعيين سرعة منخفضة. قد يكون مؤقتا البروتوكول في هذه المرحلة، والمجاميع منعت O / N، مع التحريض المستمر على لفاف الروك الأفقي في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBSFT كما هو موضح سابقا (انظر القسم 1. 4. 4)، واحتضان المجاميع مع 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية اللازمة مخففة في PBSFT O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر المداري لتعيين سرعة منخفضة. مع تغطية فيلم البارافين لمنع التبخر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جسم الحضانة الثانوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح حل الأجسام المضادة الأولية ويغسل مع 1 مل PBSFT (في 4 ° C) على النحو التالي: مرتين لمدة 5 دقائق. ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة. و6:56 مرات لمدة 1 ساعة. تنفيذ كل خطوة الغسيل في 4 درجات مئوية، وعلى الروك المداري المقرر أن سرعة منخفضة. ملاحظة: البرد غسل المتوسطة قبل استخدامها. عدم تنفيذ يغسل على الجليد كما يمكن أن يسبب هذا الركام إلى جزء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة غسل النهائي واحتضان المجاميع مع الأجسام المضادة الثانوية المطلوبة في 500 ميكرولتر PBSFT O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام على لفاف الروك الأفقي. إضافة النووية وصمة عار مثل هويشت إذا لزم الأمر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصاعد والتصوير التي كتبها متحد البؤر Microcopy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الركام كما هو موضح في القسم 4. 1. 4 مع 4 ° C PBSFT. بعد غسل النهائي، وشطف الركام مع 1 مل PBS تحتوي على 0.2٪ FBS وتريتون X-100 (PBT) على النحو التالي: مرتين لمدة 5 دقائق. ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة. أداء يغسلفي RT على الروك المداري محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة كما هو موضح سابقا (القسم 4. 1. 4)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام مع 1: الحل 1 من الجلسرين: PBT (1 مل) تليها الثانية الحضانة 30 دقيقة مع 7: حل 3 من الجلسرين: PBT (1 مل). ملاحظة: مزيج من الجلسرين والحلول PBT في 4 درجات مئوية باستخدام المدورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الجلسرين النهائي: حل PBT واستبدالها مع 1 مل تصاعد المتوسطة 24. قد يكون مؤقتا البروتوكول في هذه المرحلة قبل التركيب (إذا توقفت، وختم الآبار مع فيلم البارافين وتخزين الآبار تلطيخ في 4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل المجاميع على الشرائح المجهر من قبل pipetting لهم في 17 قطرات ميكرولتر مع طرف قطع P20 (الشكل 2). أضعاف الشريط على الوجهين مرة أخرى على نفسه أربع مرات لتوليد الفواصل ونعلق على كل نهاية الشريحة. ضع ساترة العليا (22 ملم × 60 ملم) على هذه الفواصل (الشكل 2). ملاحظة: من الضروري أن خفض غيضتستخدم في هذه المرحلة حتى لا تتلف العينات. الفواصل تمنع ساترة سحق الركام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة هي التي شنت على المجاميع، وصورة العينات باستخدام المجهر متحد البؤر باستخدام بروتوكولات الموصوفة سابقا 19،21،24،25. وبمجرد وضعها على المجهر، وترك الشريحة دون عائق على المسرح لبضع دقائق للسماح للمجاميع ليستقر داخل المتوسطة المتزايدة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt,+Activin,+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood.">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate.">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li><li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation.">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids.">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis.">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).</li><li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+expression,+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis.">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li><li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation.">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li><li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development,+Studied+by+Operative+Methods.">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li><li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+totale+Exogastrulation,+eine+Selbstabl&#246;sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm.">Die totale Exogastrulation, eine