Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. I macrofagi coltura e polarizzante midollo osseo <ol><li> Day 0: femore e tibia Isolare ossa di 6-10 settimane di età i topi di interesse (C57Bl / 6 in questo test). </li><li> Rimuovere il tessuto muscolare dalle ossa e posto le ossa in un nove centimetri Petri-piatto pieno di ghiaccio freddo PBS. </li><li> Trasferire le ossa per un piatto di nove centimetri di Petri riempite con il 70% di etanolo e agitare leggermente la piastra per 30 sec. </li><li> Trasferire le ossa per un nuovo 9 centimetri piastra di Petri pieno di ghiaccio freddo PBS sterile. </li><li> Tagliare il femore e tibia ad entrambe le estremità con le forbici sterili. </li><li> Sciacquare le ossa con 10 ml di ghiacciata PBS sterile utilizzando una siringa da 10 ml e un ago 25 G. Raccogliere il midollo osseo in un tubo da 50 ml. </li><li> Trasferire le cellule del midollo osseo in un tubo da 50 ml con un ago 23 G. </li><li> Ripetere questa fase con un ago da 25 G. Nota: sono necessari Questi passaggi per eliminare grumi di cellule e residui ossei. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il supernatant e risospendere le cellule in terreno 40 ml coltura cellulare (RPMI-1640 più 2 mM L-glutammina, 10% FCS, penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mcg / ml) e 15% filtrato L-929 cellule ( ATCC CCL-1) medium contenente -conditioned M-CSF (o in alternativa 10 ng / ml M-CSF ricombinante invece di L-929 a medio-cell condizionata). Nota: La generazione di medio-cell condizionata L-929 è stato dettagliato in precedenza in questa rivista nel 2013. 11 </li><li> Coltivare le cellule da un mouse a due 15 centimetri piastre di Petri (non utilizzare piastre di coltura trattata con cellule da macrofagi non si staccherà da questa plastica) in 20 ml di terreno di coltura per piastra in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Aggiungere 10 ml fresco mezzo di coltura cellulare il giorno 3, senza rimuovere i 20 ml più vecchio mezzo di coltura cellulare. </li><li> Sostituire il vecchio mezzo di ogni piatto con 20 ml di terreno di coltura fresco il giorno 6. In questo modo, saranno rimosse le cellule non aderenti. </li><li> 8 ° giorno: <ol><li> Staccare le cellule incubando loro 5 min a 37 ° C in 10 ml di soluzione salina di citrato (cloruro di potassio 135 mM e 15 mM citrato di sodio in H 2 O, autoclavato) e lavare con 10 ml di PBS. Conte macrofagi osso maturo derivate dal midollo (BMDM) il giorno 8 con un contatore di cellule. </li><li> Verificare la formazione di una matura (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante ispezione visiva o mediante citometria a flusso. Block 10 5 cellule con 1/100 anti-CD16 / CD32 in PBS per 20 minuti a 100 l di PBS, incubare con 1/200 anti-CD11b-FITC più 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a temperatura ambiente, lavaggio e analizzare mediante citometria a flusso. Nota: i macrofagi derivate dal midollo osseo di topo Coltura è stato pubblicato in dettaglio in precedenza in questa rivista da Ying et al 11.. </li></ol></li><li> Seed 50.000 cellule (conta delle cellule ottimali devono essere ottimizzate) per bene in una micropiastra coltura cellulare in 100 microlitri terreno di coltura. Non seminare cellule in pozzi di correzione di fondo (A1, A12, H1, H12) e mettere a medio solo (non le cellule) in questi pozzi. Suggerimento: Tenere la pipetta in un angolo unincontro a metà strada lungo il lato dei pozzi per strato cellulare più omogeneo. </li><li> Permettono alle cellule di stabilirsi a temperatura ambiente in una cappa di coltura cellulare per 1 ora. Ciò promuoverà la distribuzione uniforme delle cellule e ridurre gli effetti di bordo. Monitorare l&#39;adesione utilizzando un microscopio e la cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Tre ore dopo la placcatura, stimolare le cellule per 24 ore con 10 ng / ml LPS, o 20 ng / ml il mouse ricombinante IL-4 per generare M1 