Bu çalışma AMA, PB-J ve Erasmus, Stichting dr bir EPSRC öğrencilikle Wellcome Trust bir proje Grant bir katkılarıyla AMA bir ERC Advanced Araştırmacı Ödülü (DAT, TB) tarafından finanse edilmektedir. SCvdB için Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds ve Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te &#39;s-Gravenhage. Biz tartışmalar ve yapıcı eleştirilere için, J. Briscoe, S. Muñoz-descalzo, C. Schroeter ve T. Rodriguez teşekkür etmek istiyorum, montaj orta protokol Joaquin de Navascués hem AK Hadjantonakis ve C. Budjan onların laboratuvarın protokollerini paylaşımı için tüm montaj embriyoların boyanması ile ilgili. Bu makalenin önceki bir sürümü daha önce bioRxiv Basım Sunucusu 29 kullanıma sunuldu.

1. Kültür Koşulları Toplama öncesinde <ol><li> CO Şubat 21-25, 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, jelatin kaplı 25 cm 2 doku kültürü ile muamele edilmiş şişeler üzerine ESLIF ortamında mESCs (formülasyon için özel Malzeme ve Ekipman Tablo) korumak ve% 5. </li><li> Bu protokol kullanılmadan önce çözülme sonrası en az iki pasaj hücreleri büyümek; alt geçitlerin de hücreler deneysel çoğaltır boyunca tekrarlanabilir özellikleri oluşturmada genellikle daha başarılı (yani., kültürde fazla 15 pasajlar), farklı ES hücre hatları arasında ancak hafif varyasyon (bkz beklenen test edilen hücre hatları için Tablo 2 ). </li><li> % 40-60 confluency hücreleri büyütün. Toplama için aşırı konfluent hücreleri kullanmayın. </li></ol> Agrega 2. Nesil <ol><li> Ön sıcak PBS (+ Ca + 2, Mg + 2), ESLIF, N2B27 26,27 </su37 ° C su banyosu içinde p&gt; ve tripsin-EDTA. </li><li> Doku kültürü şişesi aspire kültür ortamı (adım 1.3). Iki kez 5 ml PBS ile hafifçe şişeyi çalkalayın. PBS aspire ve hücreleri ayırmak için 1 önceden ısıtılmış Tripsin-EDTA (% 0.25), 2 ml ekle. <ol><li> &lt;5 dakika boyunca ya da hücrelerin tam şişenin yüzeyinden ayrılmaktadır kadar inkübatör içine yerleştirilir. Pipet yukarı ve doğru sayma ve uniform agrega boyutu oluşumu için tek hücre süspansiyonu üretmek için 1 ml pipet ile aşağı. </li></ol></li><li> 5-10 ml ESLIF ile tripsin nötralize; Hücre kurtarma en üst düzeye çıkarmak ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne transfer büyüme yüzeyi yıkama. Santrifüj tüp, bir 1 ml&#39;lik bir şişe çıkarın ve haemositometre ile hücreleri sayın. </li><li> 10 hücre / ul elde etmek için gerekli süspansiyon hacminin (bir bütün 96 kuyucuklu plak, bir 5 ml süspansiyon içinde 5x10 4 hücrelerini gerektirir) belirler. Büyük deviat olarak doğru bir hücre sayımıbelirtilen hücre sayısı iyonları olumsuz uyaranlara agrega cevabı etkileyebilir. </li><li> 5 dakika boyunca ~ 170 x g de yeni bir 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve spin 5 ml önceden ısıtılmış PBS 5x10 4 hücreleri ekleyin. </li><li> Dikkatle PBS aspire ve 5 ml ekleyin PBS hafifçe önceden ısıtılmış; tüpün dibinde pelet rahatsız etmeyin. 5 dakika boyunca ~ 170 x g de santrifüj. </li><li> Dikkatle ikinci kez PBS aspire. Olumsuz agregasyonunu etkileyebilir PBS taşınmadan kaynaklanan olarak pelet bozmadan mümkün olduğunca PBS çıkarın. Gerekli hacme N2B27 ilavesiyle ve ardından homojen bir hücre süspansiyonu üretmek için P1000 pipet ile 1 ml ılık N2B27 ilk olarak pelletini (örneğin, 5x10 4 hücre / 5 ml süspansiyon, 4 ml). </li><li> Steril bir rezervuar hücre süspansiyonu aktarın ve işlenmiş olmayan bir doku kültürü her bir kuyunun dibine 40 ul damlacık pipetle, &#39;96-w U&#39;altlıBir çok kanallı pipet kullanarak ell plaka. Karşılık gelen kapak ile 96 oyuklu plaka Kapak ve ters tezgah üstü mikroskobu (Şekil 1B) hücrelerin varlığını doğrulamaktadır. Not: Bu plakalar yapışan hücrelerin olasılığını sınırlamak için kullanılan esastır. Kaplamaz Jelatin, Fibronektin ve hücre yapışmasını destekleyen herhangi bir başka kaplama ile 96 oyuklu plakanın alt fazlası. </li><li> Agregasyonu için CO 2 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca kuluçkaya bırakılır ve% 5. </li></ol> 3. uyarıcısının uygulanmasının ve Orta değiştirme <ol><li> 48 saatlik bir bekletme sürecinden sonra, başarılı bir şekilde toplanmasını (Şekil 1E) teyit etmek için 96-çukurlu bir levhanın her çukuruna olan mESCs görünümünü gözlemleyin. Not: Agregalar doğada küresel ve çapı yaklaşık 150-200 mikron görünecektir. Sorunlar (Tablo 1) ortaya çıkması durumunda sorun giderme bölümüne bakın. </li><li>0 (N2B27 19 3 uM Chi99021 (Ki), DMSO içinde 10 mM&#39;de hazırlanır stok), 150 ul taze bir ikincil orta ekleyin her çukur bir çok kanallı pipet kullanarak. Yeterli güçle Pipet kuyuların dibine uymak için başlamış olabilir herhangi bir agrega çıkarmak için. 37 ° C ve% 5 CO2 (Şekil 1A) nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 24 saat için ikincil ortam içinde agregalar inkübe edin. Not: Tekrarlanabilir uzamış ve polarize agrega bu ikincil ortam kullanılarak üretilir. Diğer ikincil ortam bileşimleri, aynı zamanda, deneysel koşullar gereklidir ve örnekler Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> Sonraki orta değişiklikler için, hafifçe de her tarafında ikincil orta 150 ul kaldırmak için bir açı (yaklaşık 30 °) düzenlenen bir çok kanallı pipet kullanın. Ardından, yeterince iyi bir güçle her birine N2B27 taze pipet 150 ul başlangıç ​​olabilecek herhangi bir agrega çıkarmak içined kuyuların dibine uymak için. </li><li> Zaman-kurs kadar her 24 saatte tekrarlayın nokta 3. 