Selbstabl&#246;sung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv f&#252;r Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li><li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking,+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells.">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells.">Wnt/&#946;-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated+&#946;-catenin/Oct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A membrane-associated &#946;-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li><li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells.">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).</li><li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Ru&#233;, P., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells.">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li><li>Turner, D. A., Ru&#233;, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+cooperates+with+Wnt/&#946;-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells.">Brachyury cooperates with Wnt/&#946;-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).</li><li>Ying, Q. -. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).</li><li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking,+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro.">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li><li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo.">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li><li>Inman, G. J., Nicol&#225;s, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+(ALK)+receptors+ALK4,+ALK5,+and+ALK7.">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).</li><li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMH1,+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs:+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction.">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal.">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li><li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).</li><li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li><li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPRT-deficient+(Lesch-Nyhan)+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells.">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

تقنية الموضحة في هذه المخطوطة بكفاءة وبتكاثر يولد مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) التي نظمت العرض التماثل كسر واستطالة 19، والجمع بين كل من ثقافة الإفلات شنقا صفها ماريكاوا وآخرون 14 و EB تشكيل. هذه المجاميع على المضي قدما لتطوير الاستطالة المحورية، واستكمال الطرق الحالية لتوليد أجهزة الأمامي من خلايا ES مثل أكواب البصرية (11) والقشرة المخية 13، وتحتوي على خلايا مع هويات الطبقات الثلاث الجرثومية التي عمليات مماثلة لتلك أثناء تكون المعيدة العرض مثل السريع 19،21 حركة الخلية. ومن المثير للاهتمام للمضاربة على طبيعة الحدث التماثل كسر، لأنه يحدث في غياب الأنسجة الزخرفة الخارجية والتباين اقحي جديلة. 19. تشكيل عفوية من محور بدائية يمكن أن تنشأ من قبل القائمة heterogeneities في الثقافة بدءا من الخلايا، التي تشكل الأساس لتطوير التماثل. في الواقع، السكان من الخلايا المستزرعة في ظروف ESLIF عرض خليط من تجديد الذات والتفريق الخلايا، نسب والتي قد تختلف من تجميع واحد إلى آخر. وعلاوة على ذلك، والعمل الأولي في المختبر لدينا تشير إلى أن مجاميع من السكان المحفزة كليا من الخلايا تظهر التنمية والعيوب تأخر في الزخرفة، مما يشير إلى دور لعدم التجانس في تشكيل نمط المنظم (DA تيرنر &amp; A. مارتينيز أرياس، قيد الإعداد). ومن الجدير بالنظر إلى أن آلية تفاعل نشرها قد تولد نمط، مع نشر المانع بعيدا عن سطح مجموع المباراتين. Warmflash وآخرون. 