We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li><li>Renner, K., Jansen-D&#252;rr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption.">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li><li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism.">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).</li><li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons.">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li></ol>

الدكتور شونا Mookerjee تعلن أنها لا تملك المصالح المالية المتنافسة. تمت استشارة الدكتور مارتن العلامة التجارية لفرس البحر العلوم البيولوجية، التي تنتج الأدوات والكواشف المستخدمة في هذه المادة. تم دفع رسوم النفاذ المفتوح من أجل هذه المقالة للحصول بواسطة فرس البحر العلوم البيولوجية.

تحمض خارج الخلية هو مؤشر قياس بسهولة من معدل الأيض الخلوي. لتحديد بشكل صحيح معدل تحلل الخلوية (على النحو المحدد إنتاج اللاكتات) فمن الأهمية بمكان أن نعرف قوة التخزين المؤقت للوسط الفحص، وإلى تحويل قياسات التدفق خارج الخلية من استهلاك الأوكسجين وتحمض إلى بروتون معدلات الإنتاج. قبل تنفيذ هذا الحساب، وتحمض الناتجة من CO 2 الذي صدر في دورة حمض الستريك يمكن طرح، وترك تحمض الذي ينجم عن إنتاج اللاكتات. طرق مختلفة متعددة نظرا هنا لقياس قوة التخزين المؤقت لهذا التصحيح تحمل مزايا وعيوب مختلفة. القياس الخارجي باستخدام مسبار درجة الحموضة ودرجة عالية من الدقة وقابلة للتكرار، ولكن قد لا تعكس الفروق الصغيرة في الكشف عن درجة الحموضة التي أدخلتها fluorophores الواردة في لوحة الفحص، إضافة مركبات خلال الفحص، أو وجود رانه الخلايا نفسها. للفي لوحة قياسات درجة الحموضة وتتناول هذه القضايا، ولكن أيضا إدخال درجات متفاوتة من الضوضاء التجريبية. تصحيح CO 2 إلى ECAR يسمح لأول مرة على حساب اضح لا لبس فيه والكمي للمعدل حال السكر، ويكشف عن تباين في مساهمة الجهاز التنفسي وحال السكر إلى إجمالي ECAR أثناء التجربة. باستخدام المعادلة (5) وقياسات OCR، ECAR، والتخزين المؤقت السلطة، ومعدل حال السكر يمكن حسابها باستخدام جدول بسيط المقدمة (الجدول 6). يمكن التحقق من هذا المعدل عن طريق قياس اللاكتات اللاحق، إذا رغبت في ذلك 6. في الخلايا حيث مسار الفوسفات البنتوز نشطا للغاية، واستخدام مثبطات ممر مثل 6-aminonicotinamide قد يكون مفيدا لعزل معدل حال السكر. حساب لمساهمات كل من CO 2 - والمستمدة من اللاكتات H + من مجموع قياس الخلوية إضافي تحمض معدل والأكسجين Consumptأيون المعدل هو أداة لا تقدر بثمن لاستخدام البيانات تدفق خارج الخلية في الإدلاء ببيانات قوية وكمية عن النشاط الأيضي. باستخدام الإجراءات الموضحة هنا، بما في ذلك التعديلات المختلفة لقياس قوة التخزين المؤقت، وتحقيق الاستفادة المثلى من التجربة التدفق خارج الخلية للخلايا قيد التحقيق والبيانات المطلوبة، فإن معدل تحلل في خلايا سليمة يمكن كميا في إطار مجموعة واسعة من الظروف التجريبية. هذا الأسلوب يقتصر على الخلايا التي يمكن أن تنمو في ثقافة ملتصقة على (أو الخلايا أو العضيات التي يمكن الالتزام بها) على سطح البوليسترين. هو الأكثر موثوقية عندما الخلايا المستزرعة هي متجانسة ومتموجة، على الرغم من بيانات مفيدة قد لا يزال الحصول على مجموعة من هذه الشروط. الحسابات تتطلب بعض المعرفة من عملية التمثيل الغذائي للخلايا، والحد الأقصى H + / O 2 نطاقات ،65-1،0 للأكسدة كاملة من ركائز مختلفة وأكثر لالأكسدة الجزئية 6، ولكن إذا كانت الخلايا كnown لأكسدة الجلوكوز، يمكن افتراض قيمة من 1.0. رغم أهميتها لجميع خصائص الأيض، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص عند استخدامها في النظم التي تحول بين التمثيل الغذائي في الجهاز التنفسي وحال السكر للحفاظ على إمدادات ATP الخلوية هو النمط الظاهري النقدي، بما في ذلك توصيف الخلايا الجذعية والخلايا السرطانية المستمدة من الورم. وفهم التغيرات الأيضية التحكم في هذه وغيرها من السياقات تسمح بدرجة أكبر من التطور والدقة في التصميم والتحليل التجريبي لهذه الأنواع من الخلايا.