3 tamamlandığında (toplu kültür deney tipik uzunluğu 120 saattir). Not: sağlanması agregalar serbest olan ve her bir 96-çukurlu plaka arasında yeniden ve tutarlılığı sağlamak için orta değişiklikler, aşağıdaki hareket etmektedir. Orta kümeleme dönemi izleyen gün değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Konfokal Mikroskopi immünolekeleme Analizi Agregaların 4. Hazırlık <ol><li> Fiksasyon ve İlköğretim Antikor inkübasyon Not: AK Hadjantonakis 28 tarafından açıklanan protokol Mesc toplayan bir immün uyacak şekilde modifiye edilmiştir. Çalışmalarımız ve seyreltilerde kullanılan tipik antikorlar, daha önce iş 19,21,24,25,29 ve Tablo 3 yayınlandı başvurun. <ol><li> Bir açıda düzenlenen çok kanallı pipet kullanın (yaklaşık 30 °) hafifçe yan o 150 ul orta kaldırmak için96 oyuklu plakanın her bir oyuğa f. Her kuyuya 150 ul PBS pipetleme iki kez yıkayın. Agrega yerleşmek için izin, her yıkama arasında birkaç dakika bırakın. </li><li> 200 ul dağıtmak gelen pipet takın ve steril bir makasla ile ucunun ucundan yaklaşık 3 mm kesmek için P1000 pipet ayarlayın. Ucu içine 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna olan kısa bir şekilde PBS bir kısmını çizmek ve agrega ajite için kovmak. </li><li> Iyi de bir küçük (30 mm çapında) cam Drosophila diseksiyonu içine agrega ve pipet dahil olan bütün Sesi çekmek için aynı ucu kullanın. Iyi aynı cam diseksiyonu içine özdeş immün rejimlerini uğrayacak 96-plaka tüm agrega aktarın. Not: agrega taşınmasını engellemek için farklı deneysel koşullardan agrega aktarırken yeni bir kesim pipet kullanın. </li><li> Aggregat içeren cam kuyusu yerleştirinDiseksiyon mikroskobu üzerine es. Cam Pasteur pipeti ile de bir taraftan merkezi ve PBS aspire için agrega zorlamak için de cam döndürülür. Agrega aspire edilmez sağlamak için mikroskop kullanın. Kurumasını önlemek için agrega kapak cam kuyu içindeki PBS küçük bir hacim bırakın. </li><li> 1 ml taze hazırlanmış formaldehit (% 4), PBS içinde eritildi ve düşük hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de 2 saat süre ile inkübe ekleyin. Dikkat: Paraformaldehid, alerjik, karsinojenik ve toksik olduğu bilinmektedir. Taşıma esnasında uygun koruyucu kullanın. </li><li> Bölüm 4. 1. 4 de tarif edildiği gibi tespit sonra, aynı şekilde formaldehid solüsyonu aspire ve düşük hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde, her bir yıkama için, 1 ml PBS ile üç kez 10 dakika agrega yıkayın. </li><li> Bölüm 4. 1. 4 de tarif edildiği gibi PBS aspire ve PBS% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 0.2 Tri içeren bir başka üç 10 dk yıkama yerinetonluk X-100 (PBSFT). Düşük hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika yıkama yapın. Not: Süt kullanıldı aksi takdirde protokolü sırasında kayıp olacağını agrega sayısını azaltarak, net bir yıkama tamponu fetal Bovine Serum (FBS) sonuçları kullanarak. Bu tespit, aşağıdaki, immünohistokimyasal prosedürleri aşağıda ayrıntılı olarak verilenler dışındaki çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir ve kararlı ve araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir. </li><li> Bir düşük hıza ayarlanmış bir yörünge rocker PBSFT 4 ° C&#39;de 1 saat agrega engelleyin. Protokol bu noktada durdurulmuş ve agregalar 4 ° C &#39;de yatay bir sarmal dönüşlü rocker sabit çalkalama ile, O / N engellenebilir. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi PBSFT aspire (bölüm 4. 1. 4) ve düşük hız ayarlı bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de PBSFT O / N seyreltildi gerekli birincil antikor 500 ul agrega inkübe edin. Buharlaşmasını önlemek için parafin film ile kaplayın. </li></ol></li><li> İkincil antikor Kuluçka <ol><li> Primer antikor solüsyonu aspire ve aşağıdaki şekilde (4 ° C&#39;de), 1 mi PBSFT ile yıkayın: iki kez 5 dakika için; üç kez 15 dakika için; ve 1 saat, dört ila yedi kez. 4 ° C&#39;de ve düşük hıza ayarlanmış bir yörünge rocker her yıkama adımı gerçekleştirin. Not: Chill kullanımı, orta önce yıkayın. Bu fragmana agrega neden olabilir buz üzerinde yıkar yapmayın. </li><li> Son bir yıkama ortamı aspire ve yatay bir sarmal dönüşlü rocker karanlıkta 4 ° C&#39;de 500 ul PBSFT O / N gerekli sekonder antikor ile agrega inkübe edin. Gerekirse örneğin Hoechst nükleer leke ekleyin. </li></ol></li><li> Konfokal microcopy tarafından montaj ve Görüntüleme <ol><li> 4 ° C PBSFT ile Bölüm 4. 1. 