41 تشير إلى أن هذه الآلية يمكن أن تكون مسؤولة عن وضع التماثل الشعاعي في ثقافة ملتصقة، مما يجعله مرشحا محتملا للتنميط في ثلاثة أبعاد. خلال initiaل 48 ساعة فترة التجميع، خلايا تصل إلى حالة مماثلة لتلك التي في الأديم الظاهر postimplantation، التي هي المختصة للرد على إشارات من المتوسط ​​الثانوي 19،21،24. عادة، وبروتوكول الموصوفة هنا يوفر الخلايا مع نبض المتوسطة الثانوية التي تحتوي على العوامل (مثل منبهات WNT / β-Catenin) التي توفر إشارات كافية لاستطالة. أساليب الثقافة السابقة التي وصفها لانكستر وآخرون. (باستخدام المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان 13) وEiraku وآخرون (مع mESCs 11) تستخدم فترة قصيرة من التجميع في البلدان المنخفضة التصاق الصفائح 96-جيدا قبل نقل الخلايا مجمعة لقطرات Matrigel لعلى- الذهاب الثقافة. على الرغم من أن الوقت بين تجميع وMatrigel الإدراج كان مختلفا بين الدراسات، في كلتا الحالتين، تم استخدام أعداد كبيرة من الخلايا لتشكيل الكلي (حوالي 3،000-4،500 الخلايا). على النقيض من ذلك، وصفت بروتوكول هنا 19 يستخدم عدد أقل بكثير من الخلايا (حوالي 400 الخلايافي مجموع المباراتين) التي تم تحديدها على أنها ضرورية للغاية لعملية استطالة، والتماثل كسر والاستقطاب الذي لوحظ 19. بالإضافة إلى ذلك، هذه الهياكل ممدود هي قادرة على أن ولدت في فترة زمنية أقصر بكثير دون التضمين في المصفوفات الاصطناعية: مقارنة جيل من مناطق الدماغ التي تحددها لانكستر وآخرون (&gt; 20-30 يوما) 13 والبصرية أكواب من Eiraku. وآخرون. (~ 11 أيام) 11 مع 5 أيام المطلوبة لتوليد هياكل ممدود الاستقطاب. واحدة من قيود مع أسلوب الثقافة الموصوفة هنا ومع ذلك، هو أنها لا يمكن إلا أن يكون مثقف ما يقرب من 5-6 أيام بعد انتهاء الطلاء حتى يجعل حجمها لهم مختصة بموجب خطورة لتنزل الى قاع الآبار وفرض التصاق حتى على غير المغلفة البلاستيكية وير. مزيد من التجارب باستخدام المصفوفات الاصطناعية مثل تلك المذكورة سابقا، قد تسمح لنا بزيادة فترةالملاحظة والتجريب، والعمل هو تحديد آثار تقييد الركام بطريقة مستمرة. وجود قيود مزيد من هذه التقنية هو أنه من أجل تغيير المتوسطة دون إزالة الركام، يجب أن تترك كمية صغيرة من المتوسط ​​في قاع البئر. النتائج المترتبة على نهج الوراثة الكيميائية هي الحاجة إلى النظر في هذا التخفيف وأي آثار متبقية من وسائل الاعلام السابق: في يوم 3 ميكرومتر تشي النبض، ويتم تسليم 2.37 ميكرومتر الحل في الواقع، والتغيرات المتوسطة اللاحقة يؤدي إلى ترحيل 0،499 ميكرومتر (72-96 ساعة) و0.105 ميكرومتر (96-120 ساعة) بين نقاط الوقت. لم تصحيح العمل الحالي لتخفيف ويفترض أن التغيرات المتوسطة اليومية وتقليل الآثار المتبقية. هناك عدد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول لضمان إعادة الإنتاج على حد سواء داخل وبين التجريبية. أولا، ثقافة ابتداء من mESCs يجب صيانتها جيدا وليس على المشتركnfluent، والمتوسطة يجب أن تكون دائما جيدة أي جودة، الطازجة وتمتزج جيدا (الشكل 5A، B). شروط الثقافة الفقيرة يؤثر سلبا على التجميع (الشكل 5Bi). عد دقيقة من الخلايا للحصول على تعليق خلية ~ 400 خلية / 40 ميكرولتر أمر ضروري، كما فشلت المجاميع الكبيرة في تقرير المصير، تنظيم وهم أكثر عرضة لتشكيل المجاميع مزدوجة داخل كل بئر (الشكل 5Bii) في حين المجاميع الصغيرة غير قادرة على الوصول الصحيح الكثافة حيث أنها قادرة على الاستجابة لحافز (الشكل 5Biii). وكانت الخطوة الأمثل الرئيسية إدراج غسل PBS الثاني الذي يزيل المصل الملوثات من تعليق خلية (الخطوة 2.6)؛ هذا تحسن وتيرة التجميع وتسارع تطور المجاميع قبل ما يقرب من 24 ساعة. بعد ذلك، يتم تطبيق التغييرات ضمان المتوسطة مع قوة كافية لطرد أي المجاميع التي لديها القدرة على الانضمام إلى سطح البئر. الفشل في القيام بذلك دورة الفتشوبLTS في &quot;تحطمها&quot; المجاميع (الشكل 5Biv). وبالإضافة إلى ذلك، وكما ذكر سابقا (وأدناه)، فمن الضروري لضمان أن المجاميع يتم الاحتفاظ في الثقافة تعليق ومنعت من الانضمام إلى أي سطح. مرة واحدة انضمت المجاميع، تتعطل نمط التعبير الجيني وإمكانيات استطالة بهم. لأن هذا الأسلوب هو بسيطة نسبيا، وكذلك ضمن اختصاص الأفراد مع تقنيات زراعة الأنسجة جيدة، معظم المشاكل المرتبطة التجميع يمكن حلها بسرعة نسبيا إذا ما اتبعت هذه الخطوات الحاسمة. الجدول الكامل من المتاعب اطلاق النار يتوفر (الجدول 1). مرة واحدة يتقن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة تطوير المحورية، والتماثل كسر وخلية القرار الأحداث. وبشكل أكثر تحديدا، هذه المجاميع لديها القدرة على توليد برك من الخلايا التي كانت حتى الآن غير متوفرة في الثقافة، مثل النخاع الشوكي والدراجات الناريةالخلايا العصبية ص. الأخلاقية ملاحظة: تجدر الإشارة مع الحذر الواجب أن ترجمة هذا البروتوكول لES الإنسان أو زراعة الخلايا المحفزة يمكن أن تجلب المجرب على مقربة من الأساس القانوني للحدود أربعة عشر يوما على أبحاث الأجنة البشرية، وهي الجيل من خط بدائي، كما هو مفصل في قانون الإنسان التخصيب وعلم الأجنة 2008 (UK) 42. منذ صدور قانون يغطي جميع الأجنة البشرية الحية بغض النظر عن طريقتها في الخلق، من شأنه أن ثقافة gastruloids الإنسان ما وراء خط-بدائية مثل المرحلة سيكون خارج نطاق الأبحاث للترخيص.