o M2 macrofagi, rispettivamente. Includere trattati naïve (M0) macrofagi come controllo. Valutare corretta M1 e M2 macrofagi polarizzazione misurando LPS-indotta secrezione di IL-6, IL-12, TNF (ELISA) e IL-4-indotta arginase-1 e / o MMR (CD206) e MGL (CD301) espressione di superficie (citometria a flusso) come descritto in precedenza 3,11. Nota: A questo punto, le cellule possono essere (pre) -treated con composti farmacologici di interesse o macrofagi possono essere stimolati con altri fattori. Dal momento che, la variazione tra pozzetti separati potrebbe essere substantial, è consigliabile utilizzare almeno 4 e idealmente 6 pozzetti per condizione. </li></ol> 2. Preparazione del saggio extracellulare Flux <ol><li> Idratare la cartuccia della sonda un giorno prima di eseguire il test: <ol><li> Posizionare la cartuccia della sonda a testa in giù accanto al piatto di utilità. </li><li> Riempire ciascun pozzetto della piastra di servizio con 200 ml di soluzione calibrante e abbassare la cartuccia del sensore sulla piastra utility immergendo i sensori nella soluzione calibrante. </li><li> Verificare il livello della soluzione calibrante è abbastanza alto per mantenere i sensori sommerse e posto in un non-CO 2 a 37 ° C incubatore O / N. </li></ol></li><li> Preparare terreno di coltura il giorno del test come segue: <ol><li> Caldo medio 50 ml XF di base a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 500 microlitri 200 mm L-glutammina si porta sul 2 mM concentrazione finale. </li><li> Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1 N e sterilizzare con un filtro da 0,2 micron e mantenere il terreno di coltura a 37 ° C. </li></ol></li><li> Rimuovere delicatamente il terreno di coltura cellulare dai macrofagi polarizzati e conservarlo a -20 ° C per un uso futuro (ad esempio ELISA esaminare corretto macrofagi polarizzazione). Lavare le cellule con 100 microlitri terreno di coltura, aggiungere 180 microlitri terreno di coltura per pozzetto e verificare sotto il microscopio che le cellule non sono state spazzate via. Posizionare la piastra di coltura cellulare in un 37 ° C incubatore senza CO 2 per 1 ora prima la sessione d&#39;analisi. </li><li> Preparare 10 x composto iniezione miscele A fino D come descritto in Tabella 1, riscaldare a 37 ° C, regolare il pH a 7,4 e filtro sterilizzare. <ol><li> Rendere tutti composti in queste miscele a 10 volte la concentrazione finale nei pozzetti di coltura cellulare e ottimizzare queste concentrazioni per ogni tipo di cellula. </li></ol></li><li> Caricare la cartuccia della sonda con le guide di carico forniti con volumi indicati (Tabella 1) dei preparati 10x miscele composte iniezione nei porti A, B, C e D, faucibusctively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Miscela / Iniezione </td><td> Composti </td><td> Volume aggiunto per ottenere 10x miscela (ml) </td><td> Volume del dosaggio medio (ml) </td><td> Volume iniettato durante il funzionamento (ml) </td><td> Concentrazione finale nel saggio </td></tr><tr><td> UN </td><td> 2,5 M (45%) di glucosio </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 MM </td></tr><tr><td> B </td><td> 5mM oligomicina A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1.5 micron </td></tr><tr><td> C </td><td> 5 FCCP mM </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1.5 micron </td></tr><tr><td></td><td> Soluzione 100 mM sodio piruvato </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D </td><td> 5 mM Antimicina A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 micron </td></tr><tr><td></td><td> 5 rotenone mm (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1.25 micron </td></tr></tbody></table> Tabella 1. miscele di iniezione. 