4 de tarif edildiği gibi agrega yıkayın. Son yıkamadan sonra, 1 ml PBS aşağıdaki şekilde% 0.2 FBS ve Triton X-100 (PBT) içeren agrega yıkayın: iki kez 5 dakika için; 15 dakika boyunca üç kez. Yıkar gerçekleştirinoda sıcaklığında bir yörünge rocker ışıktan korunmalıdır. </li><li> Gliserol 1 çözeltisi: PBT (1 mi) bir 7 ile ikinci 30 dakika inkübasyon ile takip: 3 çözeltisi, bir 1 ile karanlıkta 30 dakika süre ile, daha önce tarif edildiği gibi orta aspire (bölüm 4. 1. 4) ve inkübe gliserol: PBT (1 ml) eklenmiştir. Not: rotator ile 4 ° C &#39;de gliserol ve PBT çözümler karıştırın. </li><li> Nihai gliserol aspire: PBT çözüm ve orta 24 montaj 1 ml ile değiştirin. Protokolü (duraklamışsa, parafin film ile kuyu mühür ve 4 ° C&#39;de boyama kuyu saklamak) öncesinde montaj için bu noktada durdurulmuş olabilir. </li><li> Bir kesim P20 ucu (Şekil 2) ile 17 ul damlacıkları onları pipetleme mikroskop lamı üzerine agrega monte edin. Spacers oluşturmak ve slayt her iki ucuna takmak için kendi üzerinde geri dört kez çift taraflı bant katlayın. (Şekil 2) Bu aralama üzerine üst lamel (22 mm x 60 mm) yerleştirin. Not: Bir kesim ucu esastırörnekleri zarar vermemek için, bu aşamada kullanılan. Ayırıcılar agrega kırma lamel önler. </li><li> Agrega monte edildikten sonra, protokolleri kullanarak konfokal mikroskopi kullanılarak görüntü örnekleri daha önce 19,21,24,25 nitelendirdi. Bir kez mikroskop üzerine yerleştirilen, agrega montaj ortam içinde yerleşmek için izin vermek için birkaç dakika sahnede rahatsız slayt bırakın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt,+Activin,+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood.">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate.">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li><li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation.">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids.">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis.">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).</li><li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+expression,+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis.">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li><li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation.">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li><li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development,+Studied+by+Operative+Methods.">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li><li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+totale+Exogastrulation,+eine+Selbstabl&#246;sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm.">Die totale Exogastrulation, eine Selbstabl&#246;sung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv f&#252;r Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li><li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking,+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells.">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells.">Wnt/&#946;-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated+&#946;-catenin/Oct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A membrane-associated &#946;-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li><li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells.">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).</li><li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Ru&#233;, P., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells.">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li><li>Turner, D. A., Ru&#233;, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+cooperates+with+Wnt/&#946;-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells.">Brachyury cooperates with Wnt/&#946;-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).</li><li>Ying, Q. -. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).</li><li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking,+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro.">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li><li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo.">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li><li>Inman, G. J., Nicol&#225;s, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+(ALK)+receptors+ALK4,+ALK5,+and+ALK7.">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).</li><li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMH1,+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs:+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction.">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal.">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li><li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).