دراسة وفهم القرارات خلية مصير في التنمية الثدييات المبكرة يمكن الاستفادة من الثقافات من الخلايا الجنينية الجذعية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، والسكان نسيلي المستمدة من الكيسات الأريمية التي لديها القدرة على الذات تجديد وتميز في جميع أنواع الخلايا في كائن حي أي.، فهي 1،2 المحفزة. في حين كانت هذه الثقافات، وستستمر في أن تكون مفيدة لفهم الأساس الجزيئي للقرارات الخلية مصير، أنهم غير قادرين على إعادة إنتاج بعض الترتيبات المكانية والسلوكيات العالمية التي يتم إنشاؤها في الأجنة أثناء تكون المعيدة. في الجنين، فإن عملية تكون المعيدة تحول طبقة واحدة الظهارية في الطبقات الجرثومية الثلاث المتميزة ويمنح الجنين مع منظمة الأمامي الخلفي العلنية 3-5. وقد وضعت محاولات لتلخيص هذه الأحداث خارج الجسم على توليد المجاميع ثلاثية الأبعاد من المجالس الاقتصادية والاجتماعية، ويشار إلى الهيئات مضغي باسم (EBS)، وتعريضهم رس ظروف التمايز 6،7. هذه المجاميع يمكن أقنع على التمايز إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، وبعضها إما غير قادرين على الحصول عليها أو التي يسببها مع انخفاض الكفاءة في ثقافة ملتصقة أو لا يمكن أن يتم إنتاجها على الإطلاق؛. على سبيل المثال، الدم 8 والجرثومية البدائية خلايا 9. وجود قيود على استخدام EBS ومع ذلك، هو أنهم غير قادرين لعرض السلوك تخلقية، توزيع طبقة الجرثومية أو منظمة المحورية التي هي الخصائص الرئيسية للالجنين النامي، مما أدى إلى سوء التنظيم المكاني 6،10. في تقرير واحد، وعلاج EBS مع WNT يؤدي إلى الاستقطاب ضعيفة في التعبير الجيني في بعض المجاميع ولكن يتم احترام أي التشكل واضح 7. المزيد من التقارير الأخيرة، EBS التي تم تربيتها لفترات طويلة من الزمن في تطوير الهياكل الأمامية مثل شبكية العين، القشرة والخلايا الحسية الأذن الداخلية، والتي تحاكي نظيراتها الجنينية ولكن تتطور دون سياق تنظيم، محوريأيون 11-13. وقال تقرير ماريكاوا وآخرون 14، بينما تعمل مع مجاميع من الماوس P19 الأجنة سرطان (EC) الخلايا التي شكلتها طريقة اعدام الإفلات، حسبما ذكرت وظهور هياكل ممدود من أصل أرومية متوسطة تذكرنا الاستطالة التي لوحظت مع exogastrulae في البرمائيات والأجنة قنفذ البحر وكيلر إإكسبلنتس 15-18. وبما أن هذا لم وحظ مع الماوس الجنينية الخلايا الجذعية (mESCs)، حاولنا إعادة إنشاء السلوك لاحظ مع P19 خلايا EC باستخدام الركام من mESCs 19 ونفيدكم الظروف والثقافة التي تؤدي إلى التماثل على كسر ومحوري استطالة. فارق هام من العمل مع الخلايا P19 هو أن البروتوكول تجميع الموصوفة هنا يتم تنفيذ في لوحة 96-جيدا، مماثلة لتلك التي وصفها Eiraku وآخرون 20، بدلا من شنقا قطرات. أدى هذا التغيير في زيادة كفاءة من حيث الانتعاش الكلي وفي كل منداخل وبين تجريبي التكاثر. الأهم من ذلك، الحفاظ على المجاميع في الآبار الفردية يضمن أن الاندماج بين الركام (شيوعا عند تجميع الركام من قطرات شنقا) لا يحدث. بالإضافة إلى ذلك، سمة رئيسية من البروتوكول هو 24 ساعة من التعرض للCHI99021 GSK3 المانع (تشي)، منشط قوي للWNT / β-Catenin الإشارات، بعد التجميع. الطريقة الموصوفة هنا يوفر أساسا لفهم عمليات التنظيم الذاتي، والتنظيم المحوري والجرثومية طبقة المواصفات في الثقافة، والسماح الاستدلالات إلى بذل المتعلقة بالتنمية المحورية في الجسم الحي 19،21. لهذه الأسباب الأسلوب لديه القدرة على إجراء تحليل مفصل الآلية من العمليات التي قد يكون من الصعب للدراسة في الجنين. وعلاوة على ذلك، تطبيق المحتمل في توليد الأنسجة والأعضاء التي لا يمكن الحصول عليها بسهولة في ثقافة ملتصقة نظرا لعدم