Este trabalho é financiado por um Investigator Award ERC Avançado para AMA (DAT, TB), com uma contribuição de um Grant Projeto do Wellcome Trust para AMA, uma bolsa de estudo para EPSRC PB-J e Erasmus, Stichting dr. De Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds e Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te &#39;s-Gravenhage para SCvdB. Queremos agradecer a J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, e T. Rodriguez, para discussões e críticas construtivas, Joaquin de Navascués para o protocolo de meio de montagem e ambos AK Hadjantonakis e C. Budjan para a partilha de protocolos do seu laboratório relativas à coloração de embriões inteiros de montagem. Uma versão anterior deste artigo foi previamente disponibilizado no bioRxiv Preprint Servidor 29.

1. Condições de Cultura Antes de Agregação <ol><li> Manter mESCs em forma ESLIF (ver Tabela de materiais específicos e materiais para formulação) em frascos de 2-tecido tratado de cultura revestidos com gelatina 25cm de num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2 21-25. </li><li> Cultivar células por pelo menos duas passagens deixar descongelar antes de usar neste protocolo; células em passagens inferiores são geralmente mais bem sucedido na geração de características reprodutíveis ao longo repetições experimentais (isto é., há mais de 15 passagens em cultura), ainda que ligeira variação entre as diferentes linhas de células ES é para ser esperado (ver Tabela 2 para as linhas celulares testadas ). </li><li> Crescer as células até 40-60% de confluência. Não utilize células over-confluentes para agregação. </li></ol> 2. Geração de Agregados <ol><li> PBS pré-quente (+ Ca2 +, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27 </sup&gt; e tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Aspirar o meio de cultura a partir do balão de cultura de tecidos (passo 1.3). Lavar o balão suavemente com 5 ml de PBS, duas vezes. Aspirar o PBS e adicionar 1 a 2 ml da pré-aquecido tripsina-EDTA (0,25%) para dissociar as células. <ol><li> Colocar o balão na incubadora para &lt;5 min ou até que as células já totalmente separada da superfície do frasco. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 1 ml para gerar suspensão de células individuais para a contagem exacta e a formação uniforme da dimensão do agregado. </li></ol></li><li> Neutralizar tripsina com 5-10 ml ESLIF; lavar a superfície de crescimento para maximizar a recuperação de células e transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml. Remove-se uma alíquota de 1 ml a partir do tubo de centrífuga e contar as células com um hemocitómetro. </li><li> Determinar o volume de suspensão requerida para dar 10 células / ul (toda uma placa de 96 poços requer 4 5x10 células em 5 ml de uma suspensão). Contar as células de forma precisa, tão grande Deviatiões de o número de células indicado pode afectar a resposta dos agregados aos estímulos. </li><li> Adicionar 5x10 4 células para 5 ml pré-aquecido PBS num tubo de 50 ml fresco centrífuga de rotação e a ~ 170 x g durante 5 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente o PBS e adicionar 5 ml de pré-aquecido PBS suavemente; não perturbar o sedimento no fundo do tubo. Centrifugar a 170 xg durante ~ 5 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente PBS durante um segundo tempo. Remover o máximo possível de PBS sem perturbar o sedimento como PBS transição pode afectar adversamente a agregação. Ressuspender o sedimento em primeiro lugar, em 1 ml de N2B27 quente com uma pipeta P1000 para gerar uma suspensão de células homogénea, seguido de outra adição de N2B27 para o volume requerido (por exemplo, adicionar 4 ml de 5x10 4 células / 5 ml de suspensão). </li><li> Transferir a suspensão de células para um reservatório esterilizado e pipetar uma gota de 40 ul para o fundo de cada poço de um não-tecido-cultura tratada, &#39;u&#39; de fundo 96-Well placa utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Cobrir a placa com 96 cavidades com a sua tampa correspondente e confirmar a presença de células com um microscópio invertido de bancada (Figura 1B). Nota: É essencial que estas placas são usados ​​para limitar a possibilidade de as células aderentes. Não revestir o fundo da placa de 96 poços com gelatina, fibronectina ou qualquer outro revestimento que promove a adesão celular. </li><li> Incubam-se as células durante 48 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 para a agregação. </li></ol> 3. Aplicando Estímulos e Alterando Médio <ol><li> Após o período de incubação de 48 horas, observar o aparecimento dos mESCs dentro de cada poço da placa de 96 poços para confirmar a agregação de sucesso (Figura 1E). Nota: Os agregados aparece na natureza esférica e cerca de 150-200 um de diâmetro. Consulte a seção de solução de