</li><li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li><li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPRT-deficient+(Lesch-Nyhan)+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells.">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu yazıda anlatılan tekniği verimli ve tekrarlanabilir Marikawa ve ark., 14 ve EB formasyonu tarafından tarif hem Asılı damla kültürü birleştirerek, fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) o görüntüleme organize simetri kırma ve uzama 19 agrega üretir. Bu büyüklükler böyle optik bardak 11 ve serebral korteks 13 ES hücrelerinden ön organlarının oluşturulması için mevcut yöntemler tamamlayan, eksenel uzama geliştirmeye devam ve hangi ekran gastrulasyon sırasında benzer süreçler üç germ kimlikleri ile hücreler içeren Böyle hızlı hücre hareketi 19,21 olarak. Dış desen dokuların yokluğunda oluşur ve zigotik asimetri 19 istekalar beri, simetri kıran olayın niteliğine üzerinde spekülasyon yapmak ilginç. Ilkel bir eksen kendiliğinden oluşumu önceden varolan heterojen doğabilecekasimetri gelişiminin temelini oluşturan hücrelerin, başlangıç ​​kültürü eities. Gerçekten de, ESLIF koşullarında kültürlenir hücre popülasyonları kendini yenileyen ve hücreleri ayırt bir karışımını gösterir, görece oranları başka bir agrega arasında değişebilir. Ayrıca, laboratuvarda ön çalışma hücrelerinin tamamen pluripotent nüfus agrega (DA Turner &amp; hazırlık A. Martinez Arias,) organize desen oluşumu heterojenite bir rolü olduğunu düşündürmektedir, desen gecikmiş gelişme ve kusurları göstermek olduğunu göstermektedir. Bir reaksiyon difüzyon mekanizması uzakta agrega yüzeyinden bir inhibitörü difüzyon ile desen oluşturmak olabileceğini dikkate değer. Warmflash ve ark., 41 bu tür bir mekanizma, üç boyutlu olarak desen için olası bir aday yapar, yapışkan kültür içinde radyal asimetri geliştirmek sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Inisiyatif sırasındal 48 saat agregasyon süresi, hücreler, ikincil ortam 19,21,24 gelen sinyallere yanıt için yetkili olan İmplantasyon epiblast içinde benzer bir duruma ulaşmak. Tipik olarak, burada açıklanan protokol uzama için yeterli sinyaller (örneğin, Wnt / β-katenin agonistleri gibi) etkenleri içeren ikincil ortamın bir pals ile hücreleri içerir. Lancaster ve arkadaşları tarafından tarif edilen önceki kültür yöntemleri. (Insan EKH 13 kullanılarak) Eiraku ve ark., (MESCs 11) ile birleştirilmiş hücreler zamanda online için Matrigel damlacıklar aktarıldı 96 oyuklu plakalar önce düşük-yapışma agregasyon kısa bir süre kullanılan kültür gidiyor. Agregasyon ve Matrigel ekleme arasındaki zaman çalışmaları arasında farklı olmasına rağmen, her iki durumda da, hücrelerin çok sayıda toplanma (yaklaşık 3,000-4,500 hücre) kullanılmıştır. Buna karşılık, protokol 19 daha az hücreler (yaklaşık 400 hücre kullanır Burada anlatılanuzama, simetri kırma ve 19 görülmektedir polarizasyon işlemine kesinlikle gerekli olduğu tespit edilmiştir agrega) aralığındadır. Buna ek olarak, bu uzun yapılar yapay matrislerde gömmeden çok daha kısa bir zaman süresi oluşturulabilir mümkün: Lancaster ve arkadaşları tarafından tanımlanan beyin bölgelerinde üretilmesini karşılaştırma (&gt; 20-30 gün) Eiraku 13 optik bardak. ve ark., (~ 11 gün) polarize uzun yapıların üretimi için gerekli olan 5 gün 11. Bununla birlikte, burada açıklanan bir kültür yöntemi ile sınırlamalardan biri, büyüklüğü kuyu dibine çöker ve non hatta bir yapışma zorlamak için yerçekimi altında bunları yetkin hale kadar yalnızca kaplama, post, yaklaşık 5-6 gün süreyle kültürlendi edilebilmesidir -kaplı plastik eşyalar. Örneğin, daha önce sözü edilenler gibi yapay matrisler kullanılarak daha başka deneyler, bize süresini geliştirmek için izin verebilirgözlem ve deney, ve iş devam eden bir tarzda agrega kısıtlayıcı etkilerini belirlemektir. Bu tekniğin bir başka sınırlaması agrega çıkarmadan orta değiştirmek amacıyla, orta bir küçük hacimli Kuyunun dibine bırakılmalıdır olmasıdır. Kimyasal genetik yaklaşımlara sonuçları bu seyreltme ve önceki medyadan herhangi bir kalıntı etkileri dikkate ihtiyacı vardır: 3 iM Chi darbesinin gününde, 2.37 mcM çözüm aslında teslim ve sonraki orta değişiklikler 0.499 bir carry-over neden olan uM (72-96 saat) ve zaman noktaları arasında 0.105 uM (96-120 saat). Güncel iş seyreltme için düzeltilmiş değil ve günlük orta değişiklikler artık etkileri en aza indirmek olacağı varsayılmıştır. Içi ve kurumlar arası deneysel hem de tekrarlanabilirliği sağlamak için protokolde kritik adımlar vardır. Birincisi, mESCs başlangıç ​​kültürü bakımlı ve co üzerinde olmalıdırnfluent ve ortam her zaman iyi kalitede kalacak şekilde olmalıdır. taze ve iyi karışmış (Şekil 5A, B). Kötü kültür koşulları olumsuz agregasyonu (Şekil 5Bi) etkiler. Daha büyük agrega başarısız olarak ~ 400 hücre / 40 ul hücre süspansiyonu elde etmek için hücrelerin doğru sayma, esastır kendini organize ve küçük agrega doğru ulaşamayanların ise her bir kuyu (Şekil 5Bii) içinde çift agrega oluşturmak için daha olasıdır onlar uyaran (Şekil 5Biii) cevap edebiliyoruz yoğunluğu. Bir anahtar iyileştirme adımı hücre süspansiyonu kirletici serum kaldıran ikinci bir PBS yıkama (2.6 Adım) dahil oldu; Bu kümelenme