هذه الطريقة تسمح لتحديد الأيض الخلية القاتلة الطبيعية. معلمة رئيسية في التنشيط من خلال قياس استهلاك الأكسجين والتغيرات في درجة اله pH في الوسط خارج الخلية. وميزة محلل تدفق خارج الخلية هو أنه مؤتمت بالكامل وقادرة على اختبار ما يصل إلى 92 عينة في الوقت الحقيقي مع كميات منخفضة من الخلايا.
وبالتالي السماح لشاشات عالية الإنتاجية. طريقة صالحة لتحديد تحلل السكر والتنفس في الخلايا غير سكي مهم جدا في العيادة. منذ هناك العديد من الأمراض بما في ذلك السمنة والسرطان حيث يتم استقلاب الخلايا غير صحيح.
تبدأ الأنابيب 20 ملليلتر من وسيط الفصل اللمفاوي في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. مع الحفاظ على أنبوب في زاوية 30 درجة، بلطف ماصة 20 ملليلتر من الدم على المتوسط. خلق واجهة واضحة وواضحة المعالم بين السائلين.
الطرد المركزي الأنابيب لمدة 25 دقيقة في 1000 مرات G.ثم بعناية إخراج الأنابيب من الطرد المركزي ووضعها في رف. تحقق من وجود طبقة واضحة من الخلايا في الواجهة بين LSM والبلازما. استلهم بلطف طبقة الخلية أحادية النوى مع ماصة بلاستيكية 10 ملليلتر ووضعها في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر.
اغسل الخلايا أحادية النوى مرتين مع 45 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. وطاردة مركزية عند 800 مرة جي لمدة خمس دقائق لعزل الخلايا أو الاحتقانات القاتلة الطبيعية، عد البحار PVM وإعادة توزيعها في العازلة العازلة NK الفصل في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثامنة لكل ملليلتر.
ثم نقل 10 ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. أضف 500 ميكرولترات من NK خلية عزل الجسم المضاد مزيج. و 10 ميكرولترات من المضادة للأقراص المضغوطة ثلاثة مزيج الأجسام المضادة العزلة الإيجابية إلى PBMCs.
واحتضانهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. Vortex الخرز المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد إلى PBMCs والأجسام المضادة. ثم احتضان MIGS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اثارة عرضية.
إضافة 35 ملليلتر من العازلة العزلة NK ووضع الأنبوب على المغناطيس لمدة 15 دقيقة. جمع بعناية مُندفع مع ماصات بلاستيكية 50 ملليلتر دون لمس الجانبين أو الجزء السفلي من الأنبوب. عد الخلايا والطرد المركزي في 800 مرة G لمدة خمس دقائق.
لتحفيز الخلايا NK مع ممر قابل للذوبان 15، resuspend 750، 000 الخلايا في 100 ميكرولترات من IMDM التي تحتوي على 10٪ HS في بئر من 96 لوحة جيدا. تمييع ممر الإنسان 15 إلى ميكروغرام واحد لكل ملليلتر في IMDM و HS 10٪. وإضافة 100 ميكرولترات من الممر البشري المخفف 15 إلى الخلايا.
إصلاح عينة التحكم مع الخلايا غير المُحَذَّرة ووضع كلتا العينتين في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تحفيز الخلايا لمدة 48 ساعة ثم إجراء فحص تدفق خارج الخلية. في اليوم السابق للتجربة، قم بتشغيل المحلل واتركه يسخّن حتى 37 درجة مئوية.
افتح حزمة خرطوشة الرقابة وافصل الكارتريدج عن لوحة الأدوات المساعدة. ثم إضافة 200 ميكرولترات من حل calibrant إلى كل بئر من لوحة فائدة. ووضع خرطوشة المركزية مرة أخرى في التأكد من أن أجهزة الاستشعار مغمورة تماما.
للحصول على أفضل النتائج احتضان خرطوشة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون. الذي مرّر بشكل صحيح. لإعداد شفرة لاصقة مغلفة، ماصة 25 ميكرولترات من محلول لاصق الخلية إلى كل بئر من لوحة.
وحتضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم إزالة الحل وغسل لوحة مرتين مع 200 ميكرولترات من الماء المعقم في البئر. إبقاء لوحة مفتوحة لمدة 15 دقيقة داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية للسماح للآبار لتجف.
