تمثل طرق القياس الكمي للجسيمات المختلفة جانبا حاسما في معظم دراسات علم الأحياء. يسمح هذا البروتوكول بتحديد كمي دقيق للبيانات الفيروسية في الوقت الفعلي. تحل هذه التقنية محل القياس التقليدي للبيانات الفيروسية.
من خلال البيانات الموضوعية في الوقت الفعلي ، نحن أقل من فترة الثقة لدينا ، ونتجنب نقاط النهاية كثيفة العمالة التي تم تقييمها. يمكن استخدام هذه الطريقة لجميع الفيروسات التي تحفز تأثير اعتلال الخلايا. سيوضح الإجراء كوينتين غراسين ، فني مختبر من مختبرنا.
لنشر وتضخيم فيروسات H1N1 ، قم بالبذور 7.5 مرة 10 إلى خلايا MDCK ال 6 على قوارير زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سنتيمترا مربعا وفقا للبروتوكولات القياسية ، واحتضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية للوصول إلى 90 إلى 100٪ من الالتقاء. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين بخمسة ملليلترات من PBS المعقمة لكل قارورة لكل غسلة ، وقم بتسمية قارورة واحدة كعنصر تحكم. بعد ذلك ، قم بتخفيف قارورة مذابة من مخزون فيروس الأنفلونزا A إلى التركيز التجريبي المناسب في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على وسط انتشار فيروس جديد.
استخدم ملليلتر واحد من المخزون المخفف لإصابة خلايا MDCK بعدوى متعددة من 1 مرة 10 إلى سالب 3 ، أو 1 مرة 10 إلى وحدات تشكيل اللويحات 4 السالبة لكل خلية ، وإضافة ملليلتر واحد من وسط انتشار الفيروس إلى قارورة التحكم. امتص الفيروس إلى الخلايا لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع التحريك كل 15 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة اللقاح واستبداله ب 15 ملليلتر من وسط انتشار الفيروس مع استكمال ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من TPCK trypsin لتسهيل انقسام الهيماجلوتينين الفيروسي HA0 إلى وحدات فرعية HA1 و HA2.
ثم ضع القارورة في الحاضنة 35 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. في نهاية الحضانة ، قارن الخلايا في كل مزرعة تحت هدف 40x على المجهر الضوئي لتقييم تأثيرات اعتلال الخلايا على الخلايا. عندما يكتمل تأثير الاعتلال الخلوي ، أضف الخارقين لزراعة الخلايا إلى أنبوب 15 ملم وجمع الحطام الخلوي من كل مزرعة عن طريق الطرد المركزي.
بعد ذلك ، قم بنقل الخارق لثقافة الفيروسات الموضحة إلى أنبوب 15 ملليلتر ، وقم بنقل فيروسات النسل إلى قوارير مبردة معقمة تستخدم مرة واحدة لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتحديد كمية الخلايا المناسبة لعدوى الخلايا ، قم بإعداد مزارع خلايا MDCK متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا على مدار 24٪ كما هو موضح قبل غسل الخلايا باستخدام PBS وحصادها بحضانة لمدة 45 دقيقة في ثلاثة ملليلترات من 0.25٪ Trypsin-EDTA لكل قارورة عند 37 درجة مئوية. عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل بسبعة ملليلترات من وسط الثقافة الطازجة لكل قارورة ، وقم بحساب الخلايا من كل ثقافة.
تمييع الخلايا إلى 4 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من وسط زراعة الخلايا وإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة للخلايا كما هو موضح. ضع لوحة E في درجة حرارة الغرفة لعدة دقائق قبل إضافة 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر دون لمس أقطاب اللوحة E. افتح الحوامل وأدخل الواجهة الأمامية لللوحة في جيب المهد لأداة قياس المقاومة.
أغلق باب الحاضنة وافتح البرنامج. في إعداد نمط التجربة الافتراضي، قم بتمييز الحوامل المحددة وانقر نقرا مزدوجا على الصفحة العلوية لإدخال اسم التجربة. انقر فوق تخطيط وأدخل معلومات العينة الضرورية لكل بئر محدد من اللوحة.
انقر فوق جدولة وخطوات وإضافة خطوة. سيقوم البرنامج تلقائيا بإضافة خطوة ثانية واحدة لقياس مقاومة الخلفية انقر فوق تنفيذ وابدأ ، متابعة. انقر فوق رسم وإضافة لتحديد الآبار المناسبة، مما يؤكد أن مقاومة الخلفية تتراوح بين سالب 0.1 و 0.1 قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من المهد وإضافة 100 ميكرولتر من كل تعليق خلوي إلى الآبار المناسبة في نسختين. اترك اللوحة E في غطاء التدفق الرقائقي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتوزيع موحد للخلايا على قيعان الآبار قبل تحميل اللوحة E في جيب المهد. انقر فوق جدولة وإضافة خطوة وأدخل قيما لمراقبة الخلايا كل 30 دقيقة ل 200 تكرار قبل تحديد ابدأ، متابعة.