3. Caratterizzazione bioenergetica di Polarized M1 e M2 BMDM utilizzando un extracellulare Flux Analyzer <ol><li> Creare un modello di test con la procedura guidata test con due minuti MIX e 3 volte minuti di misurare e (almeno) 3 misurazioni mix e dei tassi di cicli prima di ciascuno dei 4 iniezioni (Tabella 1) e dopo l&#39;ultima iniezione. Nota: Queste concentrazioni sono valide per i macrofagi del midollo osseo e RAW264.7 linee cellulari dei macrofagi, ma dovrebbe essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Aggiunta piruvato nella miscela FCCP è necessaria per alimentare la respirazione massima. </li><li> Inizia la corsa spingendo il fondo di avvio e seguire le istruzioni dell&#39;apparato. In primo luogo di carico della vetturaPiastra cartuccia con le sonde idratati per permettere la calibrazione da apparecchi e successivo carico la piastra di cella. </li><li> Dopo il test, scartare accuratamente tutto terreno di coltura e memorizzare la coltura cellulare analizzato micropiastra a -20 ° C per una futura normalizzazione cella utilizzando il kit di analisi proliferazione cellulare come descritto in dettaglio dal fornitore. <ol><li> Brevemente, preparare una memoria di cella-lisi 1x diluendo componente B 20 volte in acqua distillata e diluire composto A 400 volte nel tampone di lisi cellulare 1x. Aggiungere 200 ul per pozzetto, incubare 5 minuti a temperatura ambiente e misurare la fluorescenza con ~ 180 nm di eccitazione e ~ 520 massimi di emissione nm. Nota: Quando si lavora con le cellule non aderenti o scarsa aderenza è un problema, il kit di proliferazione cellulare diretto può essere usato come alternativa poiché questo protocollo non richiede scartando tutto terreno di coltura. Tuttavia, questo protocollo diretta è leggermente meno sensibile rispetto al protocollo utilizzato in questo laboratorio. </li></ol></li><li> Dopo la misurazione della fluorescenza, normalizzareil numero di cellule in ciascun pozzetto come rapporto in cui la conta cellulare media di tutti i pozzetti macrofagi naive è impostato a 1. Nota: Proteine ​​quantificazione (ad esempio utilizzando un test BCA) potrebbe essere usato come un modo alternativo per normalizzare le cellule conteggi. Tuttavia, nelle nostre mani questo saggio era meno sensibile rispetto al kit saggio di proliferazione cellulare. </li></ol>

<ol>
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Accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Seahorse Bioscience.

Lo scopo del nostro laboratorio è quello di capire come la polarizzazione e la funzione dei macrofagi possono essere influenzati con l&#39;obiettivo finale di migliorare il risultato di aterosclerosi e altre condizioni infiammatorie 12. Per valutare la polarizzazione dei macrofagi, si misura in genere i LPS (+ IFNγ) -indotta e IL-4-indotta espressione genica di M1 e M2 geni marcatori (qPCR), determina l&#39;IL-6, IL-12, TNF e NO secrezione (con ELISA e Griess reazione) ed esamina IL-4 indotta da CD71, espressione CD206, CD273 e CD301 superficie (mediante citometria di flusso) e arginasi attività di 3,13. Inoltre, saggi di apoptosi (di annessina-V / PI colorazione), saggi di fagocitosi (con perline fluorescenti di lattice e / o pHrodo E. coli) e saggi di formazione di cellule schiumose (da DII-oxLDL captazione, LipidTOX colorazione neutra lipidi) possono essere eseguite per valutare la funzionalità dei macrofagi 14. Inoltre, l&#39;analisi del flusso extracellulare può essere effettuata per misurare bioenergetica profili di mac polarizzatorophages come una nuova e alternativa di lettura funzionale. Questo manoscritto dimostra che la polarizzazione dei macrofagi induce riprogrammazione metabolica con macrofagi LPS-indotta di commutazione ad un aumento della glicolisi come fonte di energia. Viceversa, macrofagi M2 IL-4-indotti, usare la fosforilazione ossidativa mitocondriale come principale fonte di ATP. È importante sottolineare che, riprogrammazione metabolica non solo fornisce energia per le particolari esigenze di M1 e M2 macrofagi polarizzati. In effetti, i cambiamenti metabolici influito sulle concentrazioni del metabolita che sono regolatori diretti del macrofagi fenotipo 