problemas se surgirem problemas (Tabela 1). </li><li>0; Adicionar 150 ul de meio secundário fresco (3 uM Chi99021 (CHI) em N2B27 19; estoque preparadas a 10 mM em DMSO) a cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Pipeta com força suficiente para desalojar quaisquer agregados que podem ter começado a aderir ao fundo dos poços. Incubar agregados em meio secundário durante 24 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 1A). Nota: agregados alongados e polarizadas reproduzíveis são gerados usando esse meio secundário. Outras composições de meio secundário também pode ser utilizado, dependendo das condições experimentais necessários e exemplos são mostrados na Figura 3. </li><li> Para subsequentes mudanças de meio, utilizar uma pipeta de multicanal a um ângulo (aproximadamente 30 °) para remover suavemente a 150 ul do meio secundário a partir do lado de cada poço. Em seguida, pipeta 150 uL N2B27 frescos em cada poço com uma força suficiente para desalojar quaisquer agregados que possam ter inícioEd a aderir ao fundo dos poços. </li><li> Repita o ponto 3. 3 a cada 24 horas até que o curso de tempo está completo (o comprimento típico de um experimento cultura agregado é de 120 h). Nota: Certifique agregados estão se movendo livremente na sequência de alterações médias a garantir a reprodutibilidade e consistência dentro e entre cada placa de 96 poços. Médio deve ser trocada diariamente após o período de agregação. </li></ol> 4. Preparação de Unidades de imunocoloração e análise por microscopia confocal <ol><li> Fixação e Primary Antibody Incubação Nota: O protocolo descrito por AK Hadjantonakis 28 foi modificado para se adequar a imunocoloração de MESC agregados. Para os anticorpos típicos usados ​​nos nossos estudos e as suas diluições, referem-se ao trabalho publicado anteriormente 19,21,24,25,29 e Tabela 3. <ol><li> Use uma pipeta multicanal realizada em um ângulo (aproximadamente 30 °) para remover suavemente 150 ï¿½ de meio do o ladof cada poço da placa de 96 poços. Lavar duas vezes por pipetagem de 150 ul de PBS em cada poço. Deixe um par de minutos entre cada lavagem para permitir que os agregados para resolver. </li><li> Definir uma pipeta P1000 para dispensar 200 ul, fixe a ponta da pipeta e correspondente cortada a cerca de 3 mm da extremidade da ponta, com um par de tesouras estéreis. Desenhar uma porção de PBS em cada poço da placa de 96 poços de um modo curto na ponta e expeli-lo para agitar o agregado. </li><li> Utilizar o mesmo ponta para elaborar o volume inteiro dentro do poço, incluindo o agregado e pipeta em uma pequena (30 mm de diâmetro) de vidro de Drosophila bem dissecção. Transferir todos os agregados a partir da placa de 96 poços que serão submetidos a regimes de imunocoloração idênticos na mesma dissecção vidro bem. Nota: Utilize uma nova ponta de pipeta corte na transferência de agregados de diferentes condições experimentais para evitar a passagem de agregados. </li><li> Coloque o poço de vidro que contém o aggregates em um microscópio de dissecção. Agitar o vidro bem para forçar os agregados para o centro e aspirado PBS de um lado do poço com uma pipeta de Pasteur de vidro. Utilizar o microscópio para garantir que os agregados não são aspirados. Deixar um pequeno volume de PBS para dentro do poço de vidro para cobrir os agregados para impedir que sequem. </li><li> Adicionar 1 ml de formaldeído preparado de fresco (4%) dissolvidos em PBS e incubar durante 2 horas a 4 ° C num agitador orbital, ajustado para uma velocidade baixa. Atenção: O paraformaldeído é conhecido por ser alergênico, cancerígeno e tóxico. Use proteção adequada durante a manipulação. </li><li> Após a fixação, aspirar a solução de formaldeído no mesmo modo que o descrito no ponto 4. 1. 4 e lava-se os agregados com 1 ml de PBS três vezes, 10 minutos para cada lavagem com, num agitador orbital, ajustado para uma velocidade baixa. </li><li> Aspirar o PBS como descrito no ponto 4. 1. 4 e executar mais três lavagens de 10 min, com PBS contendo 10% de soro fetal bovino e 0,2% de triton X-100 (PBSFT). Execute as lavagens de 10 min em um agitador orbital ajustado para uma velocidade baixa. Nota: O uso de soro fetal bovino (FBS) resulta em um tampão de lavagem clara, reduzindo o número de agregados que de outro modo seriam perdidos durante o protocolo de se foi utilizado leite. É importante notar que, após a fixação, os procedimentos de imuno-histoquímica pode ser realizada em vários outros que os descritos abaixo modos e deve ser determinada e optimizada pelo investigador. </li><li> Bloquear os agregados durante 1 hora a 4 ° C em PBSFT em um balancim orbital ajustado para uma velocidade baixa. O protocolo pode ser pausada, neste ponto, e agregados bloqueado O / N, com agitação constante em uma cadeira de balanço giratório horizontal, a 4 ° C. </li><li> Aspirar o PBSFT como descrito anteriormente (ver Secção 4. 