Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. המקרופאגים נגזר מח Culturing ומקטב עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0: עצם ירך לבודד ושוקת עצמות מעכברים ישנים 6-10 שבוע של עניין (C57Bl / 6 בassay זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת שריר מהעצמות ומניחים את העצמות בצלחת פטרי 9 סנטימטרים מלאים PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העצמות לצלחת 9 סנטימטרים פטרי מלא עם 70% אתנול ונער בעדינות את הצלחת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העצמות בצלחת פטרי טרי 9 סנטימטר המלא PBS סטרילי קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את עצם הירך ועצם שוק בשני הקצוות עם מספריים סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העצמות עם 10 סטרילי PBS קר כקרח מיליליטר באמצעות מזרק 10 מיליליטר ומחט 25 G. לאסוף את מח העצם בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי מח עצם לצינור 50 מיליליטר חדש באמצעות מחט 23 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב זה עם מחט 25 G. הערה: יש צורך בצעדים אלה כדי להסיר גושי תא ושאריות עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את supernatant וresuspend התאים במדיום 40 מיליליטר תא תרבות (RPMI-1640 בתוספת L- גלוטמין 2 מ&quot;מ, FCS 10%, פניצילין (100 U / ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ו -15% תא מסונן L-929 ( ATCC, CCL-1) בינוני זו מציעה המכיל M-CSF (או לחלופין 10 M-CSF רקומביננטי ng / ml במקום L-929 בינוניים-מותנה תא). הערה: הדור של מדיום ממוזג תא L-929 היה מפורט קודם לכן בכתב עת זה בשינה 2013. 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים מעכבר אחד בשתי 15 סנטימטרים צלחות פטרי (לא משתמש בצלחות שטופלה תרבית תאים מאז מקרופאג לא להתנתק מפלסטיק זה) ב 20 מיליליטר בינוני תרבות לכל צלחת ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טריות ביום 3, מבלי להסיר 20 מיליליטר מדיום תרבית תאים מבוגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום של כל צלחת הישנה עם 20 מיליליטר בינוני תרבות טריות ביום 6. פעולה זו, שאינה חסיד תאים יוסרו גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 8: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים על ידי דוגריהם 5 מ &#39;במלוח על 37 מעלות צלזיוס ב 10 מיליליטר ציטרט (אשלגן כלורי 135 מ&quot;מ בתוספת נתרן ציטרט 15 מ&quot;מ H 2 O, autoclaved) ולשטוף עם 10 מיליליטר PBS. רוזן מקרופאגים עצם בוגר נגזר מח (BMDM) ביום 8 באמצעות דלפק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא היווצרות הבוגרת (CD11b + F4 / 80 +) BMDM על ידי בדיקה ויזואלית או על ידי cytometry זרימה. בלוק 10 תאים 5 עם 1/100 אנטי-CD16 / CD32 ב PBS במשך 20 דקות ב 100 μl PBS, דגירה עם 1/200 נגד CD11b-FITC בתוספת 1/200 אנטי-F4 / 80-APC-Cy7 ב RT, לשטוף ולנתח ידי cytometry זרימה. הערה: מקרופאגים נגזרות מח עצם עכבר Culturing כבר פורסם בהרחבה קודם לכן בכתב עת זה על ידי et al יינג 11.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע 50,000 (ספירת תאים אופטימלית צריכים להיות מותאמים) לכל גם בmicroplate תרבית תאים במדיום תרבות μl 100. אל תאי זרע בבארות תיקון רקע (A1, A12, H1, H12) ולשים בינוניים בלבד (ללא תאים) בבארות אלה טיפ:. החזק את פיפטה בזוויתהתקף באמצע הדרך למטה בצד של הבארות לשכבת תאים הומוגנית ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להתיישב על RT במכסת מנוע תרבית תאים עבור שעה 1. זה יקדם גם חלוקת תא ולהפחית את תופעות קצה. צג דבקות באמצעות מיקרוסקופ ותרבות ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש שעות לאחר הציפוי, לעורר תאים למשך 24 שעות עם 10 ng / ml LPS, או 20 ng / ml עכבר רקומביננטי IL-4 כדי ליצור מקרופאגים M1 או M2, בהתאמה. כוללים מקרופאגים שלא טופלו נאיבי (M0) כביקורת. ו / או MMR (CD206) וMGL ביטוי משטח-arginase 1 פעילות להעריך קיטוב מקרופאג נכון M1 ו- M2 על ידי מדידת הפרשה מושרה LPS של IL-6, IL-12, TNF (ELISA) ו- IL-4-Induced (CD301) (Cytometry זרימה) כפי שתואר קודם לכן 3,11. הערה: בשלב זה, תאים יכולים להיות (מראש) -treated עם תרכובות תרופתיות של ריבית או מקרופאגים יכולים להיות מגורה עם גורמים אחרים. מאז, הווריאציה בין בארות