للتحقق من بيانات معاوقة الخلايا ورسمها ، انقر فوق رسم وحدد تركيز الخلايا الذي يسبق المرحلة الثابتة مباشرة بعد 24 ساعة من البذر للحصول على الخلايا التي لا تزال في مرحلة النمو أثناء العدوى الفيروسية. لتحديد العلاقة بين قيم CIT50 وتعدد العدوى ، بعد زراعة 3 مرات 10 إلى خلايا MDCK الرابعة المنقسمة حديثا في كل بئر من صفيحة microtiter الإلكترونية لمدة 24 ساعة ، اغسل الخلايا مرتين ب 100 ميكرولتر من وسط انتشار الفيروس الطازج لكل بئر ، لكل غسل ، واستخدم ماصة أحادية القناة لإضافة 100 ميكرولتر من التعليق الفيروسي إلى كل بئر. عند إضافة جميع تخفيفات الفيروس، قم بتحميل اللوحة برفق في جيب مهد الأداة عند 35 درجة مئوية، وابدأ في مراقبة مقاومة الخلية كل 15 دقيقة لمدة 100 ساعة على الأقل، كما هو موضح.
بعد دورتين من القياسات ، انقر لإيقاف الجهاز مؤقتا ، وإزالة اللوحة E من المهد. أضف 100 ميكرولتر من وسط انتشار الفيروس المكمل بالتريبسين TPCK إلى كل بئر وأعد اللوحة E إلى جيب المهد. ثم ابدأ التحليل.
لتقييم حركية بقاء فيروس الأنفلونزا A ، أضف كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 35 جراما لكل لتر في الماء المقطر ، وأضف 900 ميكرولتر من المحلول الملحي الناتج إلى أنابيب التبريد سعة مليلترين. أضف 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي إلى كل أنبوب تبريد وضع الأنابيب في حاضنة 35 درجة مئوية للفترة الزمنية التجريبية المناسبة. في اليوم السابق لنهاية الحضانة ، البذور 3 مرات 10 إلى خلايا MDCK المنقسمة حديثا و 100 ميكرولتر من وسط انتشار الفيروس لكل بئر في لوحة ميكروتيتر من 16 بئرا في خطوات متكررة ، مما يسمح بقياس مقاومة الخلفية والتوزيع الموحد للخلايا على قاع الآبار.
ثم تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين ، ثم أصاب الخلايا ب 100 ميكرولتر من الفيروس المقطر الملحي المخفف 10 مرات في وسط ثقافة طازجة ، كما هو موضح ، وراقب معاوقة الخلية كل 15 دقيقة لمدة 100 ساعة على الأقل. هنا ، يتم عرض البيانات الخام التي تم الحصول عليها بعد 120 ساعة بتركيزات مختلفة من خلايا MDCK.
بعد 24 ساعة ، كشفت قياسات مؤشر الخلايا أن الخلايا في الآبار المزروعة ب 3 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة كانت لا تزال في المرحلة الأسية للنمو ، لذلك ، تم استخدام تركيز الخلية هذا للتجارب اللاحقة. تظهر مزارع خلايا MDCK وجود علاقة خطية واضحة بين CIT50 والتعدد الأولي للعدوى بفيروس الأنفلونزا. تظهر نتائج تجربة حركية نموذجية للبقاء على قيد الحياة انخفاضا في مؤشر الخلية بسبب تأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس.
يمكن استخدام CIT50 لحساب منحدر التعطيل الفيروسي لكل فيروس في كل حالة لتحديد الفيروس الذي يتمتع بأكبر قدر من الاستقرار في البيئة المدروسة. يرتبط استقرار الفيروس بشكل غير مباشر بمنحدر التعطيل ، مما يسمح ، على سبيل المثال ، بتحديد بقايا الأحماض الأمينية في البروتين السكري الهيماجلوتينين التي تشارك في بقاء فيروس الأنفلونزا A خارج المضيف. هذه التقنية حساسة للغاية للاختلافات الصغيرة.
لذلك ، يتم تشجيع استخدام عداد خلية تلقائي من أجل الحصول على نتائج قابلة للتكرار بين التجارب. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لمقارنة تكرار الفيروسات المختلفة ، أو للتحقيق في استواء الفيروس لعدة خطوط خلوية في وقت واحد ، أو لدراسة خطوات محددة من دورة الفيروس.
