وأيد هذا العمل من قبل CNRS (PICS 2012-2014 لEG) وعن طريق منحة من REGIONE كامبانيا (LR N.5، 2002/03/28 إلى جيوفانا موتولا). فيليبو كونتي هو زميل في مؤسسة التعاون&#39;&#39; Infectiopole سود العلمي.&#39;&#39; نيكولا Boucherit هو زميل وزارة الفرنسي للأبحاث والتكنولوجيا. وكانت مصادر التمويل أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليل البيانات، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

بيان الأخلاق تمت الموافقة على بروتوكول للتعامل مع الحيوانات التي لدينا لجنة الأخلاقيات المؤسسية الحيوان &quot;CONSEIL العلمي دو مركز التدريب وآخرون للبحوث الطبية التجريبية-Chirurgical&quot; (CFREMC، تصريح المشروع 10-300٬122٬013 لاريك غيغو) من جامعة إيكس مرسيليا في الاتفاق مع قواعد من Décret رقم 87-848 من 1987/10/19. وأجريت التجارب في Faculté دي الدواء دي لا تيمون (تصريح التجريب رقم 13.385 لاريك غيغو). 1. المادية والثقافة إعداد وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الملقط اثنين، واثنين من مقص، واثنين من ريش الجراحية وقذيفة هاون ومدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول DMEM كاملة تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 10X PBS في المياه المقطرة العقيمة للحصول على برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X، DMEM كاملة الجليد الباردة، واستكمال وا DMEMrmed من إلى 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. إعداد L929 Supernatants الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لنقطة التقاء L929 (عشرون 175 سم 2 قوارير) في DMEM كاملة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li></ol> ملاحظة: مطلوب-الكريات بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF) للحث على تمايز الخلايا المكونة للدم في الضامة 12. L929 الخلايا تنتج GM-CSF. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التقاء، واستبدال سائل الإعلام والثقافة مع DMEM كاملة جديدة. نقل القوارير إلى 32 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 10 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وحوض سباحة وأجهزة الطرد المركزي في supernatants في 750 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل الكريات الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر supernatants في 15 مل أنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li></ol> 3. نخاع العظام المستمدة من البلاعم (BMDM) إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرات جراحية معقمة في كافة مراحل التجربة. تطهير الجلد مع 70٪ اليكوالحول. إجراء شق في الجزء العلوي من كل الساق الخلفية وسحب الجلد إلى أسفل نحو القدم لفضح العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رجليه الخلفيتين، وإزالة الجلد مع مقص العقيمة وملقط معقم. وضع الساقين داخل طبق بتري معقمة (35/10 مم) التي تحتوي على العقيمة، الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X (5 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة اللحم والعضلات التي يتم التمسك العظام مع مقص العقيمة وملقط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العظام إلى، طبق بتري معقمة جديدة (35/10 مم) التي تحتوي على الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (5 مل). تغسل العظام مرتين مع 5 مل من الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العظام إلى هاون العقيمة التي تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الساق من عظم الفخذ في مفصل مع مقص العقيمة. سحق العظام برفق في بمدافع الهاون العقيمة التي تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة، العقيمة برنامج تلفزيوني 1X باستخدام مدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف في 15 مل أنابيب الجليد الباردة. كرر هذه الخطوة 3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية من خلال 70 ميكرومتر الخلية نايلون ستراINER لإزالة الشظايا الصلبة. أجهزة الطرد المركزي الراشح في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بلطف طاف. فصل بيليه في 10 مل الدم الحمراء العازلة تحلل الخلية لمدة 30 ثانية. إضافة 20 مل من الجليد الباردة، DMEM كاملة. </li></ol> ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو إزالة تلويث خلايا الدم الحمراء، وبالتالي، يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في غضون 2 دقيقة لتجنب تغيير الخلية المكونة للدم من الدم الحمراء العازلة تحلل الخلية. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بلطف طاف. فصل بيليه في 20 مل DMEM كاملة التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى فصلها 2 أطباق بتري (100/20 مم). احتضان لهم لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع supernatants في 50 مل أنابيب في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الأطباق التي تحتوي على الضامة المقيمين. </li></ol> ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو القضاء على نخاع العظام المقيمينالضامة ث من خلال قدرتها على التمسك البلاستيك المعالجة الثقافة. ويمكن استخدام هذه الضامة المقيم في تجارب أخرى. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في supernatants جمعها في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بلطف بيليه في 10 مل DMEM كاملة تحتوي على 15٪ L929 خلية طاف. تحديد الخلايا خلال 40 ميكرومتر الخلية النايلون مصفاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الترشيح. إضافة الترشيح جمعت (10 مل) إلى 140 مل DMEM كاملة التي تم تستكمل مع 15٪ L929 سائل الاعلام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع 10 مل من تعليق خلية في طبق بتري (15 أطباق بتري، 100/20 ملم). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة 3 أيام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل DMEM كاملة التي تم تستكمل مع 15٪ L929. احتضان الخلايا لمدة 4 أيام إضافية. </li></ol> ملاحظة: مراقبة نمو الخلايا بشكل دوري مع مجهر مقلوب (الخطوات 3،14-3،16). وسوف تكون ملتصقة الضامةلوحظ بعد 3 أيام من الثقافة. 4. BMDMs الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. غسل BMDMs 2 مرات مع DMEM كاملة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل DMEM كاملة التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. فصل BMDMs عن طريق كشط بلطف مع شرطي المطاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع BMDMs في 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 450 وx ج لمدة 10 دقيقة. فصل بلطف الكريات خلية في 20 مل DMEM كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد BMDMs بحضور الأزرق التريبان (ينبغي مراعاة أي وفيات أكثر من 10٪). </li></ol> ملاحظة: بشكل عام، ويتم الحصول على حوالي 6-7.5 × 10 7 الضامة من 15 أطباق بتري (100/20 مم) الضامة. هناك ما يقرب من 4-5 × 10 6 الضامة / طبق بتري (100/20 مم). <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد BMDMs كما هو مطلوب للتجربة. بعد 16 ساعة في وسائل الإعلام كاملة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، وسوف تلتزم الضامة مرة أخرى إلى الدعم. </li></ol> 5. تخزين BMDMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع BMDMs معزولة (الخطوة 4.3). أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: قد يتم تجميد BMDMs في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كريات الخلية resuspend في تجميد وسائل الإعلام التي تتكون من 10٪ DMSO و 90٪ FCS في تركيز النهائي من 4 × 10 6 خلية / مل وماصة 1 مل في كل أمبولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد الخلايا بمعدل التبريد من 1 درجة مئوية / دقيقة. بعد 24 ساعة، ونقل أمبولة إلى حاوية النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. </li></ol>