נפרדות עשויה להיות צוללותtantial, מומלץ להשתמש לפחות 4 ובאופן אידיאלי 6 בארות לכל מצב. </li></ol> 2. הכנה של assay תאי השטף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה מחסנית חיישן יום אחד לפני הפעלת assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מחסנית החיישן הפוך ליד צלחת השירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא היטב בכל צלחת השירות עם 200 μl של פתרון calibrant ולהפחית את מחסנית החיישן לצלחת שירות הצללה החיישנים בפתרון calibrant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוודא את רמת פתרון calibrant היא גבוהה מספיק כדי לשמור על החיישנים שקועים ומקום ב2 37 ° C חממה שאינו CO O / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני assay ביום של assay כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני 50 מיליליטר בסיס XF חם עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl L- גלוטמין 200 מ&quot;מ כדי לקבל ריכוז סופי 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ולעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר ולשמור בינוני assay על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את מדיום תרבית תאים ממקרופאגים מקוטבים ולאחסן אותו ב -20 ° C לשימוש עתידי (למשל ELISA לבחון קיטוב מקרופאג נכון). שוטפים את התאים עם מדיום assay 100 μl, להוסיף 180 בינוני assay μl לכל גם ולאמת מתחת למיקרוסקופ שתאים לא נשטפו. מניחים את צלחת תרבית תאים בחממה 37 ° C ללא CO 2 עבור שעה 1 לפני ריצת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת 10 x מתחם הזרקה עד D, כמתואר בטבלה 1, חם עד 37 מעלות צלזיוס, להתאים את ה- pH 7.4 ולסנן לעקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את כל התרכובות בתערובות אלה ב10x הריכוז הסופי בבארות תרבית תאים ולייעל את הריכוזים אלה לכל סוג תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחסנית החיישן באמצעות מדריכי הטעינה מסופקים עם כמויות שצוינו (טבלת 1) של 10x תערובות מתחם הזרקה מוכנות בנמלים, B, C ו- D, respectively. </li></ol><table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תערובת / הזרקה </td><td> תרכובות </td><td> נפח הוסיף לקבל 10x תערובת (μl) </td><td> נפח Assay בינוני (מיליליטר) </td><td> הנפח המוזרק במהלך הריצה (μl) </td><td> ריכוז סופי בassay </td></tr><tr><td> א </td><td> 2.5 M (45%) גלוקוז </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> B </td><td> 5 מ&quot;מ oligomycin (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1.5 מיקרומטר </td></tr><tr><td> ג </td><td> 5 מ&quot;מ FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1.5 מיקרומטר </td></tr><tr><td></td><td> פתרון 100 מ&quot;מ נתרן פירובט </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> D </td><td> 5 מ&quot;מ antimycin (AA) </tד&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2.5 מיקרומטר </td></tr><tr><td></td><td> 5 rotenone מ&quot;מ (רוט) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1.25 מיקרומטר </td></tr></tbody></table> טבלת 1. תערובות הזרקה. 3. אפיון ביו-אנרגטי של מקוטב M1 ו- M2 BMDM באמצעות תאי שטף Analyzer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תבנית assay עם אשף assay עם MIX 2 דקות ו -3 פעמים נמדדו דקות ו( לפחות) 3 מדידות תערובת ושיעור לולאות לפני כל 4 הזריקות (טבלת 1) ולאחר הזריקה האחרונה. הערה: ריכוזים אלה תקפים למקרופאגים נגזרות מח עצם ושורות תאי מקרופאג Raw264.7, אבל צריך להיות מותאמים לכל סוג תא. יש צורך בהוספה פירובט בתערובת FCCP דלק נשימה מקסימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את הריצה על ידי לחיצה על תחתית ההתחלה ובצע את ההוראות של המכשיר. עומס ראשון המכוניתצלחת tridge עם בדיקות התייבשות כדי לאפשר כיול על ידי מנגנון והעומס הבא צלחת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay, להשליך בזהירות כל מדיום assay ולאחסן microplate תרבית התאים נותח ב -20 ° C לנורמליזציה תא עתיד באמצעות ערכת assay התפשטות תאים כפי שתואר בפירוט על ידי הספק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להכין חיץ תא תמוגה 1x על ידי דילול הרכיב B פי 20 במים מזוקקים ולדלל מתחם 400-פי במאגר תא