This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الأخلاقية المؤسسية رعاية الحيوان في جنيف، سويسرا والمكتب البيطري كانتون: ملاحظة. إذن عدد GE / 63/14. 1. إعداد تعليق خلية واحدة من نخاع العظام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس التضحية (8-12 اسبوع) خلع عنق الرحم. تعقيم رجليه الخلفيتين مع 70٪ من الإيثانول. إزالة الجلد من رجليه الخلفيتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج عظام الفخذ الماوس وtibias وإزالة الأنسجة من الساقين مع مشرط. شطف الساقين مع 90٪ من الإيثانول ومكان في صحن الثقافة مليئة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة والثقافة، ومنديل نظيف من عظام الفخذ وtibias مع مشرط ومنفصلة في مفصل الركبة. قطع كل نهاية العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نخاع العظم دافق من كل العظام باستخدام إبرة 23G وحقنة 1 مل مليئة إعداد المتوسطة (الفينول الحمراء الخالية DMEM / F12، 1٪ مصل الفئران)، إلى 50 مل المسمار الأنبوب. تعطيل المجاميع الخلية عن طريق الركض بدقة من خلال شمال شرق 23Gedle وحقنة 1 مل. يصل إجمالي حجم إلى 25 مل مع إعداد المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل خلايا الدم الحمراء تحلل RBLC العازلة (8.3 ز NH 4 الكلورين، 1 غرام NaHCO 3، 1 مل EDTA (100 ملم)، الكامل إلى 1 L مع الماء المقطر، تصفية 0.22 ميكرون) في 15 مل المسمار الأنبوب. احتضان 30 ثانية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من إعداد المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. تجاهل وطاف resuspend في 2 مل إعداد المتوسطة. </li></ol> 2. العدلات إثراء حسب التحديد السلبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من الفأر كوكتيل تخصيب العدلات (العزلة خلية منصة عدة مثل EasySep). خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من الفينول DMEM مجانا الأحمر. عكس مرة واحدة وأجهزة الطرد المركزي 250 x ج، 3 دقائق، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1.75 مل إعداد المتوسطة في البوليسترين 5 مل جولة أنابيب أسفل. إضافة 250 ميكرولتر بيوفي اختيار كوكتيل. خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الجزيئات المغناطيسية (من العزلة خلية منصة طقم) لمدة 30 ثانية ل resuspend الجسيمات. إضافة 500 الجزيئات المغناطيسية ميكرولتر لتعليق الخلية. خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب إلى المغناطيس. الانتظار لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس المغناطيس على جديد البوليسترين 5 مل جولة أنابيب أسفل لجمع الخلايا غير المسماة المطلوب. لا تأخذ آخر قطرة شنقا في الأنبوب. ستبقى الخلايا غير المرغوبة في أنبوب داخل المغناطيس. تجاهل هذا الأنبوب إلى نفايات بيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب جديد في المغناطيس. الانتظار لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس المغناطيس على جديد 15 مل المسمار أنبوب لجمع الخلايا غير المسماة المطلوب. لا تأخذ آخر قطرة شنقا في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجلد كامل إلى 5 مل مع الفينول الأحمر DMEM مجانا. </li></ol> 3. صفها من العدلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 ميكرولتر من صبغ برتقالي مثل تعقب خلية البرتقال (تركيز العمل1 ميكرومتر، CMRA - كلورو-RODOL خلات، والأوراق المالية 10 ملم في DMSO). احتضان 2 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 مل من إعداد المتوسطة. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل إعداد المتوسطة في أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة الاعتماد مع الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق عند 37 ° C. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل PBS. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C لغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف تجاهل. بيليه resuspend كما 10X10 6 خلايا لكل 100 ميكرولتر PBS. الحفاظ على الجليد حتى حقن الرابع. ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا الرابع حقن في أسرع وقت ممكن. عادة ما يتم الحصول عليها 6-12x10 6 العدلات / الماوس. </li></ol> 4. إعداد ماوس لحيوي داخلي المجهر ملاحظة: الخطوة 4.1) و 4.2) يجب أن يتم تنفيذ في بداية التجربة لتجنب وقت الانتظار الممتد من العدلات المسمى على جيمه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 3 CX CR1 GFP الماوس (8-12 أسبوع من العمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 800 ميكرولتر من التخدير (الكيتامين 60 ملغ / كغ، زيلازين 4.5 مغ / كغ، acepromazone 1.75 مغ / كغ في PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس. حقن الملكية الفكرية مع 200 ميكرولتر / 20 غرام من الماوس. التخدير سيطرة أخمص القدمين معسر وعن طريق التحقق من معدل التنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن العدلات (10X10 6 الخلايا في 100 ميكرولتر PBS) عن طريق الوريد باستخدام أوردة الذيل الأفقي أو الجيوب الأنفية الرجعية المدارية، في راحة المجرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة وحماية العينين مع هلام العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع ساترة الزجاج (35 مم) في طبق نسيج الثقافة 10 سم، والتي لديها ثقب قطره 30 ملم. استخدام النفط للحفاظ على طبق زراعة الأنسجة في اتصال مع ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق جلد البطن مع مقص لفضح الصفاق. شق الصفاق مع مقص لفضح الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر PBS (تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية) في صتجويف eritoneal. خذ الماوس في يدك وتحويل وجهه لأسفل، بحيث يحصل على الأمعاء من التجويف البريتوني مع ضغط لطيف. ضع الماوس في طبق زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> deroll بلطف الأمعاء مع براعم القطن المعقم على ساترة من أجل فضح الأوعية المساريقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المناديل الورقية في نطاقات والرطب لهم 37 درجة مئوية PBS ساخنة. لشل حركة الأمعاء مع قطعة من المناديل الورقية لتقليل الحركات الناتجة عن التمعج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صحن زراعة الأنسجة والماوس داخل غرفة thermostated 37 ° C على حسب الطلب المرحلة علبة من مجهر مقلوب. إدخال حقنة تحتوي على مواد التخدير الشوري في الساق الخلفية. ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، يمكن للماوس تلقي الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة) مع قناع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس السيطرة للتخدير بواسطة إصبع معسر والتحقق من معدل التنفس كل 30 دقيقة. إذا لزم الأمر، وتقديم دفعة من مواد التخدير (20 ميكرولتر) للحفاظ على التخدير بشكل صحيح. ليسE: يجب تجنب تجفيف الأوعية الدموية. لذلك، يتم الحفاظ على الرطوبة عن طريق التبول بانتظام المناديل الورقية المستخدمة لشل حركة الأمعاء مع 37 ° C درجة حرارة PBS. </li></ol> 5. قياس العدلات والوحيدات السلوك في سفن الملتهبة في فيفو باستخدام الميكروسكوب حيوي داخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الليزر ل488- 561- وبأقل القوة اللازمة لتجنب الضيائية التي يسببها الليزر. في تجاربنا، فمن أقل من 0.5٪. كثافة GFP في حيدات وصبغ برتقالي في العدلات هو مشرق بحيث عادة 0.3٪ بما فيه الكفاية. ملاحظة: هذا يمثل قوة الليزر من 0،15-0،25 ميغاواط مع نظامنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور من 512 X 512 بكسل (أي 635 ميكرون) في 2.2 ثانية مع الثقب المفتوح باستخدام الهدف 20X الجاف للمجهر مقلوب. استخدام متعمقة ض بين 10-20 ميكرون، التي تضمن إشارة كافية مع القوى الليزر منخفضة. ملاحظة: نحن عادة إجراء تجارب مع متعمقة ض بين 12-1656؛ م. في حالة الأرقام والأفلام المقدمة، ض عمق 20 ميكرون. الطوري يسمح بتحديد الجدران البطانية ويتم تنفيذ التصوير في عروق المساريقي. منذ خلايا تقوم بدوريات تتحرك ببطء شديد مع سرعة 10/05 ميكرون / دقيقة 6، مسجلا مجال اهتمام كل 20 ثانية مرضية. مع الإعدادات وصفها، في مرحلة الآلية تسمح للتسجيل ما يصل إلى 7 مجالات الاهتمام في نفس الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس والأوعية المساريقي في غرفة ترموستات المجهر يتم السماح لهم للتعافي من إعداد لمدة 30 دقيقة قبل الحصول على أول فيلم. خلال هذا الوقت، واختيار العديد من المجالات ذات الاهتمام. التركيز على سطح اللمعية السفينة الأقرب إلى الهدف. إذا لزم الأمر، والاستفادة من طفيف لصناعة السيارات في مضان من البطانة لتعيين التركيز. ملاحظة: جراحة خلال إعداد الماوس يؤكد قليلا البطانة. ونتيجة لذلك، المتداول العدلات وويمكن ملاحظة / أو وحيدات في أول 15 دقيقة بعد إعداد الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل أول فيلم لمدة 30 دقيقة في ظل ظروف مستقرة وصورة واحدة كل 20 ثانية. ملاحظة: البرنامج يكتسب كل مجال من مجالات الاهتمام في 2.2 ثانية ومرحلة الآلية تنتقل تلقائيا من حقل واحد إلى آخر. انه يعود الى المركز الأول في غضون 20 ثانية خلال 30 دقيقة من الفيلم تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء الأوعية الدموية التهاب، إضافة قطرة من 20 ميكرولتر من PBS تحتوي على 100 ​​ميكروغرام من TLR2 / TLR1 ناهض Pam3CSK4 12 مباشرة على الأوعية تصويرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيطرة على التركيز في كل مجال الفائدة. ملاحظة: خلال الاكتساب، هناك دائما تغييرات طفيفة في التركيز على محور ض. وعلى الرغم من 10-20 ميكرون ض متعمقة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في كثافة مضان. وبالتالي، إعادة تركيز يدويا في كل مجال الفائدة في نهاية كل فيلم، إذا لزم الأمر. تسجيل الأفلام لمدة 30 دقيقة الفترات وتصل إلى 3 ساعات لالتل بعد بدء الالتهاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية التجربة، التضحية الماوس تخدير قبل خلع عنق الرحم. </li></ol> 6. الجيل من ملفات الأفلام وتتبع من الكريات البيضاء ملاحظة: برنامج الحصول على نيكون يولد .nd2 الملفات ولكن سيكون الإجراء التالي تكون مشابهة مع البرامج وغيرها من العلامات التجارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملفات التصدير، سلسلة شجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذهاب إلى يماغيج البرمجيات <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> استيراد سلسلة شجار. كل قناة كملف مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق عامل تصفية المتوسط ​​مع دائرة نصف قطرها 2.0 بيكسل للقنوات خضراء وحمراء للحد من الضوضاء الخلفية (عملية&gt; مرشحات&gt; الوسيط ...). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الملفات إلى ثنائي (عملية&gt; ثنائي&gt; تقديم ثنائي). تمكين البرنامج لحساب عتبة لكل صورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج القنوات في سلسلة صورة واحدة (صورة&gt; اللون&gt; القنوات دمج ...). حدد حيدات في الجشعن القناة، والعدلات في القناة الحمراء والضوء النافذ في قناة الرمادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الصور مكدسة إلى ألوان RGB (صورة&gt; اللون&gt; كومة إلى RGB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الملف كما افي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استيراد البيانات وتجميعها في Imaris البرمجيات (Bitplane). ثم يتم تعقب تحركات حيدات والعدلات باستخدام معالج تتبع بقعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall.</a> Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro.">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior.">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li><li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+NR4A1+(Nur77)+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes.">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo.">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li><li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo.">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li><li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes.">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li><li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors.">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li><li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