sıklığı gelişmiş ve yaklaşık 24 saat ile agregaların gelişimini hızlandırmıştır. Daha sonra, sağlanması orta değişiklikler de yüzeyine yapışır potansiyeline sahip bir agrega çıkarmak için yeterli bir kuvvet ile uygulanır; böylece resu yapmak için başarısızlıkAgregalar &#39;çökmesini&#39; (Şekil 5Biv) &#39;de lt. (Ve aşağıda) daha önce belirtildiği gibi ek olarak, ve bu agrega süspansiyon kültürü içinde muhafaza edilir ve herhangi bir yüzeye yapışmasını engellemek sağlamak için gereklidir. Agregalar yapıştırılır sonra, gen ekspresyonu ve uzama potansiyeli desen bozulur. Bu teknik, oldukça basit ve de iyi bir doku kültürü teknikleri ile bireylerin havale içinde olduğu gibi, agregasyonu ile ilişkili sorunların çoğunu nispeten hızlı bir şekilde bu kritik adım ve ardından eğer çözülebilir; sorunsuz çekim tam bir tablo kullanılabilir (Tablo 1). Hakim sonra, bu teknik, eksenel gelişimi, simetri kırılması ve hücre kararı olayları incelemek için kullanılabilir. Daha özel olarak ise, bu gruplar örneğin omurilik ve motor olarak, şimdiye kadar mümkün olmayan şekilde kültür içinde hücrelerin havuzları üretmek için bir potansiyele sahipr nöronlar. Etik Not: İnsan ES veya iPS hücre kültürüne bu protokolün çeviri yakın insan embriyosu araştırma ondört gün limiti, ilkel bir çizgi yani nesil yasal dayanağı için deneyci getireceğini nedeniyle dikkatli unutulmamalıdır, İnsan Fertilizasyon ve Embriyoloji Yasası 2008 (UK) 42 ayrıntılı olarak. Yasa ne olursa olsun yaratılış kendi tarzının tüm canlı insan embriyolarını kapsar yana, sahne gibi ilkel çizgi ötesinde insan gastruloids kültür Lisanslanabilir araştırmanın kapsamı dışındadır olacaktır.

Erken memeli gelişiminde çalışması ve hücre kaderini belirleyen anlayışı Embriyonik Kök Hücre kültürlerinin (EKH), yenilemek ve bir organizmanın tüm hücre tiplerine içine ayırt kendini yeteneğine sahip blastosistlerde türetilen klonal nüfus yararlanabilirler yani., Onlar pluripotent 1,2 vardır. Bu kültürler olmuştur ve hücre kaderini belirleyen moleküler temelinin anlaşılması için yararlı olmaya devam ederken, onlar gastrulasyon sırasında embriyolarda üretilen mekansal düzenlemeleri ve küresel davranışların bazıları yeniden edemiyoruz. Embriyo, gastrulasyon süreci üç farklı germ içine tek bir epitel tabakası dönüştüren ve bir açık ön-arka örgütü 3-5 ile embriyo endows. Bu olaylar ex vivo recapitulate girişimleri EKH üç boyutlu agrega üretilmesi dayandırılmıştır olarak embriyoid organları (EBS) sevk ve onlara t tabifarklılaşma koşulları 6,7 o. . Örneğin, kan 8 ve primordiyal üreme hücrelerinde 9, bu agregaların elde edilen veya yapışık kültürde düşük verimlilik ile indüklenebilir ya mümkün değildir ya da hiç imal edilemez bazıları bir çok farklı hücre tipleri, ayırt etmek için sürülmesi edilebilir. EBS kullanımında bir sınırlama ancak, uzaysal örgütsüzlük 6,10 sonuçlanan gelişen embriyonun temel özellikleri vardır morfogenetik davranışı, germ tabakası dağıtım veya eksenel örgütü görüntülemek mümkün olmasıdır. Tek raporda, Wnt ile EBS tedavisi bazı agrega gen ifadesinde zayıf kutuplaşma neden ama net bir morfogenez 7 görülmektedir. Daha yakın raporlarda, uzun süre için kültüre edilmiş EBS kendi embriyonik meslektaşları taklit gibi retina, korteks ve iç kulak duyu hücreleri gibi ön yapılar geliştirmek ancak eksenel organizat bağlamında olmadan gelişebilirion 11-13. Tarafından hazırlanan bir raporda Marikawa ve ark., 14, asılı damla yöntemi ile oluşturulan fare P19 Embriyo Karsinomu (EC) hücre agrega ile çalışan iken, amfibi içinde exogastrulae ile gözlenir Uzanımlarda anımsatan mezodermal kökenli uzatılmış yapıların ortaya çıkmasını bildirdi ve deniz kestanesi embriyo ve Keller 15-18 eksplant. Bu fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) gözlenen olmasaydı, biz P19 EC hücreleri mESCs 19 agrega kullanılarak gözlenen davranışı yeniden oluşturmaya çalıştı ve biz onların kırma simetri ve eksenel uzamaya sebep kültür koşullarını rapor. P19 hücreleri ile işten önemli bir fark, burada tarif edilen çekiş protokolü yerine damla, asılı, Eiraku ve ark., 20 tarafından tarif edilene benzer bir 96-çukurlu plaka içinde icra edilmektedir. Bu değişiklik agrega kurtarma hem de açısından artan verimlilik sonuçlandıiçi ve arası deneysel tekrarlanabilirlik. Oluşmaz (asılı damla agrega havuzu olduğunda yaygın) Önemli olarak, tek tek oyuklara yığışmalar muhafaza agrega arasındaki füzyon sağlar. Buna ek olarak, protokolün önemli bir özelliği toplama aşağıdaki GSK3 inhibitörü CHI99021 (Chi), Wnt / β-katenin sinyalizasyon güçlü bir aktivatörü, 24 saat maruz olduğunu. Burada anlatılan yöntem çıkarımlar in vivo 19,21 eksenel gelişimi ile ilgili yapılacak sağlayan, kültürde kendine örgütlenme, eksenel organizasyon ve germ tabakası şartnamenin süreçlerini anlamak için bir temel sağlar. Bu nedenlerle yöntemi embriyo çalışma zor olabilir süreçlerin ayrıntılı bir mekanik analiz izin vermek için bir potansiyele sahiptir. Bundan başka, bir potansiyel uygulama bağlı yapısal bir selüler niş olmaması gibi yapışık kültüründe kolaylıkla elde olmayan doku ve organların üretiminde olduğuspinal kord 21 ve motor nöronları öncüleri. Üç boyutlu agrega kültür mekansal organize bir şekilde embriyonik soy türetilmesi için yeni bir yaklaşıma yol konvansiyonel yollarla elde olmayabilir fiziksel yapısı ve sinyalizasyon ortam sunmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350-010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">25cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">690 175</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:116px;">MSE</td>