جهاز طرد مركزي خلايا NK المعزولة سابقا إضافة 200 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم إزالة عظمى وغسل الخلايا في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا الدافئ متوسطة أو تحلل الإجهاد المتوسط اختبار المتوسط. بيليه الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليقها إلى تركيز الخلية المفضلة في نفس الوسط.
وضع 180 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر في لوحة المقايسة. استخدام الآبار A واحد، A 12 H واحد وH 12 وآبار التحكم لتصحيح الخلفية. إضافة 180 ميكرولترات من المتوسطة المقايسة لهذه الآبار احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون.
جهاز طرد مركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم مراقبة الخلايا تحت المجهر للتأكد من أنها تشكل طبقة مانو في الجزء السفلي من البئر. احتضان الخلايا لمدة 25 دقيقة أخرى.
حلول العمل الحارة إلى 37 درجة مئوية. وتعديلها إلى 7.4 إلى 7.4 إذا لزم الأمر. قم بتحميل المركبات التي تم إعدادها مسبقًا لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا أو لاختبار إجهاد تحلل التحلل في لوحات A و B و C لخراطيش الرقابة المرطبة ضع خرطوشة الرقابة المحملة مرة أخرى في الحاضنة أثناء إعداد البرنامج.
لإعداد بروتوكول تحليل التدفق خارج الخلية، افتح البرنامج واستخدم تعريفات المجموعة لتحديد شروط المعالجة المسبقة. استخدم علامة التبويب خريطة اللوحة للإشارة إلى مجموعات الآبار التي لها شروط مشابهة تشير أيضًا إلى تصحيح الخلفية والآبار الفارغة. ثم قم بتعيين البرنامج في علامة التبويب البروتوكولات.
بدء تشغيل البرنامج ووضع خرطوشة الاستشعار ولوحة فائدة على الدرج. بعد خطوة المعايرة، استبدل لوحة الفرجان لصفيحة المقايسة بالخلايا المرفقة. بمجرد الانتهاء من تشغيل، واسترداد البيانات وتحليلها.
من أجل تقييم نقاء وديمية خلايا NK. كانت تلطخت الصغيرة أليك واتس من 15 بحار PVM وعزلة NK الخلية السكان وتحليلها من قبل تدفق cytometry. تم تأسيس نقاء المحتوى خلية NK بواسطة البقاء المزدوج ضد CD ثلاثة و CD 56 أو NKP 46.
يتم عرض الكثير من معدل استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا لخلايا NK الإنسان هنا. كما هو متوقع أنا أرقام الخلية عرض قيم OCR أعلى. أرقام الخلايا ترتبط أيضا خطيا مع كمية الحمض النووي أو البروتين في البئر.
من ناحية أخرى كانت أعلى أرقام الخلايا لم يكن الأمثل. لأنه عند إضافة DNP ، تم استنفاد تركيز الأكسجين في البئر تمامًا في كل دورة. مما حال دون الحساب الدقيق لل OCR.
في خلايا NK الإنسان، تم العثور على 100 من الجرعات الدقيقة DNP لتكون الجرعة المثلى. تظهر هنا تجربة اختبار إجهاد ميتوكوندريا نموذجية مع 750, 000 خلايا NK لكل بئر. في هذا الاختبار Oligomycin يؤدي إلى انخفاض كبير في استهلاك الأكسجين.
وزيادة في ECAR. وهو ما يمثل التحول إلى تحلل والجهد للحفاظ على مستويات ATP الخلوية. تسبب تنشيط خلايا NK عن طريق الممر 15 في زيادة في استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا والتحمض خارج الخلية.
Basal Maximal و ATP ربط التنفس زاد ولكن ليس تسرب البروتون أو التنفس غير الميتوكوندريا. وعلاوة على ذلك، انخفض معدل OCR/ECA مما يشير إلى تحول إلى عملية التمثيل الغذائي في الغليكوليك بعد التحفيز IL 15. عند تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم جداً الحصول على مجموعة خلايا نقية وصحية لتحديد العدد الأمثل للخلايا و titrate تركيز غير غير قابل للتكميل.