תמוגה 1x. הוסף 200 μl לכל גם, דגירה 5 דקות ב RT ולמדוד הקרינה עם ~ 180 ננומטר עירור ו~ 520 מקסימום פליטת ננומטר. הערה: כאשר עובדים עם תאים שאינם חסיד או אם דבקות עניה היא דאגה, ערכת התפשטות תאים הישירה יכולה לשמש כחלופה מאז פרוטוקול זה אינו דורש השלכת כל מדיום assay. עם זאת, פרוטוקול ישיר זו הוא מעט פחות רגיש בהשוואה לפרוטוקול המשמש במעבדה זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מדידת הקרינה, לנרמלספירת תאים בכל טוב כיחס שבו ספירת התאים הממוצעת של כל בארות מקרופאג הנאיביים מוגדרת ליום 1 ב. הערה: כימות חלבון (למשל באמצעות assay BCA) יכול לשמש כדרך חלופית ללנרמל תאי ספירה. עם זאת, בידיים שלנו assay זה היה פחות רגיש בהשוואה לערכת assay התפשטות תאים. </li></ol>

<ol>
	<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment.">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes.">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li><li>Pearce, E. L., Pearce, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+immune+cell+activation+and+quiescence.">Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence.</a> Immunity. 38, 633-643 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKM2+regulates+the+Warburg+effect+and+promotes+HMGB1+release+in+sepsis.">PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis.</a> Nature communications. 5, 4436 (2014).</li><li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+macrophages+glucose+transporter+1+(GLUT1)+mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype.">Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).</li><li>Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiles+diverge+during+macrophage+polarization+implications+for+the+interpretation+of+18F+FDG+PET+imaging+of+atherosclerosis.">Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis.</a> J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).</li><li>Vats, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+metabolism+and+PGC+1beta+attenuate+macrophage+mediated+inflammation.">Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation.</a> Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).</li><li>Huang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+intrinsic+lysosomal+lipolysis+is+essential+for+alternative+activation+of+macrophages.">Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages.</a> Nature immunology. 15, 846-855 (2014).</li><li>Tannahill, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+is+an+inflammatory+signal+that+induces+IL+1beta+through+HIF+1alpha.">Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha.</a> Nature. 496, 238-242 (2013).</li><li>Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages.">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+Histone+deacetylase+3+stabilizes+atherosclerotic+lesions.">Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions.</a> EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophages+engage+in+homotypic+and+heterotypic+interactions+through+IL+4+and+polyamine+induced+E+cadherin+catenin+complexes.">Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes.</a> Blood. 114, 4664-4674 (2009).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+epigenetic+enzymes+to+improve+atherogenic+macrophage+functions.">Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).</li><li>Galvan Pena, S., O Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprograming+in+macrophage+polarization.">Metabolic reprograming in macrophage polarization.</a> Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).</li><li>Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+metabolism+and+macrophage+functional+polarization.">Cellular metabolism and macrophage functional polarization.</a> International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).</li></ol>

הגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי סוסון הים Bioscience.