10,15,16. Quindi, il metabolismo dei macrofagi non è solo una caratteristica (come mostrato qui in figura 2), ma anche un pilota di diversi stati di polarizzazione dei macrofagi e questa nuova conoscenza ha sostenuto la rapida crescita del settore della ricerca immunometabolism durante l&#39;ultimo paio di anni. Tuttavia, le misure robuste di profili metabolici nella macrofagi rimasta difficile e avevano i loro limiti. In questo studio, un analizzatore flusso extracellulare viene applicato per misurare robusto glicolisi, riserva glicolitico, massima capacità glicolitica, acidificazione non glicolitico, basale e respirazione massima, la produzione di ATP, capacità respiratoria ricambio, perdita protonica e respirazione non mitocondriale in tempo reale in una quantità minima di macrofagi. Pertanto, abbiamo modificato e migliorato i protocolli del produttore come segue. La prova di stress Mito standard (# 103015-100) suggerisce di utilizzare media con glucosio e piruvato e un protocollo con 3 iniezioni (OM, FCCP, AA / Rot). Optiamo per avviare il test con glucosio / terreno privo di piruvato, aggiungere glucosio come prima iniezione nel canale A (come nella glicolisi Stress Test # 103.020-100) e aggiungere piruvato insieme sganciamento FCCP porta C. In questo modo , tutti i parametri glicolisi rilevanti derivano dalle misure ECAR 1-9 e tutte le informazioni utili su mitochondrifunzione al di misure OCR 4-15. Si noti che è fondamentale per iniettare piruvato insieme con FCCP per alimentare la respirazione massima su sganciamento. Prima di utilizzare questo protocollo combinato, si dovrebbe anche verificare che il 2-Deoxy-D-glucosio (2-DG) abbassa i livelli di ECAR dopo il test ai valori basali (1-3) e che i tassi di ECAR registrati 4-6 sono infatti dovuti a glicolisi. Inoltre, si dovrebbe comprendere che le concentrazioni composti e numero di cellule utilizzate in questo manoscritto sono valide per i macrofagi del midollo osseo e RAW264.7 linee cellulari dei macrofagi e dovrebbero essere ottimizzati per altri tipi di cellule. Inoltre, è da notare che M-CSF, che viene utilizzato per generare macrofagi del midollo osseo promuove un fenotipo antinfiammatorio M2-like. I risultati presentati dai macrofagi del midollo osseo possono quindi non essere pienamente comparabili a misurazioni con macrofagi del tessuto primario o macrofagi linee cellulari che non richiedono M-CSF durante Culturi celluleng. Rispetto ai metodi esistenti, questo protocollo richiede minime quantità di macrofagi e fornisce rapidamente quasi tutti caratteristiche cellulari metaboliche fondamentali. Ciò si traduce in cellule in eccedenza sufficiente per eseguire altri test immunologici e anche le cellule usate per la profilazione bioenergetica potrebbe ancora essere utilizzato per altri purposed dopo il test. Inoltre, la particolare disposizione della piastra 96 ​​e consente di valutare più condizioni in tempo reale allo stesso tempo. Tuttavia, la variazione tra singoli pozzetti può essere considerevole e quindi l&#39;uso di almeno 4 pozzi per condizione è spesso desiderato. Preso questa limitazione in considerazione, l&#39;analisi flusso extracellulare descritta consente comunque di eseguire più di 10 condizioni sperimentali (n = 6) in una sola volta, che è molto più rispetto alle tecniche tradizionali. Nel complesso, questo articolo fornisce un test funzionale semplice e riproducibile che consente di misurare tutto glicolisi pertinenti e param mitocondrialeetri a sottoinsiemi macrofagi polarizzati. Questa tecnica può servire come una domanda futura per valutare la funzione dei macrofagi e per valutare l&#39;effetto di manipolazioni distinti (ad esempio gene abbattere, nuovi farmaci, etc.) il (metabolica) fenotipo del macrofago. Come tale, i dati di flusso extracellulari possono essere utilizzati in combinazione con altri metodi per permettere caratterizzazione approfondita dello stato di attivazione dei macrofagi.