			<td style="width:87px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:235px;">BES Buffered Saline (BBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">B2891</td>
			<td style="width:188px;">BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Centrifuge tubes (15 or 50ml)</td>
			<td style="width:116px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:87px;">118271 or 227261</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">CHIR 99021 (Chi)</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Dissection Well (30mm Internal Diameter)</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:87px;">12678586</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">ESLIF</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:188px;">500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 &#181;L LIF (1000 units).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:87px;">FB-1090/500</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Gelatin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Glasgow&#39;s Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">11710-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">35050-038</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G5516</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Improved Neubauer Haemocytometer</td>
			<td style="width:116px;">Hawksley</td>
			<td style="width:87px;">AS1000</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">n-Propyl-gallate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">02370</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:235px;">N2B27/NDiff 227</td>
			<td style="width:116px;">Stemcells, Inc.</td>
			<td style="width:87px;">SCS-SF-NB-02</td>
			<td style="width:188px;"><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11140-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">P6148</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">D8662</td>
			<td style="width:188px;">With Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11360-039</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sterile Reservoir</td>
			<td style="width:116px;">STARLAB</td>
			<td style="width:87px;">E2310-1010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">650185</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">X100</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">25300-054</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro

Biz mevcut embriyoid Vücut (EB) öz-örgütlenme çalışma sağlar kültürünü, simetri kırılması, eksenel uzama ve süspansiyon kültüründe fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) agrega kullanılarak hücre kaderi şartname iyileştirilmesi bir protokol geliştirmiştir. MESCs Az sayıda deneysel sinyallere yanıt için yetkili sonra olmayan doku kültürü ile muamele edilmiş, U-tabanlı 96-yuvalı plakalar içinde 48 saat boyunca bazal ortamda toplanır. Tedavi sonrası, bu agregaların polarize gen ekspresyonu belirtileri ve yavaş yavaş dış asimetri ipuçlarının yokluğunda uzun, iyi organize yapıya hücre küresel kitlesinden morfoloji değiştirme başlar. Bu yapılar sadece üç germ belirteçleri görüntülemek mümkün, ancak aktif önemlisi uzun yapının bir bölgesinde meydana agrega, bireysel hücrelerin yönlü bir yerinden çıkmak kanıtladığı gastrulasyon benzeri hareketler, görüntüler. Bu protocol Bu agregaların tekrarlanabilir oluşumu, Wnt / β-katenin aktivasyonu ve BMP inhibisyonu ve tek bir zaman noktasında veya zaman atlamalı flüoresans mikroskopisi ile analizleri gibi sinyaller ile uyarılması için ayrıntılı bir yöntemi temin etmektedir. Buna ek olarak, sabit agrega içinde özel markörlerin immunositokimyasal analizi için mevcut tüm montaj fare embriyosu boyama prosedürleri modifikasyonlarını tarif eder. Morfoloji, gen ifadesi ve agrega uzunluğundaki değişiklikler kantitatif sinyaller eksenel kaderi değiştirebilir hakkında bilgi sağlayan ölçülebilir. Bu sistem, eksenel geliştirme ve organizasyon gibi erken gelişim olaylar çalışmaya hem uygulanabilir öngörülmektedir, ve daha geniş, öz-örgütlenme ve hücresel karar verme süreçleri. Aynı zamanda, omurilik ve motor nöronların gibi geleneksel yapışkan kültürden elde edilemez olan embriyo, bu hücre tiplerinin üretimi için uygun bir niş sağlayabilir.