המטרה של המעבדה שלנו היא להבין כיצד קיטוב ותפקוד מקרופאג יכולים להיות מושפע במטרה האולטימטיבית כדי לשפר את התוצאה של טרשת עורקים ומצבים דלקתיים אחרים 12. כדי להעריך קיטוב מקרופאג, אחד בדרך כלל מודד את LPS (+ IFNγ) -induced וIL-4-Induced ביטוי גנים של M1 וגני סמן M2 (qPCR), קובע IL-6, IL-12, TNF ואין הפרשה (על ידי ELISA וGriess תגובה) ובוחן CD71, ביטוי CD206, CD273 וCD301 פני השטח (על ידי cytometry זרימה) וarginase פעילות מושרה IL-4 3,13. בנוסף, מבחני אפופטוזיס (על ידי Annexin-V / הכתמת PI), מבחני phagocytosis (עם חרוזי ניאון לטקס ו / או coli pHrodo א) ומבחני היווצרות תאי קצף (על ידי ספיגת DiI-oxLDL, מכתים שומנים ניטראלי LipidTOX) יכולים להתבצע ל להעריך פונקציונלי מקרופאג 14. בנוסף, ניתוח שטף תאי ניתן לבצע כדי למדוד bioenergetics פרופילים של מק מקוטבrophages כקריאת נתונים פונקציונליים חדשה ואלטרנטיביות. כתב יד זה מראה כי קיטוב מקרופאג גורם תכנות מחדש חילוף חומרים עם מקרופאגים המושרה LPS מעבר לגליקוליזה גדלה כמקור האנרגיה שלהם. לעומת זאת, מקרופאגים M2 מושרה-IL-4 להשתמש זרחון חמצוני המיטוכונדריה כמקור העיקרי של ה- ATP. חשוב לציין, תכנות מחדש חילוף חומרים לא רק מספק אנרגיה לדרישות מסוימות של מקרופאגים מקוטבים M1 ו- M2. ואכן, שינויים מטבוליים משפיעים ריכוזי המטבוליט שרגולטורים ישירים של פנוטיפ מקרופאג 10,15,16. לפיכך, חילוף החומרים מקרופאג הוא לא רק אופייני (כפי שמוצג כאן באיור 2), אלא גם נהג של מצבי קיטוב מקרופאג מובחנים והידע החדש הזה תמך בצמיחה המהירה של תחום מחקר immunometabolism במהלך השנים האחרונות. עם זאת, מדידות חזקות של פרופילים מטבולים במאקרופאגים נשארו קשים ולא היו להם מגבלות. במחקר זה, מנתח שטף תאי מוחל למדוד גליקוליזה, מילואים glycolytic, קיבולת glycolytic מקסימלי, החמצה שאינה glycolytic, בסיסיים ונשימה מקסימלי, ייצור ATP, יכולת נשימה חילוף, דליפת פרוטון ונשימה אינה המיטוכונדריה בזמן אמת וחסונה בכמות מינימאלית של מקרופאגים. לכן, אנו שונו ושופרו פרוטוקולים של היצרן כדלקמן. המבחן הסטנדרטי מתח מיטו (# 103,015-100) מציע להשתמש בינוני עם גלוקוז ופירובט ופרוטוקול עם 3 זריקות (OM, FCCP, AA / רוט). אנו בוחרים להתחיל assay עם גלוקוז / בינוני ללא פירובט, להוסיף סוכר כבזריקה ראשונה בנמל (כמו במבחן # מתח גליקוליזה 103,020-100) ולהוסיף פירובט יחד עם uncoupler FCCP בנמל ג בדרך זו , כל הפרמטרים גליקוליזה הרלוונטיים נגזרים ממדידות ECAR 1-9 וכל המידע הרלוונטי אודות mitochondriפונקצית אל ממדידות OCR 4-15. שים לב שזה קריטי להזריק פירובט יחד עם FCCP דלק נשימה מקסימלי על שחרר. לפני השימוש בפרוטוקול משולב זה, יש גם לוודא ש2-Deoxy-D-גלוקוז (2-DG) מוריד את רמות ECAR לאחר assay לערכים הבסיסיים (1-3) וכי שיעורי ECAR נרשמו 4-6 אכן בשל לגליקוליזה. בנוסף, יש להבין כי ריכוזי המתחם ומספרים סלולריים בשימוש בכתב היד הזה תקפים למקרופאגים נגזרות מח עצם ושורות תאי מקרופאג Raw264.7 וצריך להיות מותאמים לסוגי תאים אחרים. יתר על כן, יש לציין כי M-CSF שמשמש להפקת מקרופאגים נגזרות מח עצם מקדם פנוטיפ אנטי דלקתי כמו-M2. התוצאות שהוצגו ממקרופאגים נגזרות מח העצם עשויות אפוא להיות לא ניתן להשוות באופן מלא למדידות עם מקרופאגים תושב רקמות ראשוניות או מקרופאגים שורות תאים שאינם דורשות M-CSF במהלך culturi תאng. בהשוואה לשיטות קיימות, פרוטוקול זה דורש כמויות מינימליות של מקרופאגים ומספק במהירות כמעט את כל מאפייני תא חילוף חומרים בסיסיים. כתוצאה מכך מספיק תאים עודפים לבצע מבחני אחרים חיסוניים ואפילו תאים המשמשים לאפיון bioenergetics עדיין יכול לשמש לשני תכליתי לאחר assay. יתר על כן, בפורמט המסוים צלחת 96 גם מאפשר הערכת תנאים מרובים בזמן אמת באותו הזמן. ובכל זאת, הווריאציה בין בארות בודדות יכולה להיות משמעותית ולכן השימוש בלפחות 4 בארות לכל מצב הוא לעתים קרובות רצוי. נלקח בחשבון מגבלה זו, ניתוח השטף תאי תאר עדיין מאפשר להפעיל יותר מ -10 תנאי ניסוי (n = 6) בבת אחת, וזה הרבה יותר מאשר טכניקות מסורתיות. בסך הכל, מאמר זה מספק assay התפקודי קל ושחזור המאפשר מדידה כל גליקוליזה הרלוונטית ופרמטר המיטוכונדריהאטות בתת מקרופאג מקוטב. טכניקה זו יכולה לשמש כיישום עתיד כדי להעריך את תפקוד מקרופאג ולהעריך את ההשפעה של מניפולציות שונות (להפיל, תרופות חדשות כגון: גן, וכו &#39;) על הפנוטיפ של מקרופאג (חילוף חומרים). ככזה, ניתן להשתמש בנתונים שטף תאיים בשיתוף עם מבחני אחרים, כדי לאפשר אפיון מעמיק של מצב הפעלת מקרופאג.