1. 4) e incuba-se os agregados com 500 ul do anticorpo primário necessário diluído em PBSFT O / N a 4 ° C num agitador orbital ajustado a baixa velocidade. Cubra com filme de parafina para evitar a evaporação. </li></ol></li><li> Incubação do anticorpo secundário <ol><li> Aspirar a solução de anticorpo primário e lava-se com 1 ml PBSFT (a 4 ° C) do seguinte modo: duas vezes durante 5 min; três vezes durante 15 min; e de quatro a sete vezes durante 1 h. Executar cada etapa de lavagem a 4 ° C e em um balancim orbital ajustado a baixa velocidade. Nota: Frio meio de lavagem antes da utilização. Não realizar as lavagens em gelo como este pode fazer com que os agregados de fragmento. </li><li> Aspirar o meio de lavagem final e incubar os agregados com o anticorpo secundário necessário em 500 ul PBSFT O / N a 4 ° C no escuro num giratório oscilante horizontal. Adicionar corante nuclear tal como Hoechst, se necessário. </li></ol></li><li> Montagem e imagem por confocal microfilme <ol><li> Lave os agregados, tal como descrito no ponto 4. 1. 4 com 4 ° C PBSFT. Após a lavagem final, lavar os agregados com 1 ml de PBS contendo 0,2% de FBS e Triton X-100 (PBT) do seguinte modo: duas vezes durante 5 min; três vezes durante 15 min. Realizar lavagensà TA em um balancim orbital ao abrigo da luz. </li><li> Aspirar o meio tal como anteriormente descrito (secção 4. 1. 4) e incubar durante 30 min no escuro com uma solução 1: 1 de glicerol: PBT (1 ml) seguido de uma segunda incubação de 30 min com uma mistura 7: 3 de solução de glicerol: PBT (1 mL). Nota: Misturar o glicerol e soluções de PBT a 4 ° C utilizando um rotor. </li><li> Aspirar o glicerol final: solução PBT e substituir com 1 ml de meio de montagem 24. O protocolo pode ser pausado a este ponto antes da montagem (se estiver em pausa, selar os poços com a película de parafina e armazenar os poços de coloração a 4 ° C). </li><li> Monte os agregados sobre lâminas de microscópio pipetando-los em 17 gotas ul com uma ponta de corte P20 (Figura 2). Dobre fita dupla face volta sobre si mesmo quatro vezes para gerar espaçadores e anexar a cada extremidade do slide. Coloque a parte superior lamela (22 mm x 60 mm) sobre estes espaçadores (Figura 2). Nota: é essencial que uma ponta de corte éutilizado nesta fase, de modo a não danificar as amostras. Os espaçadores evitar o esmagamento dos agregados lamela. </li><li> Uma vez que os agregados são montados, imagem as amostras usando microscopia confocal utilizando protocolos previamente descritos 19,21,24,25. Uma vez colocado no microscópio, deixar a lâmina em repouso sobre o palco por alguns minutos para permitir que os agregados se estabelecer dentro do meio de montagem. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

A técnica descrita neste manuscrito de forma eficiente e reprodutível gera agregados de células-tronco embrionárias (mESCs) que a exibição organizada quebra de simetria e alongamento 19, combinando a cultura gota em suspensão descrita por Marikawa et al. 14 e EB formação. Estes agregados em ir para desenvolver alongamentos axiais, complementando os métodos existentes para a geração de órgãos anteriores de células-tronco embrionárias, como copos óptica 11 e do córtex cerebral 13, e contêm células com identidades das camadas que processos semelhantes àqueles durante a gastrulação visor de três germinativas tais como 19,21 movimento celular rápida. É interessante especular sobre a natureza do evento de quebra de simetria, uma vez que ocorre na ausência de tecidos de padrões externos e assimetria zigótica cues 19. A formação espontânea de um eixo rudimentar pode surgir a partir de pré-existente heterogeneities na cultura inicial de células, que formam a base para o desenvolvimento de assimetria. Com efeito, as populações de células cultivadas em condições ESLIF exibir uma mistura de auto-renovação e diferenciação das células, as proporções relativas que podem variar de um para o outro agregado. Além disso, trabalhos preliminares no nosso laboratório sugerem que os agregados a partir de uma população total de células pluripotentes mostram desenvolvimento retardado e defeitos no padrão, o que sugere um papel para a heterogeneidade na formação de padrões organizada (DA Turner &amp; A. Martinez Arias, em preparação). Também vale a pena considerar que um mecanismo de reacção em difusão podem gerar o padrão, com a difusão de um inibidor da distância a partir da superfície do agregado. Warmflash et al. 41 sugerem que tal mecanismo poderia ser responsável pelo desenvolvimento de assimetria radial na cultura aderente, tornando-se um possível candidato para a modelação em três dimensões. Durante o INITIAl agregação período de 48 horas, as células atingem um estado semelhante ao que dentro do