المنهجيات وصفها في هذه المخطوطة توفر نهجا ثابتا لدراسة الوحيدات والسلوك العدلة بكفاءة في عروق المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة. الخطوة الحاسمة لإعداد هو الشلل في الأمعاء مع الأنسجة PBS المبللة. إذا أجريت بشكل صحيح، تتع...

<html> العدلات وحيدات هي خلايا الجهاز المناعي الفطري التي تنتشر باستمرار في الدم. على الإصابة أو العدوى، وإشارات التهابات تحفز الكرية البيضاء انسلال إلى الأنسجة التالفة والمصابة، وبدء في هذه الوثيقة استجابة مناعية خلوية 1-3. سرعة تعبئة الكريات البيض تحدد نتيجة إيجابية من الاستجابات المناعية. هذه العمليات معقدة تعتمد على جزيئات محددة (على سبيل المثال، selectins، كيموكينات محددة البطانة) موجودة على البطانة الملتهبة التي تساعد على إقامة اتصالات بين لاصقة تعميم الكريات البيض والبطانة 1-3. لحصول على رؤى على جزيئات المتورطين في الكريات البيض سلسلة التوظيف، من المهم أن تصور حركية تجنيد خلية وتتبع سلوك كل خلية / السكان. ويشمل وسيلة فعالة intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة. محتوى &quot;&gt; وحتى الآن، وقد وضعت عدة نهج باستخدام intravital المجهري لصورة الأوعية الدموية 4،5. فعلى سبيل المثال، تم استخدام التصوير من الأدمة الأذن الأوعية الدموية أو الأوردة المساريقي بواسطة المجهر متحد البؤر حيوي داخلي لتحديد السلوك الدوريات من Ly6C الفئران حيدات منخفضة والإنسان CD14 CD16 + حيدات قاتمة على الجانب اللمعية الأوعية الدموية في ظل ظروف مستقرة 6-8. وغالبا ما يستخدم نموذج الأوعية الدموية الماوس المشمرة لرصد سلوك العدلات أو Ly6C التهابات حيدات عالية في ظل الظروف الملتهبة أو الدماغية لدى الفئران المعدلة وراثيا. وفي هذا الحالة، يتم تحفيز المشمرة عن طريق الحقن داخل الصفن من IL1β، CCL2، TNFβ أو fMLP بعد 4/2 ساعة، ثم يتم exteriorized جراحيا الأنسجة وتحليلها من قبل متحد البؤر حيوي داخلي المجهري 11/09. يصف بروتوكول التالية طريقة لمراقبة وحيدات والعدلات في نفس الوقت مع أيمضان مقلوب المجهر متحد البؤر. وعلاوة على ذلك، تفاصيل أسلوبنا كيفية صورة السفينة نفسها قبل (حالة حالة مستقرة) وبعد الالتهاب وكيفية متابعة حركية التوظيف الكريات البيض. لهذا الغرض، ونحن نستخدم CX 3 CR1 GFP / وزن الفأر، الذي أعرب عن EGFP حيدات، والرابع حقن مع المسمى الصبغة البرتقالية العدلات الفئران. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب، فمن الممكن (1) لمتابعة وتحليل الدوريات Ly6C حيدات منخفضة في ظل ظروف مستقرة و(2) لمتابعة توظيف كل من وحيدات والعدلات في السفينة نفسها بعد التهاب المحلي. نحن هنا تهيئة الظروف التهابات باستخدام ناهض TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. وعلاوة على ذلك، يمكن لمثل هؤلاء التصوير يساعد على تحديد دور جزيئات محددة من الفائدة في مختلف مراحل سلسلة التوظيف الكريات البيض إذا أجريت على الفئران محددة الضربة القاضية، أو في وجود منع الأجسام المضادة 6،9،13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tubes&#160;</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&#160;&#160; DT:4mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75&#160;&#160; DT:1mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil Type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>any viscous oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Life Box Temperature Control System</td>
			<td>Life Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol red free DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>any phenol red free medium is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAM3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>reconstitute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture dish 100</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