בעוד מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי כמעט בכל מחלות, המנגנונים המולקולריים המווסתים את הפנוטיפ שלהם הם עדיין לא פרומים באופן מלא. המקרופאגים להציג גבוהה ההטרוגניות ובתגובה למייקרו-הסביבה לאמץ פנוטיפים שונים 1. LPS (+ IFNγ) -induced מופעל קלסי מקרופאגים M1 או M (LPS) לקדם ולהגן על דלקת המארח נגד סוגים שונים של איומי חיידקים 2. אחרים משתמשים IFNγ לבד או בשילוב עם TNF כגירויים לעורר קיטוב M1. IL-4 ו / או IL-13 גורם הפעלת מקרופאג חלופית וM2 אלה או M (IL-4) תאי מדכאי ובקרים של תגובות חיסוני מתמשכות 3 חזקים. מקרופאגים מקוטבים להציג רגולציה שונה של חילוף חומרים תאיים עם מקרופאגים M1 מופעלים-LPS עוברים מתג חילוף חומרים לגליקוליזה המשופרת 4-6. חמצון של חומצות שומן לעומת זאת, משופרים (FAO) וoxidativ המיטוכונדריהזירחון הדואר (OXPHOS) מספק אנרגיה מתמשכת במקרופאגים M2 מושרה-IL-4 7-9. לפיכך, חילוף חומרים משתנים הוא לא רק מאפיין של תת מקרופאג מקוטב, הוא גם תנאי מוקדם לקיטוב נכון ורגולציה דלקתית. חשוב לציין, העיכוב של גליקוליזה או OXPHOS / FAO הודגם לפגוע בהפעלת M1 או M2, בהתאמה 8,10. ככזה, שינויים מטבוליים זיהוי במקרופאגים יכולים להיות מיושמים ככלי להערכת מצב הקיטוב שלהם ופוטנציאל דלקתי. Assay עקבי המודד את חילוף החומרים מקרופאג לכן יכול לשמש כדי לחזות אם תרופה, גן להפיל או טיפול אחר משפיע על קיטוב מקרופאג ותפקוד. בסרטון הזה, מנתח שטף תאי משמש כדי לאפיין את פרופילי bioenergetics של מקרופאגים הנאיביים, M1 ו- M2. כתב יד זה מפרט פרוטוקול מותאם המאפשר המדידהשל כל הפרמטרים הרלוונטיים גליקוליזה (גליקוליזה, גליקוליזה המקסימלי ומילואים glycolytic) ומאפיינים של המיטוכונדריה פונקציה (נשימה כוללת, נשימה המיטוכונדריאלי בסיסית, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלי ויכולת נשימה חילוף) בassay אחד. השימוש בהגדרת ניסוי זה, ניתן להשוות בין bioenergetics שליטה ו&#39;שינה &#39;(למשל גן להפיל, ביטוי יתר מהונדס או טיפול תרופתי) תאים.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

לאחר שסיים את כימות assay ותא שטף תאי, יכולים להיות מנורמלים נתונים לספירת תאים ונותחו. זה בדרך כלל יניב חלקות ECAR וOCR כפי שמוצג באיור 1 א ואיור 1 ב. לאחר ההזרקה של גלוקוז (), העלייה בECAR מייצגת את שיעור גליקוליזה. עלייה נוספת בECAR לאחר עיכוב synthase ATP עם oligomycin (ב) מספקת מידע על המילואים והקיבולת (איור 1 א) glycolytic. כאשר מנתחים את ערכי OCR, oligomycin הזרקה (ב) מאפשר חישוב של צריכת החמצן המשמשת לסינתזת ATP במיטוכונדריה. FCCP (C) uncouples נשימה המיטוכונדריאלי והמדידות OCR המתאימות להניב נתונים על מקסימאלי ויכולת נשימה חילוף. לבסוף, הזרקה של rotenone (רוט) וantimycin (AA) לחסום אני מורכב המיטוכונדריה ושלישית וOCR השייר מייצג את חסרונות החמצן אינה המיטוכונדריהumption (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> איור 1: פרמטרים מטבולית נגזרים מassay שטף XF תאי. () הפרמטרים הבאים של גליקוליזה הסלולרית מחושבים מערכי ECAR (במייל / min): גליקוליזה, קיבולת המרבית glycolytic ומילואים glycolytic. מדידות OCR (ב) (בpmoles / min) משמשות לחישוב הפרמטרים הבסיסיים הבאים