epiblast pós-implantação, em que são competentes para responder a sinais a partir do meio secundário 19,21,24. Tipicamente, o protocolo descrito aqui fornece as células com um pulso de meio secundário que contém factores (tais como agonistas de Wnt / β-catenina) que fornecem os sinais suficientes para alongamento. Os métodos de cultura anteriores descritos por Lancaster et al. (CES humanos usando 13) e Eiraku et al. (Com mESCs 11) usado um curto período de agregação em baixa aderência placas de 96 poços antes de células agregadas foram transferidas para gotas de Matrigel para on- indo cultura. Embora o tempo entre a inserção e a agregação de Matrigel foi diferente entre os estudos, em ambos os casos, foram utilizados grandes números de células por formação de agregados (cerca de 3,000-4,500 células). Por outro lado, o protocolo descrito aqui 19 usa muito menos células (aproximadamente 400 célulaspor agregado) que foi determinado ser absolutamente essencial para o processo de alongamento, quebra de simetria e a polarização que é observada 19. Além disso, estas estruturas alongadas são capazes de ser gerado num tempo muito mais curto período sem incorporar em matrizes artificiais: Comparar a geração de regiões cerebrais definidos por Lancaster et al (&gt; 20-30 dias) 13 e a óptica de copos Eiraku. et al. (~ 11 dias) 11 com os 5 dias requeridos para a geração de estruturas alongadas polarizadas. Uma das limitações com o método de cultura descrito aqui no entanto, é que eles só podem ser cultivados durante cerca de 5-6 dias após o plaqueamento, até o seu tamanho torna-os competente sob acção da gravidade a afundar-se para o fundo dos poços e forçar uma aderência ainda não sobre -Revestido-ware plástico. Outros experimentos que utilizam matrizes artificiais, como os mencionados anteriormente, pode permitir-nos aumentar o período deda observação e experimentação, e trabalho está em curso para determinar os efeitos de restringir os agregados de tal maneira. Uma outra limitação desta técnica é que, a fim de alterar a forma sem remover os agregados, um pequeno volume do meio deve ser deixada no fundo do poço. As consequências para as abordagens de genética químicos são a necessidade de considerar esta diluição e quaisquer efeitos residuais de mídia anterior: no dia do 3? M Chi pulso, 2,37 mM solução é efectivamente entregue, e as mudanças médias posteriores resultar em um carry-over de 0.499 ? M (72-96 horas) e 0,105? M (96-120 horas) entre os pontos temporais. Trabalho em curso não tenha corrigido para diluição e presume-se que as mudanças médias diárias irá minimizar os efeitos residuais. Há uma série de etapas críticas do protocolo para garantir a reprodutibilidade intra e inter-experimental. Em primeiro lugar, a cultura a partir de mESCs deve ser bem conservado e não sobre confluent e meio deve ser sempre de boa qualidade ie., frescos e bem misto (Figura 5A, B). Condições de cultura pobres afectar adversamente a agregação (Figura 5Bi). Contagem precisa das células para se obter uma suspensão de células ~ 400 células / 40 ul é essencial, como agregados maiores não se auto-organizam e são mais propensos a formar agregados duplos dentro de cada poço (Figura 5Bii) enquanto que os agregados mais pequenos são incapazes de alcançar a correcta densidade, onde eles são capazes de responder ao estímulo (Figura 5Biii). Um passo chave optimização era a inserção de uma segunda lavagem com PBS que remove contaminantes de soro a partir da suspensão de células (passo 2.6); este melhorou a frequência agregação e acelerou o desenvolvimento de agregados por aproximadamente 24 horas. Em seguida, assegurando alterações médias são aplicados com uma força suficiente para desalojar quaisquer agregados que têm o potencial para aderir à superfície do poço; não fazê-lo results em &#39;crashing&#39; os agregados (Figura 5Biv). Além disso, e tal como mencionado anteriormente (e abaixo), que é essencial para assegurar que os agregados são mantidas em cultura em suspensão e são impedidas de aderir a qualquer superfície. Uma vez que os agregados ter aderido, o padrão de expressão do gene e o seu potencial de alongamento sejam perturbadas. Como esta técnica é relativamente simples, e bem no âmbito das competências dos indivíduos com boas técnicas de cultura de tecidos, a maioria dos problemas associados com agregação pode ser resolvido de forma relativamente rápida se essas etapas críticas são seguidas; uma mesa cheia de resolução de problemas está disponível (Tabela 1). Uma vez dominado, esta técnica pode ser utilizada para estudar o desenvolvimento axial, a quebra de simetria e célula-decisão eventos. Mais especificamente, estes agregados possuem o potencial para gerar bancos de células que até agora têm sido disponível na cultura, tais como a medula espinal e do motoneurônios r. Nota ética: Deve-se observar com a devida cautela que a tradução deste protocolo para ES humanos ou cultura de células iPS poderia trazer o experimentador perto da base jurídica de o limite de 14 dias sobre a investigação em embriões humanos, ou seja, a geração de uma linha primitiva, conforme detalhado na Fertilização Humana e Embriologia Act 2008 (Reino Unido) 42. Uma vez que a Lei abrange todos os embriões humanos vivos, independentemente da sua forma de criação, a cultura de gastruloids humanos além da primitiva-raia como etapa seria para além do âmbito da investigação licenciável.