<ol>
	<li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages:+chaos+revisited.">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li><li>Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4/80.">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+microbes:+complexity+in+action.">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li><li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte/macrophage+proteomics:+recent+findings+and+biomedical+applications.">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li><li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+bacterial+infections.">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li><li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes.">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li><li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages.">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li><li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing.">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant.">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li></ol>

لا توجد صراعات أعلن في المصالح.

بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة لانتاج أعداد كبيرة من BMDMs. BMDM هي الخلايا الأولية ولها وظيفة بيولوجية وخصائص متباينة من الضامة وحيدات لأن هناك نضجا، على النقيض من خطوط الخلايا بلعم، والتي هي غير ناضجة. BMDMs يمكن استخدامها لفحص الجيني (رني)، وفحص المخدرات، والدراسات ?...

وهناك جانب كبير من وظيفة البلاعم هو دورها في المناعة الفطرية والتكيفية. بسبب قدرتها على يبلعم الجسيمات الخاملة، والبكتيريا أو الطفيليات، الضامة هي خط الدفاع الأول ضد الغزاة الأجانب. مرة واحدة المنضوية، وتدهورت الميكروبات داخل phagolysosomes. الضامة أيضا إرسال إشارات لتجنيد ومستضدات موجودة على الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا اللمفية تي. وتستمد من وحيدات الضامة. حيدات تنشأ في نخاع العظم من الخلايا الجذعية النخاعي والهجرة إلى الدم الطرفية والأنسجة المختلفة حيث تفرق في الضامة. يقدر أن الفأر البالغين الأصحاء يحتوي على حوالي 10 8 الضامة التي يتم توزيعها في جميع أنحاء الجسم في مختلف الأجهزة والأنسجة (الجدول 1) 1،2. عرض الضامة المظهري كبيرة والتنوع الوظيفي بسبب قدرتها على التكيف مع 3،4 المكروية بهم. وmacrop أهمالملكية الحاج هو النشاط ميكروبات، والتي تم تعريفها بواسطة قدرتها على يبلعم الميكروبات وتدميرها. يتم تعريف استجابة أكلة من خلال تفعيل الشبكات الإشارات المعقدة التي تحفزها الاتصال الميكروبية، وبالتالي، الضامة تعدل التعبير الجيني بشكل مناسب في استجابة للمؤثرات متنوعة. بعد البلعمة، يتم القضاء على الميكروبات في بنية تسمى يحلول يبلوعي، ومع ذلك، وضعت العديد من الميكروبات المسببة للأمراض استراتيجيات لتخريب وظيفة ميكروبات الضامة 5. تنوع آليات التخريب التي يتم استخدامها من قبل الأنواع الميكروبية المختلفة هو دليل على تعقيد عملية البلعمة 6 و يحلول يبلوعي نشوء حيوي. الأمراض المعدية هي المشاكل الرئيسية صحة الإنسان، والعديد من الآليات والجزيئات المشاركة في الأنشطة المضادة للميكروبات البلاعم. وعلاوة على ذلك، فإن الأهداف من الخصائص ميكروبات التي يتم اختطافها من قبل الميكروبات لا تزال مجهولة، وبالتالي، هناك هxplosion من الاهتمام في الجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعلات المضيف الممرض الذي تجدد الاهتمام العلمي فيما يتعلق الضامة. حاليا، يتم الغالبية العظمى من البحوث في هذا المجال على خطوط الخلايا الضامة، والتي تختلف من الضامة الأساسي في النشاط أكلة، وإنتاج السيتوكينات وتنظيم انفجار التأكسدي. بالإضافة إلى ذلك، فهي أقل ملاءمة للفحص المجهري. للتحقيق في التفاعل الضامة، مسببات الأمراض فمن المستحسن استخدام الضامة الأولية، مثل نخاع العظم الضامة المشتقة (BMDMs)، والتي تظهر المزيد من الميزات الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن يعمل على BMDMs المعدلة وراثيا، وذلك لأن هذه الضامة قد تكون معزولة مباشرة من الفئران المعدلة وراثيا و، مع توافر تقنيات جديدة مثل ترنسفكأيشن lentiviral، ملفهم الشخصي التعبير الجيني يمكن تعديلها من قبل من overexpression الجينات أو تدخل الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف الإجراء لتمييز العظام الفئران مسهم في الضامة التي من شأنها توفير أعداد كبيرة من الضامة في 7 أيام وظيفية لمختلف التحاليل مثل البروتينات 7، 8 transcriptomics، يدرس الاتجار داخل الخلايا 9، ودراسات ديناميكية 10، وشاشات جينية (رني) وفحص المخدرات 11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>21969-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEM515F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100/20 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35/10 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow-derived macrophage production