של פונקציה של המיטוכונדריה: נשימה בסיסית, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה המרבית ויכולת נשימה חילוף. Gluc = גלוקוז; OM = oligomycin; FCCP = 4 phenylhydrazone ציאניד קרבוניל (trifluoromethoxy); AA = antimycin; רוט = Rotenone <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאחר הריצה, מדידות ECAR וOCR 1 till 15 לכל אחד גם יכול להיות מיוצא ל- Excel וניתן לחשב את הפרמטרים הבאים glycolytic ממדידות ECAR כדלקמן: החמצה ללא glycolytic = ממוצע. ECAR (1,2,3) גליקוליזה = ממוצע. ECAR (4,5,6) - ממוצע. ECAR (1,2,3) קיבולת המרבית glycolytic = ממוצע. ECAR (7,8,9) - ממוצע. ECAR (1,2,3) מילואים glycolytic = ממוצע. ECAR (7,8,9) - ממוצע. ECAR (4,5,6) משיעורי OCR, ניתן לקבוע את מאפייני חילוף החומרים הבאים: נשימה ללא המיטוכונדריה = ממוצע. OCR (13,14,15) נשימה בסיסית = ממוצע. OCR (4,5,6) - ממוצע. OCR (13,14,15) ייצור ATP = ממוצע. OCR (4,5,6) - ממוצע. OCR (7,8,9) דליפת פרוטון =ממוצע. OCR (7,8,9) - ממוצע. OCR (13,14,15) נשימה = ממוצע מרבי. OCR (10,11,12) - ממוצע. OCR (13,14,15) יכולת נשימה חילוף (SRC) = ממוצע. OCR (10,11,12) - ממוצע. OCR (4,5,6) <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> איור 2:. מאפייני מטבולית של נאיבי (M0), LPS- (M1) ו- IL-4 (M2) מקרופאגים מקוטבים לכל מדידה, הממוצע וסטיית התקן של הממוצע (SEM) של 8 בארות בודדות מוצג. (א) שיעורי החמצה תאיים (ECAR, במייל לשעה / דקה) ושיעורים (ב) צריכת חמצן (OCR, בpmoles / min) נמדדים למקוטב באופן דיפרנציאלי (M1 ו- M2) ומקרופאגים הנאיביים (M0). כל המדידות היו מנורמלות לספירת תאים (כפי שנמדדו בCyQUANT) וספירת התאים הממוצעת של מקרופאגים הנאיביים נקבעה על 1. בjection = גלוקוז; = Oligomycin B; C = FCCP; D = antimycin + Rotenone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כפי שניתן לראות באיור 2 א, הפעלת מקרופאג עם LPS משרה על חילוף חומרים מוגבר glycolytic. ההבדלים בין LPS ומקרופאגים שטופלו IL-4 הם עוד יותר נראית לעין כאשר מסתכלים על שיעורי צריכת חמצן (OCR) באיור 2. ואכן, תוך מטבוליזם חמצוני המקסימאלי מדוכא ביותר בM (LPS), IL-4 גורם נשימה בסיסית ומקסימלי במיוחד במקרופאגים M2. יש לציין כי glycolytic המוגבר הוא די ייחודי לM מקרופאגים (LPS) ואינו בהכרח אופייני של מקרופאגים M1 מאז מקרופאגים M (IFNγ) לא להציג לשפר גליקוליזה. בסך הכל, ניתוח שטף תאי זה מדגים thaהמושרה IL-4 לא מקרופאגים M2 מתאפיינים במטבוליזם חמצוני מוגברים ובמיוחד יכולת נשימה חילוף גבוהה (SRC), ואילו תצוגת מקרופאגים מופעל LPS משופר חילוף חומרים glycolytic ולא מחזיקה שום יכולת נשימה חילוף.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Views.  Academic Medical Center, Amsterdam. Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Video: Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

קיטוב של M1 ו M2 תאים נגזרים מונוציט אנושי וניתוח עם Cytometry זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

בידוד ותרבית במבחנה של מקרופאגים שמקורם במח עצם לחקר הביולוגיה של NO-Redox

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...