استجابة مناعية فعالة تعتمد على التعبئة السريعة من الكريات البيض في الدم إلى موقع العدوى أو الإصابة. التحقيق هجرة الكريات البيض في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي للهجرة الكريات البيض transendothelial والتفاعل مع بطانة الأوعية الدموية. واحد طريقة فعالة ينطوي intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة. هنا نقدم بروتوكول للحيدات التصوير والعدلات في 3 CX CR1 GFP / وزن الرابع الماوس حقن العدلات البرتقال المسمى صبغ مع مجهر متحد البؤر مقلوب. تجمع الأفلام مرور الزمن من 30 دقيقة إلى عدة ساعات من التصوير السماح للتحليل سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة على حد سواء. نحن أيضا وصف الخطوات للحث محليا الأوعية الدموية التهاب مع TLR2 / TLR1 ناهض Pam3SK4 ورصد subsequeالتوظيف الإقليم الشمالي العدلات وحيدات. ويمكن أيضا أن تقنية قدم استخدامها لرصد الشعوب الأخرى من الكريات البيض والتحقيق جزيئات المتورطين في تجنيد الكريات البيض أو الاتجار باستخدام المنبهات الأخرى أو الفئران المعدلة وراثيا.

يصف المخطوطة بروتوكول الأمثل لمراقبة بسهولة سلوك حيدات والعدلات في عروق المساريقي الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي. استخدام الغرفة 37 درجة مئوية thermostated هو إلزامي للحفاظ على درجة حرارة الماوس، وكذلك نتيجة لحركة تعتمد درجة حرارة من الكريات البيض. يتم عرض إعداد الماوس في...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time at JoVE.com

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Views.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Video: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

تتبع الزحف داخل اللمعة العدلات ، والهجرة والانجذاب الكيميائي Transendothelial في الأنسجة بواسطة الميكروسكوب فيديو Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

في الوقت الحقيقي التصوير من التفاعلات صفائح الدم، العدلات غيروي على البطانة الوعائية التهاب المنشط خلال تشكيل خثرة في والفئران الحية

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

التفاعلات حيوي داخلي المجهري من خلايا الدم البيضاء-البطانية وصفائح الدم الكريات البيض في المساريقية الأوردة في الفئران

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

تسرب الكريات البيض من العضلات الكريماستر في الفئران التي تم تقييمها من قبل المجهر Intravital

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...