وجود محراب الخلوية المهيكلة مثلالحبل الشوكي سلائف 21 والحركية الخلايا العصبية. ثقافة الإجمالية ثلاثي الأبعاد يوفر الهيكل المادي والبيئة مما يشير إلى أن قد لا تكون قابلة للتحقيق بالوسائل التقليدية، مما يؤدي إلى اتباع نهج جديد لاشتقاق الأنساب الجنينية بطريقة نظمت مكانيا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350-010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">25cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">690 175</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:116px;">MSE</td>
			<td style="width:87px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:235px;">BES Buffered Saline (BBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">B2891</td>
			<td style="width:188px;">BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Centrifuge tubes (15 or 50ml)</td>
			<td style="width:116px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:87px;">118271 or 227261</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">CHIR 99021 (Chi)</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Dissection Well (30mm Internal Diameter)</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:87px;">12678586</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">ESLIF</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:188px;">500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 &#181;L LIF (1000 units).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:87px;">FB-1090/500</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Gelatin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Glasgow&#39;s Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">11710-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">35050-038</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G5516</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Improved Neubauer Haemocytometer</td>
			<td style="width:116px;">Hawksley</td>
			<td style="width:87px;">AS1000</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">n-Propyl-gallate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">02370</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:235px;">N2B27/NDiff 227</td>
			<td style="width:116px;">Stemcells, Inc.</td>
			<td style="width:87px;">SCS-SF-NB-02</td>
			<td style="width:188px;"><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11140-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">P6148</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">D8662</td>
			<td style="width:188px;">With Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11360-039</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sterile Reservoir</td>
			<td style="width:116px;">STARLAB</td>
			<td style="width:87px;">E2310-1010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">650185</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">X100</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">25300-054</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro

قمنا بتطوير بروتوكول تحسين الحالية مضغي الجسم (EB) الثقافة التي تسمح للدراسة التنظيم الذاتي، والتماثل كسر، واستطالة المحورية ومواصفات مصير الخلية باستخدام مجاميع من الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) في الثقافة تعليق. يتم تجميع أعداد صغيرة من mESCs في المتوسط ​​القاعدية لمدة 48 ساعة في لوحات 96-جيدا معاملة غير الأنسجة الثقافة، U القاع، وبعد ذلك هم أكفاء للرد على الإشارات التجريبية. بعد العلاج، وهذه المجاميع تبدأ تظهر علامات الاستقطاب التعبير الجيني وتغيير تدريجيا التشكل من كتلة كروية من الخلايا ل، هيكل منظم بشكل جيد ممدود في غياب إشارات التباين الخارجية. هذه الهياكل ليست فقط قادرة على عرض علامات الطبقات الجرثومية الثلاث، ولكن بنشاط عرض الحركات الشبيهة تكون المعيدة، يتضح من الخلع الاتجاه من الخلايا الفردية من مجموع المباراتين، والذي يحدث بشكل حاسم في منطقة واحدة من هيكل ممدود. هذا protocيوفر رأ طريقة مفصلة لتشكيل استنساخه من هذه المجاميع، والتحفيز مع إشارات مثل تفعيل WNT / β-Catenin وBMP تثبيط وتحليلها من قبل واحدة الوقت نقطة أو الوقت الفاصل بين فلوري المجهر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تعديلات على إجراءات الجنين تلوين كامل جبل الماوس الحالية لتحليل immunocytochemical من علامات محددة ضمن المجاميع الثابتة. التغييرات في مورفولوجية والتعبير الجيني وطول المجاميع يمكن قياسها كميا، وتوفير المعلومات حول كيفية إشارات يمكن أن يغير مصير المحورية. ومن المتوقع أن هذا النظام يمكن تطبيقه على حد سواء لدراسة أحداث التنموية في وقت مبكر مثل تطوير محوري والتنظيم، وعلى نطاق أوسع، وعمليات التنظيم الذاتي واتخاذ القرارات الخلوية. وقد تقدم مكانة مناسبة لتوليد أنواع الخلايا الموجودة في الجنين التي لا يمكن الحصول عليه من ثقافة ملتصقة التقليدية مثل الحبل السري والخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري.

ظهور الخلايا مباشرة بعد الطلاء وبعد تجميع مباشرة بعد الطلاء، يمكن للمرء أن يلاحظ وجود خلايا واحدة داخل كل بئر من لوحة 96-جيدا مع معيار مقلوب الأنسجة الثقافة المجهر (الشكل 1B). في غضون 8 ساعة من الطلاء، وبدأت هذه الخلايا أن ينزل إلى أسفل بسبب جيدا لخطورة وسيكون قد بدأت تتجمع في مجموعات منفصلة (الشكل 1C). بعد 24 ساعة، فإن الخلايا ائتلافه قد أكملت التجميع الرئيسي، وسوف يكون ضغط في واضحة المعالم، وحدات بعد خشنة حيث الخلايا الفردية هي غير واضحة عن بعضها البعض (الشكل 1D). وبحلول نهاية اليوم الثاني (48 ساعة)، ينبغي أن المجاميع تبدو &quot;نظيفة&quot;، بعد أن تناولها كل الخلايا داخل البئر (الشكل 1E)؛ أسفل البئر قد يكون لها بعض الخلايا التي تم تسليط من مجموع المباراتين في هذه المرحلة. توفيرأن المجاميع تم تجميعها في N2B27، في هذه نقطة في الوقت، ينبغي أن تكون كروية، ما يقرب من 150-200 ميكرون في القطر، وتتحرك بحرية داخل البئر (أي، لم تلتزم قاع الآبار). تجميع في وسائل الإعلام الأخرى (أي.، ESLIF أو N2B27 مع عوامل معينة) لديه القدرة على تغيير كل من التشكل الكلي الأولي والاستجابة للمؤثرات اللاحقة (تيرنر وآخرون، قيد الإعداد). ممثل المورفولوجية التغييرات إضافة نبض 24 ساعة من المتوسطة الثانوية التي تحتوي على شي ما بين 48 و 72 ساعة (الشكل 1A، 5A) يولد اضحة المعالم المجاميع ممدود التي تظهر التعبير الاستقطاب في علامات معينة من طبقات جرثومية 19،21. مباشرة بعد نبض تشي (72 ساعة)، وسوف تبدأ المجاميع لإلقاء الخلايا والبدء في إظهار استجابتها لهذه الإشارات في نهاية هذا اليوم (الشكل 3A). هذه الردودتتجلى من خلال التغيرات في التعبير الجيني والتشكل، وكلاهما يعتمد على العلاج الذي المجاميع قد تلقت بعد فترة التجميع 48 ساعة الأولي في N2B27 (الشكل 3B). إذا كنت بحاجة فقط