الضامة هي عناصر حاسمة من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، وأنها هي خط الدفاع الأول ضد الغزاة الأجانب بسبب أنشطة ميكروبات قوية بهم. وتوزع على نطاق واسع في جميع أنحاء الضامة في الجسم وموجودة في الأجهزة اللمفاوية والكبد والرئتين والجهاز الهضمي والجهاز العصبي المركزي، والعظام، والجلد. بسبب إعادة تقسيم، فإنها تشارك في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية. الضامة هي خلايا تنوعا للغاية التي هي قادرة على الاعتراف التعديلات microenvironmental والحفاظ على توازن الأنسجة. وقد تطورت العديد من مسببات الأمراض آليات لاستخدام الضامة كما أحصنة طروادة من أجل البقاء، في تكرار، وتصيب كل من البشر والحيوانات وتنتشر في جميع أنحاء الجسم. الانفجار الأخير من الاهتمام في الجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعلات المضيف الممرض جددت الاهتمام العلمي فيما يتعلق الضامة. هنا، نحن تصفالإجراء لعزل وزراعة نخاع العظم الضامة من الفئران من شأنها أن توفر أعداد كبيرة من الضامة لدراسة التفاعلات المضيف الممرض وكذلك العمليات الأخرى.

كان الهدف من هذه الطريقة للحصول بسهولة أعداد كبيرة من الضامة في الأيام القليلة القادمة. ويتضح إعداد خلية نخاع العظم في الشكل 1. تم جمع العظام من الساق الخلفية وحطموا في بمدافع الهاون. مرة واحدة تم إزالة الضامة المقيمين من إعداد خلية نخاع العظم، وحضنت خلايا نخ...

Watch this Scientific Journal Video about Bone Marrow-derived Macrophage Production at JoVE.com

Bone Marrow-derived Macrophage Production

منذ فترة طويلة معترف بها الضامة بوصفها عنصرا حيويا من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. الانفجار الأخير من المعرفة المتعلقة بالجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعل بين الميكروبات الضامة وجددت الاهتمام العلمي لالضامة. توضح هذه المقالة طريقة للتمييز الضامة الماوس من نخاع العظام.

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

bone-marrow-derived-macrophage-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

72.7K Views.  Aix-Marseille Université.  منذ فترة طويلة معترف بها الضامة بوصفها عنصرا حيويا من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. الانفجار الأخير من المعرفة المتعلقة بالجوانب التطورية والجينية والبيوكيميائية والتفاعل بين الميكروبات الضامة وجددت الاهتمام العلمي لالضامة. ت...

Video: Bone Marrow-derived Macrophage Production

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

التوكسوبلازما جدار الكيس الغوندية تشكيل المنشط تقوم البلاعم في نخاع العظام والمستمدة من الشروط المتباطئة

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

تقييم آثار المخدرات على أساس الأجسام المضادة على موريني نخاع العظام وتنشيط بلعم البريتوني

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي وموت الخلايا بيروبتوتيك في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

عزل البلاعم المشتقة من نخاع العظم واستزراعها في المختبر لدراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...