Hemen Kaplama sonra ve Toplama sonra Hücreleri Görünüm Kaplamadan hemen sonra, tek bir standart ters doku kültürü mikroskobu (Şekil 1B) ile 96-çukurlu bir levhanın her çukuruna içindeki tek hücrelerin varlığını görebiliriz. Kaplamanın 8 saat içinde, bu hücreler yerçekimi iyi nedeniyle dibine inmeye başlamış ve ayrık kümeler (Şekil 1C) içine birleşme başlamış olacaktır. 24 saat sonra, birleştirici hücrelerin, birincil agregasyonunu tamamlamış olacak ve tek tek hücreler birbiriyle (Şekil 1D) gelen belirsizdir iyi tanımlanmış, ancak düzensiz agregalar halinde sıkıştırılır olacaktır. İkinci gün (48 saat), agrega, &#39;temiz&#39; görünmelidir sonuna kadar kuyu (Şekil 1E) içindeki tüm hücreleri alınmış olması; Kuyunun alt bu aşamada agrega dökülmüştür bazı hücrelere sahip olabilmektedir. Sağlanmasıagrega bu zaman noktasında, N2B27 toplanmış olan, onlar çap olarak yaklaşık 150-200 mikron serbestçe oyuk içinde hareket (örn., kuyu alt yapışmadığını), küresel olmalıdır. Diğer ortam içinde toplama (yani., ESLIF veya belirli faktörlerle N2B27) (hazırlanması için, Turner ve ark.) Başlangıç ​​agrega morfoloji ve sonraki uyarılara tepkiyi, değiştirme potansiyeline sahiptir. Temsilci Morfolojik Değişiklikler (Şekil 1A, 5A) hr 48 ila 72 Chi içeren ikincil ortamın bir 24 saat darbesinin eklenmesi de germ 19,21 spesifik belirteçler polarize ifadesini gösteren uzatılmış agrega tanımlanır üretir. Hemen Chi darbe (72 saat) sonra, agrega hücreleri döken ve bu gün (Şekil 3A) sonuna doğru bu sinyallere tepkilerini göstermeye başlayacak başlayacaktır. Bu yanıtlaragregalar N2B27 (Şekil 3B) ilk 48 saat agregasyon dönemin ardından almış tedavi bağlıdır, her ikisi de gen ekspresyonunda ve morfolojik değişiklikler ile kendini göstermektedir. Sadece bir son nokta analizi gerekiyorsa, görüntüye agrega için en uygun zaman yaklaşık 96-120 saat olduğunu. Bu noktada agrega açık morfolojileri ve gen ekspresyonu (Şekil 3A) geliştirmiş olacak ve P200 pipet gelen orta o ejeksiyon bağlı olabileceği herhangi çıkarmak için yeterlidir böylece onların büyüklüğü ve kitle hala yeterince düşüktür. Kuyuya agreganın eki önlemek için başarısızlık olumsuz agrega oluşumu (Şekil 5Biv) etkileyecektir. Agregaların morfolojileri ve gen ekspresyonu modeli işleme bağlı olarak değiştirilebilir. Tek tedavi veya faktörlerin kombinasyonları ile ya sürekli ya da darbeli rejimler için Temsilcisi sonuçları BMP4, Dorsomorphin H1 (B gösterilmektedirMP reseptör inhibitörü), ActivinA, SB43 (Aktivin / Düğüm inhibitörü), bFGF ve PD03 (MEK inhibitörü) (Şekil 3B). Agrega Görüntüleme ve Kantitatif Görüntü Analizi Büyüklükleri (esas time-lapse görüntüleme 19) ya widefield mikroskopiyle görüntüleme için uygun, ya da sabit ve konfokal görüntüleme 19,21 (Şekil 2) için immunohistokimyasal vardır. Geçerli protokol ve görüntüleme açıklaması yukarıda nicel bilgiler bu agrega elde edilmesini sağlar. Aşağıdaki Konfokal veya geniş alan görüntü yakalama, uzunluk ve (sırasıyla küresel veya uzamış; Şekil 4A, B) agrega çapı veya omurga boyunca gelen gen ifadesi ölçülebilir. Bu analizler, aynı zamanda, bir farklı koşullar altında agrega büyümesi, boyut ve uzama oranının bilgi edinebilir zaman atlamalı görüntüler, (Şekil 4 için direkt olarak uygulanabilir </strong&gt;). <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> Şekil 1. Tipik bir zaman ders ve erken morfolojileri. (A) agregasyon deneyleri için tipik zaman ders. Hücreler, 96 oyuklu bir plaka içerisinde (P1, P2), fare ES hücreleri süspansiyonu (10 hücre / ul) ihtiva eden N2B27 48 saat boyunca birleştirilir. (B) hemen (t = ~ 5 dk) sonra kaplama, tek tek hücreler olabilir süspansiyon görülür ve hücreler, yaklaşık olarak 100 um çapı olan, her oyuk tek bir agrega oluşmuş 24 saat sonra, 8 saat (C). (D) kümeleri oluşmaya başladı. (E) 48 saat agregasyonu sonra, agrega çapı 150-200 mikron arasında değişmektedir. Bu noktada, agregasyon ortamı (N2B27) çıkarılır ve bir ikincil ortam b değiştirildi önce (A bölümünde p1), deney boyunca veya 24 saat boyunca ya da ilave edilirN2B27 (bölüm A&#39;da p2) için ack. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> Şekil 2 mikroskop lamı üzerine montajı agregatları da kullanılabilecektir. Agregalar giderildi sonra, boyanmış ve orta montaj yerleştirilir, her bir agrega 17 ul damlacık olarak bir mikroskop lamı üzerine pipetlendi (A, B, B &#39;). Yeterli alan kendi birleştirilmesi önlemek için agrega damlacıkları arasında bırakılır. Ara parçaları, çift taraflı bant ile yapılır ve bir mikroskop lamı (A, A &#39;, B) her bir köşesinde yer alır. Bir cam lamel yerleştirildiğinden emin bunlar üzerine olduğunu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. toplanan ES hücrelerinin morfolojisi farklı tedavilerin etkisi. N2B27 2 gün sonra, ES hücreleri agrega oluşturmuşlardır. Özel faktörlerin eklenmesi ya da gen ekspresyonu, uzama potansiyeli ya da bunların genel şekli polaritesine göre agrega fenotipini değiştirebilir 1 gün darbesi (A) ya da sürekli olarak (B) elde edilir. Bu şekilde örnek 120 saat sonra görüntülenmiş ve belirtildiği gibi muamele edilmiş, ya Bra oluşan agregalar :: GFP 30 (A) veya Sox1 :: GFP 27 (B), fare ES hücreleri bulunmaktadır. Ki: CHIR 99.021 31; SB43: SB 431542 32, DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">th büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakamdır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> Agrega Şekil 4. nicel analizi. Bra oluşan tipik bir agrega :: Chi 24 saat darbesinin takip ve 120 saat görüntülü GFP mESCs 25,30. Parlak alan ve GFP kanalının Birleştirilmiş görüntü agreganın floresan ve uzunluğu ölçülebilir hangi boyunca B (A) A noktasından agreganın &#39;omurga&#39; işareti parçalı hat, (B) gösterilir. Uzunluğu (C), aynı deneyde 24 agrega yuvarlaklığına (D) gösterilmiştir. Böyle yuvarlaklığı (D), dairesellik, çevre ve alan olarak şekil tanımlayıcıları görüntü analiz yazılımı FIJI 35 Görüntü Analizi Cookbook eklentisi kullanarak ölçülebilir. Her bir zaman noktasındaki yatay çizgi ile gösterilen ortalama;Hata çubukları standart sapmayı belirtir; (A) &#39;daki ölçek çubuğu 200 um gösterir. Muhabir hücre hatları arasındaki ince farklar vardır gibi, Chi bir darbe sonrasında, agrega ortalama maksimum uzunluk ve ortalama asgari yuvarlaklık değişecektir beklenmektedir. Farklı hücre hatları arasında, biz ortalama maksimum uzunluğu 400-800 um ve 0.4 ve 0.6 arasındaki ortalama minimum yuvarlaklığı ~ aralığında olabilir bulmak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> Şekil agrega oluşumunda başarısızlıkların 5. örnekleri. Tekrarlanabilir agrega (A) oluşturma yeteneği, ilk n sayma gibi (Bi) taze ve iyi karışık ikincil orta, (Bii, BIII) gibi kritik faktörlere bağlıdır doğruluğuagrega sağlayan hücreler ve (BIV) ve umber yapışık kolonileri yani oluşturmazlar. &#39;kazasında&#39; de yüzey içine. Belirtilen koşullar (B) her biri için toplam oluşumu hatalar tipik örnekleri gösterilmektedir. Belirtildiği gibi Ölçek bar; Ayrıntılar için sorun giderme tablosu (Tablo 1), bkz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> Sorun giderme Tablo 1. Kılavuzu. Agregasyon protokolü ile ilişkili tipik hatalar onların çözümüne olarak önerilerle verilmiştir. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> Tablo hücre hatları 2. Tablo AGG oluşumu için testRegates. hücre çizgileri arasındaki ince farklar beklense de, agrega ve oluşumu için tanımlanmıştır ve gözlenmiştir 19,22,27,30,36-40 hücre çizgilerinin bir kısmı, her şeyden önce hatları açısından benzer dinamiklerini göstermektedir uzama ve morfolojisi. Gen ekspresyonu açısından, ekspresyon paterni geninin ifade özgü olduğunu, ancak, her bir hücre hattı olan, ifade şablonu geçişlerinin bir dizi üzerinden tutarlıdır. Tutarlılık için, kültürde 15 geçitleri aşmadı hücrelerden agregaları üretir. <img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> Bu çalışmalarda kullanılan temsili antikorların Tablo 3. listesi. Antikorları ve toplam immün için kullanılan seyreltme faktörler seçim.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro at JoVE.com

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Fare Embriyonik Kök Hücre Agregaların Üretimi Simetri Kırma, Polarizasyon ve Acil Toplu Davranış göster o<em&gt; İn Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

generation-aggregates-mouse-embryonic-stem-cells-that-show-symmetry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

17.4K Görüntüleme.  University of Cambridge. We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.