O estudo ea compreensão do destino celular no desenvolvimento de mamíferos precoce pode fazer uso de culturas de células-tronco embrionárias (CES), populações clonais derivadas de blastocistos que têm a capacidade de auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células de um organismo ie., eles são 1,2 pluripotentes. Embora essas culturas têm sido e continuam a ser úteis para a compreensão da base molecular de o destino celular, eles são incapazes de reproduzir alguns dos arranjos espaciais e comportamentos globais que são gerados em embriões durante a gastrulação. No embrião, o processo de gastrulação transforma uma única camada epitelial para as três camadas germinais diferentes e dota o embrião com uma organização ântero-posterior aberta 3-5. Tentativas para recapitulam estas eventos ex vivo têm sido baseados na geração de agregados tridimensionais de CES, referidos como corpos embrióides (EBS), e submetendo-os to condições de diferenciação 6,7. Estes agregados podem ser induzidas a diferenciarem-se em muitos tipos de células diferentes, alguns dos quais são incapazes de ser obtido ou induzida com baixa eficiência em cultura aderente ou não podem ser produzidos de forma alguma; por exemplo, sangue. 8 e 9 as células germinativas primordiais. Uma limitação na utilização dos EBs no entanto, é que eles não são capazes de exibir o comportamento morfogenético, distribuição camada germinal ou organização axial, que são as principais características do embrião em desenvolvimento, resultando em desorganização espacial 6,10. Em um relatório, o tratamento da EBS com Wnt conduz a uma fraca polarização na expressão do gene em alguns agregados, mas não é claro morfogénese observado 7. Em relatórios mais recentes, EBs que foram cultivadas por períodos de tempo prolongados desenvolver estruturas anteriores, tais como as retinas, córtex e células sensoriais do ouvido interno, que imitam os seus homólogos embrionárias mas sem desenvolver no contexto de uma organizat axialião 11-13. Um relatório Marikawa et al. 14, enquanto que trabalha com agregados de carcinomas de células do rato P19 de embriões (CE) formados pelo método de gota suspensa, relataram o aparecimento de estruturas alongadas de origem mesodérmica reminiscente dos alongamentos que são observados com exogastrulae em anfíbio e embriões de ouriço do mar e Keller explantes 15-18. Como isto não tinha sido observado com células-tronco embrionárias de rato (mESCs), buscou-se reproduzir o comportamento observado com células P19 CE utilizando agregados de mESCs 19 e nós relatamos condições de cultura que levam à sua quebra de simetria e alongamento axial. Uma diferença importante do trabalho com células P19 é que o protocolo de agregação descrita aqui é realizado numa placa de 96 poços, semelhante ao descrito por Eiraku et al. 20, em vez de ficar pendurado gotas. Esta alteração resultou em um aumento da eficiência em termos de recuperação total e em ambosreprodutibilidade intra e inter-experimental. É importante ressaltar que a manutenção de agregados em poços individuais garante que a fusão entre os agregados (comum quando o agrupamento de agregados pendurado gotas) não ocorre. Além disso, uma característica chave do protocolo é de 24 horas de exposição ao inibidor da GSK3 CHI99021 (Chi), um potente activador da sinalização de Wnt / β-catenina, após agregação. O método descrito aqui fornece uma base para a compreensão dos processos de auto-organização, organização axial e especificação camada germinativa em cultura, permitindo inferências a serem feitas sobre o desenvolvimento axial in vivo 19,21. Por estas razões, o método possui o potencial para permitir a análise mecanicista detalhada de processos que podem ser difíceis de estudar no embrião. Além disso, uma aplicação potencial é na produção de tecidos e órgãos que não são facilmente obtidos em cultura aderente devido à falta de um nicho, tal como estruturada celularmedula espinhal precursores 21 e motor neurônios. Cultura agregado tridimensional oferece uma estrutura física e ambiente de sinalização que não pode ser alcançado através de meios convencionais, levando a uma nova abordagem para a derivação de linhagens embrionárias de um modo organizado espacialmente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350-010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">25cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">690 175</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:116px;">MSE</td>