الهدف العام من هذه الطريقة لقياس دقيق لمعدل حال السكر من الخلايا باستخدام تحليل تدفق خارج الخلية. القياس الكمي للمعدل حال السكر باستخدام تحمض خارج الخلية هو نقطة النهاية المرجوة من العديد من التجارب. ومع ذلك، فإن المعدل الإجمالي للتحمض خارج الخلية هو مجموع عنصرين: تحمض الجهاز التنفسي، في شكل CO 2 (الذي يرطب إلى H 2 CO 3 ثم تنأى لHCO 3 - + H +)، وتحمض حال السكر، في شكل اللاكتات - + H +. وحتى وقت قريب كانت تعتبر مساهمات CO 2 إلى إجمالي تحمض خارج الخلية تذكر في منصة القياس المستخدمة هنا، محلل XF24 7. ومع ذلك، فمن الواضح في الأنظمة الأخرى المتعددة التي CO 2 يمكن أن تكون مساهما رئيسيا في الخلية تحمض 4-5. أوراق متعددة تقر هذا يخدعtribution، ولكن لا تحاول الكميات مباشرة من CO 2 -derived 3،8،9 الحمضية. أثبتنا مؤخرا كميا أن إنتاج CO 2 هو مصدر هام من مصادر خارج الخلية تحمض في هذا النظام 6. وعلاوة على ذلك، رغم أن هناك العديد من المسارات الأيضية التي تولد CO 2 من هدم الجلوكوز، وتلك التي تقوم بها dehydrogenases مصفوفة في دورة حمض الستريك هي المساهمة ساحق وجميع مصادر أخرى تولد كميات CO 2 التي تقع ضمن الخطأ التجريبي 6. دون تصحيح لCO 2 الإنتاج، وتحمض خارج الخلية وبالتالي هو مؤشر غامضة من معدل حال السكر، ولا يمكن أن تستخدم كميا. ويبرز لدينا المنشور السابق عدة حالات حيث يضم الجهاز التنفسي CO 2 الجزء الأكبر من إجمالي إشارة تحمض، حتى في خلايا يعتقد عموما لاستخدام أساسا تحلل 6. بالإضافة إلى ذلك،الجهاز التنفسي مساهمة CO 2 إلى إجمالي تحمض تختلف على نطاق واسع خلال التجارب التنميط الأيضية المشتركة، مما يدل على أن المقارنة الصحيحة من معدل حال السكر خلال أجزاء مختلفة من تجربة تتطلب تصحيح CO 2. لقياس معدل حال السكر من الخلايا باستخدام معدل تحمض خارج الخلية، فمن الضروري تحويل تغيرات درجة الحموضة للتغيرات في إجمالي H + ولدت، وطرح تحمض خارج الخلية التي تسببها CO 2 طرحها أثناء التشغيل من دورة حمض الستريك. هنا، نحن تصف طريقة واضحة لقياس خارج الخلية معدل إنتاج بروتون (من التغيرات خارج الخلية في درجة الحموضة وقوة معايرة التخزين المؤقت للوسط مقايسة) وCO 2 إنتاج (من التغيرات خارج الخلية في O 2 التركيز)، وشرح كيفية حساب معدل حال السكر استخدام هذه القياسات. هذه القوة طريقة<html> ENS أداة القياس تحمض خارج الخلية عن طريق استخدامه لحساب معدل حال السكر بشكل صحيح كما حددتها إنتاج اللاكتات. دون تصحيح لCO التنفسي 2 (أو القياس المباشر لاكتات)، فإنه من المستحيل تحديد ما إذا كان وإلى أي مدى يعكس معدل تحمض إجمالي معدل حال السكر، يفند تفسير التجارب التي تستخدم الكلي تحمض خارج الخلية كمقياس مباشر من إنتاج اللاكتات. الحسابات CO 2 واللاكتات و، داخل الخطأ التجريبي، اثنين فقط من المساهمين في إنتاج حمض خارج الخلية، استنادا إلى التجارب مع الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية 6. ولذلك، فإن معدل إجمالي تحمض خارج الخلية (PPR، ومعدل إنتاج بروتون) يمكن تعريفها بأنها: PPR