إلى تحليل نقطة النهاية، الوقت الأمثل لصورة الركام هو في حوالي 96-120 ساعة. في هذه المرحلة سيكون قد وضعت المجاميع الأشكال التضاريسية واضحة وأنماط التعبير الجيني (الشكل 3A)، وحجمها والكتلة لا تزال منخفضة بما فيه الكفاية بحيث طرد المتوسطة من P200 ماصة كافية لطرد أي التي قد تعلق. والفشل في منع الحجز على مجموع المباراتين إلى البئر يؤثر سلبا على تشكيل الكلي (الشكل 5Biv). ويمكن تغيير نمط الأشكال التضاريسية والتعبير الجيني للمجاميع اعتمادا على العلاج. وتظهر نتائج تمثيلية للأنظمة مستدامة أو نابض مع أي علاج واحد أو مزيج من العوامل لBMP4، Dorsomorphin H1 (Bالنائب مستقبلات المانع)، ActivinA، SB43 (Activin / المانع العقدية)، bFGF أو PD03 (مجاهدي خلق المانع) (الشكل 3B). التصوير الكلي والكمي تحليل الصور المجاميع قابلة للتصوير إما عن طريق الفحص المجهري widefield (بشكل أساسي عن الوقت الفاصل بين التصوير 19)، أو ثابتة وimmunostained للتصوير متحد البؤر 19،21 (الشكل 2). البروتوكول والتصوير الوصف الحالي فوق يسمح المعلومات الكمية التي يمكن جنيها من هذه المجاميع. ويمكن قياس؛ إثر متحد البؤر أو التقاط صورة واسعة المجال، وطول والتعبير الجيني المقابلة على طول القطر أو العمود الفقري من مجموع (الشكل 4A، B كروية أو مستطيلة على التوالي). هذه التحليلات هي أيضا قابلة للتطبيق مباشرة إلى صور مرور الزمن، حيث يمكن للمرء الحصول على معلومات من معدل النمو والحجم واستطالة من الركام في ظل ظروف مختلفة (الشكل 4 </strong&gt;). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> الشكل 1. نموذجي وقتا بالطبع والأشكال التضاريسية في وقت مبكر. (A) وبالطبع الوقت النموذجي للتجارب التجميع. يتم تجميع الخلايا لمدة 48 ساعة في N2B27 تحتوي على تعليق الماوس خلايا ES (10 خلية / ميكرولتر) في لوحة 96-جيدا (P1، P2) (B) على الفور بعد الطلاء (ر = ~ 5min)، يمكن أن الخلايا الفردية تكون ينظر في التعليق وبدأت لتشكيل كتل من قبل 8H (C). (D) بعد 24 ساعة وقد شكلت الخلايا التجميعية واحد في كل جانب وهو ما يقرب من 100 ميكرون في القطر. (E) بعد 48 ساعة التجميع، ومجموع ويتراوح قطرها 150-200 ميكرون. في هذه المرحلة، والمتوسطة التجميع (N2B27) تتم إزالة ويتم إضافة المتوسطة الثانوي إما لبقية التجربة (P1 في جزء A) أو لمدة 24 ساعة قبل أن يتم تغييرها ب<html> ACK إلى N2B27 (P2 في جزء A). يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> الشكل 2. تركيب المجاميع على الشرائح المجهر. وبمجرد إصلاح الركام، immunostained ووضعها في تصاعد المتوسطة، وpipetted كل مجموع المباراتين على شريحة المجهر بمثابة قطرة 17 ميكرولتر (A، B، B &#39;). ترك مساحة كافية بين قطرات الإجمالية لمنع دمج الخاصة بهم. مصنوعة الفواصل مع الشريط مزدوجة من جانب وضعها في كل زاوية من شريحة المجهر (A، A، B). فمن على هذه أن يتم وضع ساترة الزجاج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig3.jpg" /> الشكل 3. تأثير العلاجات المختلفة على مورفولوجيا الخلايا ES تجميعها. وبعد أيام 2 في N2B27، وقد شكلت خلايا ES الركام. بالإضافة إلى ذلك من العوامل المحددة إما نبض 1 يوم (A) أو باستمرار (B) يمكن تغيير النمط الظاهري من الركام فيما يتعلق قطبية التعبير الجيني، وإمكانات استطالة، أو شكلها العام. الأمثلة في هذا الشكل هي مجاميع تشكلت من إما البرازيلي :: GFP 30 (A) أو Sox1 :: GFP 27 (B) الماوس خلايا ES تصويرها بعد 120 ساعة، وتعامل كما هو مبين. تشي: CHIR 99021 31؛ SB43: SB 431542 32؛ DM: DorsomorphinH1 33،34. PD03: PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ال</a>هو الرقم. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> الرقم 4. التحليل الكمي من الركام. A مجموع نموذجي تشكلت من البرازيلي :: mESCs GFP 25،30 التالية نبضه 24 ساعة من تشي وتصويرها في 120 ساعة. ويظهر صورة المدمجة للحقل مشرق وقناة GFP مع خط مجزأة بمناسبة &quot;العمود الفقري&quot; للمجموع من النقطة A إلى B (A)، جنبا إلى جنب التي مضان وطول مجموع المباراتين يمكن قياس (B). وترد طول (C) و &quot;الاستدارة&quot; (D) في الفترة من 24 المجاميع داخل نفس التجربة. واصفات شكل مثل استدارة (D)، دائرية، ومحيط منطقة يمكن قياسها باستخدام صورة تحليل كتاب الطبخ المساعد من تحليل صورة البرمجيات فيجي 35. يعني المشار إليها بواسطة خط أفقي في كل نقطة في الوقت.أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. شريط النطاق في (A) إلى 200 ميكرون. كما أن هناك اختلافات طفيفة بين خطوط الخلايا مراسل، ومن المتوقع أنه بعد نبضة من تشي، متوسط ​​الطول الأقصى ومتوسط ​​الحد الأدنى استدارة من المجاميع سوف تختلف. بين خطوط مختلفة من الخلايا، نجد أن متوسط ​​الحد الأقصى لطول يمكن أن يكون في نطاق 400-800 ميكرون ~ والحد الأدنى من متوسط ​​كروية بين 0.4 و 0.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> الشكل 5. أمثلة على الفشل في تشكيل الكلي، وتعتمد القدرة على توليد المجاميع استنساخه (A) على العوامل الحاسمة مثل (بي) المتوسطة الثانوية الطازجة وتمتزج جيدا، (BII، BIII) دقة في عد ن الأوليبني مصفر من الخلايا و(BIV) ضمان المجاميع لا تشكل مستعمرات ملتصقة أي.، &#39;حادث&#39; إلى سطح البئر. وترد أمثلة نموذجية من الأخطاء في تشكيل الكلي لكل من الشروط المذكورة (B). النطاق شريط كما هو مبين. رؤية حل المشاكل الجدول للحصول على التفاصيل (الجدول 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> يتم إعطاء الجدول 1. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. الأخطاء النموذجية المترافقة مع بروتوكول تجميع مع المقترحات لحلها. <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> 2. الجدول من خطوط الخلايا اختبار الجدول لتشكيل AGGregates. وهناك عدد من خطوط الخلايا 19،22،27،30،36-40 اتسمت لتشكيل وحدات العمل و، على الرغم من الفروق الدقيقة بين خطوط الخلايا من المتوقع، وقد لوحظ، كل الأسطر أعلاه تظهر ديناميات مماثلة من حيث من استطالة والتشكل. من حيث التعبير الجيني، نمط التعبير تقتصر على التعبير عن الجينات، ولكن في كل خط الخلية، ونمط التعبير يتفق عموما على مدى عدد من الممرات. من أجل التناسق، ونحن توليد مجاميع من الخلايا التي لم تتجاوز 15 الممرات في الثقافة. <img alt="الجدول 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> جدول 3. قائمة أجسام تمثيلية المستخدمة في هذه الدراسات. مجموعة مختارة من الأجسام المضادة وعوامل التخفيف تستخدم لالمناعية الكلي.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro at JoVE.com

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ<em&gt; في المختبر</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

generation-aggregates-mouse-embryonic-stem-cells-that-show-symmetry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

17.4K Views.  University of Cambridge. We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Video: Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

رسم خرائط التنظيم المكاني الناشئ للخلايا الثديية باستخدام الأنماط الدقيقة والتصوير الكمي

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.