			<td style="width:87px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:235px;">BES Buffered Saline (BBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">B2891</td>
			<td style="width:188px;">BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Centrifuge tubes (15 or 50ml)</td>
			<td style="width:116px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:87px;">118271 or 227261</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">CHIR 99021 (Chi)</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Dissection Well (30mm Internal Diameter)</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:87px;">12678586</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">ESLIF</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:188px;">500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 &#181;L LIF (1000 units).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:87px;">FB-1090/500</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Gelatin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Glasgow&#39;s Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">11710-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">35050-038</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G5516</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Improved Neubauer Haemocytometer</td>
			<td style="width:116px;">Hawksley</td>
			<td style="width:87px;">AS1000</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">n-Propyl-gallate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">02370</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:235px;">N2B27/NDiff 227</td>
			<td style="width:116px;">Stemcells, Inc.</td>
			<td style="width:87px;">SCS-SF-NB-02</td>
			<td style="width:188px;"><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11140-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">P6148</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">D8662</td>
			<td style="width:188px;">With Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11360-039</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sterile Reservoir</td>
			<td style="width:116px;">STARLAB</td>
			<td style="width:87px;">E2310-1010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">650185</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">X100</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">25300-054</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro

Nós desenvolvemos um protocolo de corrente melhorando corpo embrióides (EB) a cultura que permite o estudo de auto-organização, a quebra de simetria, alongamento axial e especificação de destino celular utilizando agregados de células estaminais embrionárias de ratinho (mESCs) em cultura em suspensão. Um pequeno número de mESCs são agregados em meio basal durante 48 h em placas de 96 poços não-tecido tratadas com cultura, de fundo em U, após o que são competentes para responder aos sinais experimentais. Após o tratamento, esses agregados começam a mostrar sinais de expressão do gene polarizada e gradualmente alterar a sua morfologia de uma massa esférica de células de uma estrutura alongada, bem organizada, na ausência de sinais externos de assimetria. Estas estruturas não são apenas capazes de exibir marcadores das três camadas germinativas, mas activamente exibir movimentos-gastrulação, como evidenciado por um deslocamento direccional de células individuais do agregado, a qual ocorre fundamentalmente em uma região da estrutura alongada. Este PROTOCol fornece um método detalhado para a formação reprodutível desses agregados, sua estimulação com sinais como a ativação Wnt / β-catenina e inibição BMP e sua análise por ponto de tempo único ou microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Além disso, descrevemos modificações para todo-mount rato procedimentos de coloração embrião atuais para análise immunocytochemical de marcadores específicos dentro agregados fixos. As mudanças na morfologia, expressão gênica e comprimento dos agregados pode ser medido quantitativamente, fornecendo informações sobre como os sinais podem alterar destinos axiais. Prevê-se que este sistema pode ser aplicado tanto para o estudo dos acontecimentos iniciais de desenvolvimento, tais como o desenvolvimento axial e organização e, mais genericamente, os processos de auto-organização e processo de tomada de decisão celular. Também pode proporcionar um nicho adequado para a produção de tipos de células presentes no embrião que são não obtenível a partir de cultura aderente convencional, tal como motores na espinal medula e neurónios.