TOT = PPR التركيب + PPR glyc المعادلة 1 . _content &quot;&gt; حيث TOT = المجموع؛ التركيب = الجهاز التنفسي؛ glyc = حال السكر حال السكر PPR هو على النحو التالي: PPR glyc = PPR طفل - PPR التركيب المعادلة 2 هنا، PPR TOT = ECAR طفل / BP المعادلة 3 حيث ECAR = معدل خارج الخلية تحمض (ميل / دقيقة)، وBP = طاقة التخزين المؤقت (ميل / بمول H + في 7 ميكرولتر)، في حين PPR التركيب = (10 درجة الحموضة PK 1 / (1 ​​+ 10 درجة الحموضة PK 1)) (ماكس H + / O 2) (OCR طفل - OCR تعفن / MYX) المعادلة 4 حيث K 1 = المشترك ثابت توازن CO 2 ترطيب والتفكك إلى HCO 3 - + H +. ماكس H + / O 2 = عشرالبريد CO 2 تحمض -derived لتحول التمثيل الغذائي معين مثل أكسدة كاملة من الجلوكوز 6؛ OCR = معدل استهلاك الأكسجين (O 2 بمول / دقيقة)، وOCR تعفن / MYX = غير الميتوكوندريا OCR. المعادلة 4 يعزل الميتوكوندريا OCR بطرح أي OCR غير الميتوكوندريا (كما هو موضح OCR التي هي مقاومة للالميتوكوندريا التنفسي السموم روتينون وmyxothiazol) ويمثل الحد الأقصى للH + ولدت في O 2 المستهلكة لكل الركيزة (ماكس H + / O 2 ) (انظر 6)، وكذلك نسبة CO 2 مما أدى إلى H + في درجة الحرارة التجريبية ودرجة الحموضة (10 درجة الحموضة PK 1 / (1 ​​+ 10 درجة الحموضة PK 1). لأكسدة كاملة من الجلوكوز، والأكسجين الميتوكوندريا معدل استهلاك (OCR) يساوي بالضبط إلى نسبة CO 2 الإنتاج. وفي حجم فحص يقتصر قياس تدفق خارج الخلية، CO 2 المنتجاتد بواسطة التنفس لا يزال محاصرا في المتوسط ​​الفحص. ورطب معظم المحاصرين CO 2 إلى H 2 CO 3، التي تنأى ثم إلى HCO 3 - + H +. يبقى جزء صغير حل ولكن ليس رطب، وجزء آخر صغير هو رطب ولكن ليس فصلها، وفقا لما تمليه الديناميكا الحرارية التي كتبها ثابت التوازن جنبا إلى جنب من CO 2 ترطيب والتفكك إلى HCO 3 - + H + في درجة حرارة التجريبية (37 ° C) ودرجة الحموضة (~ 7.4). وبالتالي، فإن المعادلة كاملة لحساب PPR ز بطرح PPR التركيب من PPR طفل هو: PPR glyc = ECAR طفل / BP - (10 درجة الحموضة PK 1 / (1 ​​+ 10 درجة الحموضة PK 1)) (ماكس H + / O 2) (OCR طفل - OCR تعفن / MYX) المعادلة 5 أنان بهذه الطريقة، ومعدلات التنفس وتحلل، وكذلك ترتبط معدلات إنتاج ATP، ويمكن تحديدها كميا من قياسات مباشرة (استهلاك الأوكسجين، وتحمض خارج الخلية، وقدرة التخزين المؤقت) والاستيراد أو حساب القيم الأخرى المطلوبة (H + / O 2 ، P / O، والتوازن K ثابت 1) 6. التجربة الموصوفة هنا تتوسع على التقنيات القياسية لاستخدام التمويه محلل خارج الخلية مثل فرس البحر XF24 10،11. لصيغ قياس تدفق خارج الخلية الأخرى (على سبيل المثال، XF ه 96، أو XFP)، ينبغي تحجيمها كافة وحدات التخزين أدناه بشكل مناسب. قوة التخزين المؤقت للفحص المتوسطة يمكن أن تقاس بناء منحنى القياسية إما مباشرة في منصة تدفق خارج الخلية أو بشكل منفصل باستخدام مسبار درجة الحموضة معايرة. هنا، يتم إعطاء ثلاثة خيارات لقياس التخزين المؤقت من خارج الخلية تدفق المتوسطة الفحص، بما في ذلك استخدام جميع injectiعلى