Mentre i macrofagi hanno un ruolo centrale in quasi tutte le malattie, i meccanismi molecolari che regolano la loro fenotipo non sono ancora completamente svelati. I macrofagi mostrano elevata eterogeneità e in risposta al microambiente adottare diversi fenotipi 1. LPS (+ IFNγ) indotta classicamente attivati ​​M1 o M (LPS) macrofagi favoriscono l&#39;infiammazione e proteggere l&#39;host contro diversi tipi di minacce microbiche 2. Altri usano IFNγ solo o in combinazione con TNF come stimoli per suscitare M1 polarizzazione. IL-4 e / o IL-13 induce l&#39;attivazione dei macrofagi alternativa e questi M2 o M (IL-4) cellule sono potenti soppressori e controller di risposte immunitarie in corso 3. Macrofagi polarizzati mostrano un regolamento distinto di metabolismo cellulare con macrofagi M1 LPS-attivati ​​subendo un interruttore metabolico a una maggiore glicolisi 4-6. Ossidazione degli acidi grassi al contrario, maggiore (FAO) e oxidativ mitocondrialee fosforilazione (OXPHOS) fornisce energia sostenuta IL-4-indotte macrofagi M2 7-9. Così, il metabolismo alterato non è solo una caratteristica di sottoinsiemi macrofagi polarizzati, è anche un prerequisito per una corretta polarizzazione e regolazione infiammatoria. È importante sottolineare che l&#39;inibizione della glicolisi o OXPHOS / FAO ha dimostrato di mettere in pericolo l&#39;attivazione M1 o M2, rispettivamente, 8,10. In quanto tale, individuando cambiamenti metabolici nei macrofagi potrebbe essere applicato come strumento per valutare il loro stato di polarizzazione e il potenziale infiammatorio. Un test che misura consistente metabolismo macrofagi potrebbe quindi essere utilizzato per prevedere se un farmaco, gene abbattere o altro trattamento colpisce macrofagi polarizzazione e la funzione. In questo video, un analizzatore di flusso extracellulare è utilizzato per caratterizzare i profili di bioenergetica di ingenui, M1 e M2 macrofagi. Dettagli Questo manoscritto un protocollo ottimizzato che consente la misurazionedi tutti i parametri rilevanti glicolisi (glicolisi, glicolisi massima e riserva glicolitico) e le caratteristiche della funzione mitocondriale (respirazione totale, basale respirazione mitocondriale, la produzione di ATP, di perdita di protoni, respirazione massima e la capacità respiratoria di scorta) in un unico dosaggio. Usando questa configurazione sperimentale, la bioenergetica possono essere confrontati tra controllo e &#39;alterato&#39; (ad es gene abbattere, sovraespressione transgenici o trattamento farmacologico) cellule.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Dopo aver terminato il flusso di test extracellulare e delle cellule quantificazione, i dati possono essere normalizzati per la conta delle cellule e analizzati. Questo sarà tipicamente resa ECAR e OCR trame come illustrato nella Figura 1A e 1B Figura. Dopo l&#39;iniezione di glucosio (A), l&#39;aumento ECAR rappresenta il tasso di glicolisi. L&#39;ulteriore aumento ECAR dopo inibizione ATP sintetasi con oligomicina (B) fornisce informazioni sulla riserva di glicolitico e capacità (Figura 1A). Analizzando i valori OCR, oligomicina iniezione (B) consente il calcolo del consumo di ossigeno utilizzato per la sintesi di ATP mitocondriale. FCCP (C) disaccoppia respirazione mitocondriale e le corrispondenti misure di OCR cedere dati sulla massima e la capacità respiratoria di riserva. Infine, l&#39;iniezione di rotenone (Rot) e antimicina A (AA) bloccano mitocondriale complesso I e III e l&#39;OCR residua rappresenta i contro di ossigeno non mitocondrialiumption (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Figura 1: parametri metabolici derivati ​​da un test di flusso XF extracellulare. (A) A seguito parametri della glicolisi cellulare sono calcolati a partire dai valori ECAR (in mph / min): la glicolisi, la capacità massima glicolisi e riserva glicolitico. Misure (B) OCR (in pmoli / min) vengono utilizzati per calcolare i successivi parametri fondamentali della funzione mitocondriale: respirazione basale, la produzione di ATP, perdita protonica, massimo la respirazione e la capacità respiratoria di riserva. Gluc = glucosio; OM = oligomicina A; FCCP = carbonile cianuro 4- (trifluorometossi) fenilidrazone; AA = antimicina A; Rot = Rotenone <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la corsa, ECAR e OCR misurazioni 1 till 15 per ogni bene può essere esportato in Excel e seguenti parametri glicolitici può essere calcolata in base alle misurazioni ECAR come segue: Acidificazione non glicolitico = avg. ECAR (1,2,3) Glicolisi = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3) Il numero massimo glicolisi = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3) Riserva glicolitico = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6) Dai tassi OCR, le caratteristiche metaboliche successivi possono essere determinate: La respirazione non mitocondriale = avg. OCR (13,14,15) Respirazione basale = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15) La produzione di ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9) Perdita Proton =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15) Respirazione massima = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15) Capacità respiratoria di ricambio (SRC) = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Figura 2:. Caratteristiche del metabolismo degli ingenui (M0), LPS (M1) e IL-4- (M2) macrofagi polarizzati Per ogni misura, la media e l&#39;errore standard della media (SEM) di 8 singoli pozzi è presentato. (A) i tassi di acidificazione extracellulare (ECAR, in mph / min) e (B) Tassi consumo di ossigeno (OCR, in pmoli / min) sono misurati per differenziale polarizzato (M1 e M2) e macrofagi naïve (M0). Tutte le misurazioni sono stati normalizzati per la conta delle cellule (come misurato con CyQUANT) e la conta delle cellule media dei macrofagi ingenui è stato fissato a 1.iniezione A = glucosio; B = oligomicina; C = FCCP; D = A + antimicina rotenone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Come mostrato in Figura 2A, l&#39;attivazione dei macrofagi con LPS induce aumento del metabolismo glicolitico. Le differenze tra LPS e macrofagi IL-4-trattati sono ancora più evidenti quando si guarda consumi ossigeno (OCR) in Figura 2B. Infatti, mentre il metabolismo ossidativo massima è altamente soppressa nel M (LPS), IL-4 induce la respirazione basale e soprattutto massima nei macrofagi M2. Si deve notare che l&#39;aumento della glicolisi è piuttosto unico di M (LPS) macrofagi e non è necessariamente una caratteristica di macrofagi M1 da M (IFNγ) macrofagi non visualizzano migliorare glicolisi. Nel complesso, questa analisi flusso extracellulare dimostra that IL-4-indotta macrofagi M2 sono caratterizzate da metabolismo ossidativo maggiore e soprattutto una elevata capacità respiratoria di riserva (SRC), mentre mostra LPS-attivati ​​macrofagi migliorato metabolismo glicolitico e non possiedono alcuna capacità respiratoria di riserva.

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Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Views.  Academic Medical Center, Amsterdam. Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Video: Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

Polarizzazione delle cellule derivate da monociti umani M1 e M2 e analisi con citometria a flusso sull'infezione da tubercolosi del micobatterio

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

Isolamento e coltura in vitro di macrofagi derivati dal midollo osseo per lo studio della biologia NO-Redox

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...