Aparecimento de células imediatamente após o plaqueamento e após a totalização Imediatamente após o plaqueamento, pode-se observar a presença de células individuais dentro de cada poço da placa de 96 poços com um padrão invertido microscópio de cultura de tecidos (Figura 1B). Dentro de 8 horas de cultivo, estas células vão ter começado a descer para o fundo do poço devida à gravidade e começaram a fundir-se em aglomerados discretos (Figura 1C). Após 24 h, as células de coalescência terá completado a agregação primária, e vai ter compactado em bem definidas, ainda agregados irregulares onde as células individuais são indistintos uma da outra (Figura 1D). Até ao final do segundo dia (48 horas), os agregados devem olhar &#39;clean&#39;, depois de ter tomado todas as células dentro do poço (Figura 1E); o fundo da cavidade pode ter algumas células que foram expelidas do agregado neste estágio. Fornecimentoque os agregados foram agregadas em N2B27, neste ponto em tempo, eles devem ser de forma esférica, cerca de 150-200 um de diâmetro e movendo-se livremente no interior da cavidade (isto é., não aderiram ao fundo dos poços). Agregação em outros meios (ou seja., ESLIF N2B27 ou com factores específicos) tem o potencial de alterar tanto a morfologia dos agregados inicial e a resposta a estímulos subsequentes (Turner et ai., Em preparação). Representante Alterações Morfológicas A adição de um pulso de 24 horas de forma secundária Chi contendo entre 48 e 72 horas (Figura 1A, 5A) gera bem definido agregados alongados polarizado que mostram a expressão dos marcadores específicos das camadas germinativas 19,21. Imediatamente após o pulso de Chi (72 h), os agregados começam a verter e as células começam a mostrar a sua resposta a estes sinais para o fim deste dia (Figura 3A). Estas respostasmanifestam-se por alterações na expressão génica e na morfologia, ambos os quais são dependentes do tratamento que os agregados têm recebido após o período inicial de 48 horas na agregação N2B27 (Figura 3B). Se é necessário apenas uma análise de ponto de extremidade, o momento ideal para a imagem dos agregados é de cerca de 96-120 horas. Neste ponto, os agregados terão desenvolvido morfologias cristalinas e padrões de expressão de gene (Figura 3A), e o seu tamanho e massa são ainda suficientemente baixo de modo que a expulsão de forma de P200 pipeta é suficiente para desalojar quaisquer que possam estar conectados. A falta de impedir a fixação do agregado para o poço vai afectar adversamente a formação de agregados (Figura 5Biv). O padrão dos agregados morfologias e expressão de genes pode ser alterada dependendo do tratamento. Os resultados representativos para regimes sustentados ou pulsados ​​com qualquer tratamento único ou combinações de fatores são mostrados para BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP inibidor do receptor), ActivinA, SB43 (Activina / inibidor nodal), bFGF ou PD03 (inibidor MEK) (Figura 3B). Imagem agregado e Análise de Imagem Quantitative Agregados são passíveis de imagiologia por qualquer microscopia widefield (principalmente para time-lapse imaging 19), ou fixo e histoquímica para imagem confocal 19,21 (Figura 2). O actual protocolo e imagem descrição acima permite que a informação quantitativa a ser adquirida a partir destes agregados. Seguindo confocal ou de campo amplo de captura de imagem, o comprimento e a expressão do gene correspondente ao longo do diâmetro ou da coluna vertebral do agregado (esférica ou alongada, respectivamente; A Figura 4A, B) pode ser medido. Estas análises também são directamente aplicáveis ​​a imagens de lapso de tempo, onde se pode obter informação da taxa de crescimento, o tamanho eo alongamento dos agregados sob diferentes condições (Figura 4 </strong&gt;). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> Figura 1.-curso de tempo típica e início morfologias. (A) O curso de tempo típico para experimentos de agregação. As células são agregadas durante 48 horas em N2B27 contendo uma suspensão de células de rato ES (10 células / mL) em uma placa de 96 poços (P1, P2). (B) Imediatamente após o plaqueamento (t = ~ 5 minutos), as células individuais podem ser visto na suspensão e começaram a formar aglomerados por 8h (C) (D). Depois de 24 horas as células formaram um agregado único em cada cavidade, que é de aproximadamente 100 um de diâmetro. (E) Depois de agregação de 48 h, o agregado diâmetro varia de 150-200 uM. Neste ponto, o meio de agregação (N2B27) é removida e um meio secundário é adicionado, quer durante o resto da experiência (P1 na parte A) ou durante 24 horas antes de ser mudado bACK para N2B27 (p2 em parte A). A barra de escala representa 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> Figura 