منافذ للمحلل تدفق خارج الخلية مع عينة الآبار خالية من الخلايا، أو فقط باستخدام آخر ميناء حقن في الآبار التي تحتوي على الخلية (الجزء 1) أو باستخدام قياس درجة الحموضة الخارجي (القسم 2). انظر جدول المرفق للحصول على الحسابات الكاملة للبيانات سبيل المثال. لقياس قوة التخزين المؤقت باستخدام القدرة على الكشف عن درجة الحموضة الصك تدفق خارج الخلية، فمن الأكثر أمانا لاستخدام الآبار خالية من الخلايا لتقليل التباين إشارة. ومع ذلك، في الخطأ، لا يوجد فرق إحصائي بين (لا تظهر البيانات) والآبار عند تنفيذ هذا القياس التي تحتوي على الخلايا خالية من الخلايا. ملاحظة: الاختلاف هو موضح في الخطوة 1.7 تحمل ميزة يمثل أي تغييرات محتملة على التخزين المؤقت التي يمنحها المركبات المضافة أو بسبب وجود خلايا، مع الحرمان من إشارة ضجيج. لكن، وكما ذكر أعلاه، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في السلطة التخزين المؤقت المحسوبة بين تصميم خالية من الخلايا هو مبين في الجدول 1 وتصميم بعد تجربة في الجدول 2 تحت ظروف تجريبية موضح هنا. بالإضافة إلى ذلك، على نطاقات ΔpH الصغيرة (&lt;0.4 وحدة؛ تجريبيا أفضل يقتصر على 0.2 وحدة)، المنحدر الخطي الحصول عليها عن طريق التآمر Δ ميلا في الساعة / بمول H + يقارب نحو كاف علاقة لوغاريتمية بين ΔpH و[H +]. لذا المنحدر من هذا المنحنى القياسي يمثل السلطة التخزين المؤقت من المتوسط ​​فحص تحت الاختبار في درجة الحموضة / نانومول H + في 7 ميكرولتر، أو ميلا في الساعة / بمول H + في 7 ميكرولتر. ونحن نوصي زيادة قوة التخزين المؤقت متوسطة الحجم أو تقليل كثافة الخلايا للعينات التي تتجاوز تغيير وحدة 0.2 درجة الحموضة خلال فترة القياس. ويمكن أيضا أن انخفض قياس الوقت، ولكن هذا قد يقصر من معدل تحمض حالة مستقرة وإدخال خطأ في حساب المعدل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> ويبين الشكل (2) والبيانات الأولية لتجربة نموذجية. استخدمت مشاركة 10 نقاط القياس من تسجيل نقطة إلى نقطة على حد سواء OCR ودرجة الحموضة (مظللة أشرطة عمودية) عن الحسابات. المخاوف الأولية التي من شأنها أن متوسط ​​قيمة (قياس نقطة الوسط) من كل دورة الفحص لا توفر القرار كاف من معدل حسابا دقيقا، لا سيما ويبدو أن فارق طفيف بين الجمع الميناء وثابت معدل تحمض الدولة، ولم تنقلها من هناك، لأن هذا لا يبدو أن تسهم إسهاما كبيرا في خطأ في الحساب (لا يظهر). بدلا من ذلك، إذا تم إدخال قدرات التخزين المؤقت الصحيحة أثناء الإعداد التجريبية، طاعون المجترات الصغيرة يمكن قراءتها مباشرة من قراءات جمع البيانات الصك عن طريق عرض الإخراج PPR في البرنامج أداة أو في شكل PC-المتوافقة المتاحة باعتبارها واحدة من إعدادات إخراج البيانات. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. آثار تدفق خارج الخلية التمثيلية للO 2 و H +. OCR ودرجة الحموضة يتتبع للتجربة سبيل المثال في الجدول رقم 5، التي تحتوي على 10 ملي الجلوكوز في بداية الفحص. وكان ميناء D تركيزات حمض الهيدروكلوريك مختلفة لمعايرة قوة التخزين المؤقت (لا يظهر في هذه آثار متوسط). بيانات من نشر السابق 6. تمثل كل نقطة يعني ± SEM من ن = 8 مكررات البيولوجية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> تحليل البيانات من نتائج ممثلة باستخدام جداول البيانات المبينة في الجدول 6 وقدمت كمرفق، يمكن إدخال قيم البيانات من الآبار الفردية في الأعمدة تظهر مع رؤوس صفراء. جميع الأعمدة الستة ل<html> يتم احتساب حق من هذه الإدخالات. على سبيل المثال في الجدول 6 يبين حسابات PPR التركيب وPPR glyc باستخدام ECAR والبيانات OCR من الآبار الفردية للظروف المحلية مع أو بدون الجلوكوز وأضاف، قبل أن ميناء A إضافة أوليغوميسين. وبلغ متوسط ​​مكررات التقنية على كل المستحضرات البيولوجية عادة لإعطاء قيم واحدة من المخرجات في الأعمدة الأربعة الأخيرة، ثم وبلغ متوسط ​​البيانات من المستحضرات البيولوجية المختلفة مع انتشار المناسب الإحصاءات خطأ في BP وهذه القيم الأربع. <img alt="الجدول 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> الجدول 6. حساب الجهاز التنفسي وتحمض حال السكر. أعمدة رأسية في الأصفر تشير القيم إدخالها من حساب (على سبيل المثال، BP، ماكس H + / O 2)، أو من جمع البيانات (على سبيل المثال، طفل ECAR، OCR).<html> ملاحظة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول. | <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول كما جداول البيانات إكسل .</a> مساهمات تحلل والتنفس لPPR بعد التصحيح ويبين الشكل 3 إخراج رسومي للبيانات محسوبة كما في الجدول رقم 6 لمعدلات الأم من تحمض حال السكر والجهاز التنفسي، والمعدلات التالية أوليغوميسين إضافة (ميناء A)، والمعدلات التالية FCCP إضافة (بورت B). وتبين هذه البيانات بوضوح كيف أن نسب التنفسي وحال السكر تغيير تحمض مع اختيار الركيزة (الجلوكوز مقابل التحكم (CTL) مع أي المضافة) ومع الوضع الميتوكوندريا (وظيفة الأم مقابل وظيفة غيرت دواء). &quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> الشكل 3. معدل إنتاج بروتون (PPR) من مصادر حال السكر وأمراض الجهاز التنفسي. PPR من التنفس (الأجزاء المفتوحة) وتحلل (أجزاء شغل) من الخلايا C2C12 حسابها باستخدام المعادلة 5 مع الجلوكوز وأضاف (ثلاثة أشرطة اليسرى) أو بدون الجلوكوز المضافة (ثلاثة أشرطة اليمنى). بيانات من 6. تمثل جميع البيانات يعني ± SEM من ن = 8 مكررات البيولوجية.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate at JoVE.com

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K Views.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Video: Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

وهناك طريقة عالية الإنتاجية لقياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران وإدراكا

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

التحليل الكمي لمعدل نمو النيدولانات Aspergillus باستخدام المجهر الحي والبرمجيات مفتوحة المصدر

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...