2. agregados montagem sobre lâminas de microscópio. Uma vez que os agregados foram corrigidos, imunocoradas e colocadas em meio de montagem, cada agregado é pipetada sobre uma lâmina de microscópio, como uma gota de 17 ul (A, B, B &#39;). Bastante espaço é deixado entre as gotículas de agregação para evitar a sua fusão. Os espaçadores são feitos com uma fita de dupla face e colocado em cada canto da lâmina de microscópio (A, A &#39;, B). É sobre estes que uma lamela de vidro é colocado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3. O efeito de diferentes tratamentos sobre a morfologia de células ES agregados. Após 2 dias de N2B27, células ES formaram agregados. A adição de factores específicos, quer como um pulso de 1 dia (A) ou continuamente (B) pode alterar o fenótipo dos agregados com respeito à polaridade da expressão do gene, o potencial de alongamento, ou a sua forma geral. Os exemplos nesta figura são agregados formados a partir de qualquer Bra :: GFP 30 (A) ou Sox1 :: GFP células ES 27 (B) de ratinho fotografadas após 120 h e tratados como indicado. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior do th</a>é figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> Figura 4. A análise quantitativa de Agregados. Um agregado típico formado a partir de Bra :: mESCs GFP 25,30 após um pulso de 24 horas de Chi e fotografada a 120 horas. Incorporada da imagem de campo brilhante e canal de GFP é mostrado com a marcação &quot;coluna vertebral&quot; do agregado do ponto A para B (A) A linha segmentada, ao longo do qual a fluorescência e comprimento do agregado pode ser medida (B). O comprimento (C) e «circularidade» (D) a partir de 24 agregados na mesma experiência são mostrados. Descritores de forma, como o arredondamento (D), circularidade, o perímetro ea área pode ser medida usando a Análise de Imagem Cookbook plug-in do software de análise de imagem FIJI 35. A média indicada pela linha horizontal em cada ponto de tempo;barras de erro indicam o desvio padrão; barra de escala em (A) indica 200 um. Como existem diferenças subtis entre linhas de células repórter, espera-se que, após um pulso de Chi, o comprimento máximo e médio arredondamento mínima média dos agregados pode variar. Entre diferentes linhagens celulares, descobrimos que o comprimento máximo médio pode estar dentro da faixa de ~ 400-800 mm e a redondez mínima média entre 0,4 e 0,6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de falhas na formação de agregados. A capacidade de gerar agregados reprodutíveis (A) depende de factores críticos, tais como (Bi) meio secundário fresco e bem misturados, (Bii, BIII) a precisão na contagem do n inicialúmero de células e (Biv), assegurando os agregados não se formam colónias aderentes ie., &quot;acidente&quot; para dentro da superfície do poço. Exemplos típicos dos erros na formação de agregados para cada uma das condições mencionadas (B) são mostrados. Scale-bar, como indicado; veja a tabela de resolução de problemas para obter detalhes (Tabela 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> Tabela 1. Guia para solução de problemas. Erros típicos associados com o protocolo de agregação são dadas com sugestões para a sua resolução. <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> Tabela 2. Tabela de linhas celulares testadas para a formação dos aggRegates. Uma série de linhas celulares foram caracterizadas 19,22,27,30,36-40 para a formação de agregados e, embora sejam esperadas diferenças subtis entre linhas de células e foram observados, todas as linhas acima mostram dinâmica semelhantes em termos de alongamento e morfologia. Em termos de expressão do gene, o padrão de expressão é específica para o gene expresso, mas dentro de cada linha celular, o padrão de expressão é geralmente consistente ao longo de um número de passagens. Para consistência, geramos agregados de células que não tenham ultrapassado 15 passagens em cultura. <img alt="Tabela 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> Tabela 3. Lista de anticorpos representativos utilizados nestes estudos. A selecção dos anticorpos e os factores de diluição utilizados para imunocoloração agregado.

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Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

17.4K visualizações.  University of Cambridge. We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

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Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Biologia do Desenvolvimento

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Mapeando a organização espacial emergente de células de mamíferos usando Micropatterns e imagens quantitativas

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.