تم دعم المؤلفين وهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI منحة # R01CA172138 (لSBE).

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في جامعة تل أبيب. 1. بروتوكول الجرذ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب 2 فراشة 21 الإبر G. اختياريا، وإعداد 2 فراشة 21 G الإبر ذو حدين صريحا عن طريق تقديم حافة حادة من الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية: 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، مرقئ، ملقط الأسنان الأنسجة تعقيم بواسطة الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على وضع (الجاف) الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X) حل. استخدام في RT. 35 مل هو حجم الحد الأدنى اللازم للحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تيار heparinized برنامج تلفزيوني في خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة لتجنب فقاعات الهواء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من الرئتين وجمع MP-الكريات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. تأكيد القتل الرحيم التي وقف مراقبة التنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على وقف التنفس، وفتح على الفور تجاويف البريتوني والصدر باستخدام مقص العقيمة وملقط الأسنان الأنسجة. إجراء شق البطن خط الوسط على طول البطن وصولا إلى عملية الخنجري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع القص باستخدام ملقط، وقطع بحذر القفص الصدري على كلا الجانبين، دون ثقب أي عضو داخلي أو الأوعية الدموية الكبيرة. المشبك مرقئ على القص، وrostrally أضعاف القفص الصدري لفضح مجمع القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود إبرة فراشة في البطين الأيمن من القلب، وخلال حوالي دقيقة وجمع حجم القصوى من الدم إلى حقنة (~ 6 مل من 250 غرام الحيوان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك الوريد الأجوف مع مرقئ لتجنب نضح الوراء الكبد (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد إبرة فراشة داخل البطين الأيمن في حين استبدال حقنة تحتوي على الدم مع أنبوب تدفق عمضخة eristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود إبرة فراشة الثانية متصلة حقنة حصاد 5 مل إلى البطين الأيسر، وتجنب اختراق الحاجز بين البطينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 5 مل / دقيقة، وجمع بلطف في حقنة وملليلتر الأولى من الإرواء أن تكون ملوثة بالدماء. تستمر حتى يتحول لون سائل الإرواء من الظلام إلى شاحب اللون الأحمر. (تجاهل perfuste الملوثة بالدم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون وقف ضخ تحوي استبدال بسرعة حصاد حقنة 5 مل مع حقنة 20 مل الحصاد وجمع 20 مل من سائل الإرواء الرئة يعمل بسرعة أعلى من نضح (ما يصل إلى 7 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، مع تجنب تشكيل فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف تدفق المضخة تحوي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات البيض استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السوائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل. كرر هذه الخطوة مرتين. استخدام برنامج تلفزيوني أو المتوسطة يعتمد على يترتب على ذلك من استخدام العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الخلايا إلى التركيز المطلوب، على أساس استخدام عينة (نظام مراقبة الأصول الميدانية، PCR، وما إلى ذلك). </li></ol></li></ol> 2. بروتوكول ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب 2 فراشة 25 الإبر G. اختياريا، وإعداد 2 ذو حدين صريحا فراشة 25 G الإبر عن طريق تقديم حافة حادة من الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية: 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، مرقئ، ملقط الأسنان الأنسجة تعقيم بواسطة الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على وضع (الجاف) الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين في مل من محلول برنامج تلفزيوني 1X. استخدام في RT. 25 مل هو حجم الحد الأدنى اللازم للحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعزيز بنية الشعأنا heparinized برنامج تلفزيوني في خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة لتجنب فقاعات الهواء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من الرئتين وجمع MP-الكريات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. تأكيد القتل الرحيم التي وقف مراقبة التنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على وقف التنفس، وفتح على الفور تجاويف البريتوني والصدر باستخدام مقص العقيمة وملقط الأسنان الأنسجة. إجراء شق البطن خط الوسط على طول البطن وصولا إلى عملية الخنجري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع القص باستخدام ملقط، وقطع بحذر القفص الصدري على كلا الجانبين، دون ثقب أي عضو داخلي أو الأوعية الدموية الكبيرة. المشبك مرقئ على القص، وrostrally أضعاف القفص الصدري لفضح مجمع القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك الوريد الأجوف مع مرقئ لتجنب نضح الوراء الكبد (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود إبرة فراشة متصلا أنابيب تدفق المضخة تحوي في فين الصحيحtricle من القلب، وإبرة فراشة الثانية متصلة حقنة حصاد 2 مل إلى البطين الأيسر من القلب، avoidingpenetration من الحاجز بين البطينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة لسرعة حوالي 2 مل / دقيقة وجمع ملليلتر الأولى من الإرواء الملوثة الدم في حقنة الحصاد حتى يتحول سائل الإرواء من الظلام إلى شاحب اللون الأحمر (تجاهل perfuste الملوثة بالدم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون وقف ضخ تحوي استبدال بسرعة حصاد حقنة 2 مل مع حقنة 10 مل الحصاد وجمع 10 مل من سائل الإرواء الرئة يعمل بسرعة أعلى من نضح (تصل إلى 4 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، مع تجنب تشكيل فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف تدفق المضخة تحوي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات البيض استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السوائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. استخدام برنامج تلفزيوني أو المتوسطة يعتمد على يترتب على ذلك من استخدام العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني أو المتوسطة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح السوائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الخلايا إلى التركيز المطلوب، على أساس استخدام عينة (نظام مراقبة الأصول الميدانية، PCR، وما إلى ذلك). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginated+pool.">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li><li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics.">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats:+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells.">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li><li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC:+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis.">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li><li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy.">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li><li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice.">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li><li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis:+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor.">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li><li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia.">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li><li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+role+for+marginating-pulmonary+and+marginating-hepatic+NK+cells+in+cancer+anti-metastatic+surveillance+and+in+immunotherapy.">A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy.</a> , (2014).</li><li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12).">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الطريقة المعروضة هنا تمكن حصاد انتقائي وتدرس من السكان فريدة من MP-الكريات البيض. مقارنة تعميم أو الكريات البيضاء الطحال، ويتميز سكان النائب كتبها متميزه وتكوينها من القطعان الكريات البيض، ومستويات أعلى تفعيل، وإطلاق سراح أعلى من مختلف السيتوكينات، ومستويات مرنا أ?...

الكريات البيض في الانضمام إلى الشعيرات الدموية في الرئتين (أي marginating الرئوي (MP) الكريات البيض) عرضت 1 لعرض تكوين الكريات البيض متميزة وفريدة من نوعها النشاط بالمقارنة مع الكريات البيض من المقصورات المناعية الأخرى (على سبيل المثال، تداول والطحال ونخاع العظام) 2- 4. على سبيل المثال، معرض MP-الكريات البيضاء أعلى القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا السمية الخلوية ضد الخلايا السرطانية المختلفة، بالمقارنة مع تعميم والطحال الخلايا القاتلة الطبيعية، وكذلك مستويات متباينة الرنا المرسال (مرنا)، وزيادة إفراز السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات. ويختلف تكوين خلايا أيضا من الكريات البيض المتداولة كما MP-الكريات البيض لديهم نسبة أعلى من الفطرية مناعة / التكيف مقارنة تعميم الكريات البيض (50٪ مقابل 30٪ على التوالي). الهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تمكين الحصاد الانتقائي للMP-الكريات البيض، من أجل دراسة هذه المقصورة المناعة هامة وفريدة (السكان الخلية)، وelucidate تأثير مختلف التلاعب (على سبيل المثال، تنشيط جهاز المناعة) على هذه الخلايا المحددة. لفهم أهمية هذه الفئة من السكان فريدة من نوعها، من المهم أن نلاحظ أن نظام المناعة يمكن التحكم تعميم الخلايا السرطانية، micrometastases، والمرض المتبقية من خلال وظائف في الجسم الحي من مناعة خلوية (CMI). هذه القدرة هو واضح على الرغم من فشل سابقة من الجهاز المناعي للسيطرة على الورم الرئيسي، وبدعم من وافرة في دليل المجراة في مرضى السرطان والنماذج الحيوانية 5. الأهم من ذلك، هذه النتائج غالبا ما تكون متناسقة مع في المختبر، وبحكم الدراسات المجراة، التي تفيد أن معظم الخلايا السرطانية ذاتي مقاومة لسمية الخلايا من خلال تعميم الكريات البيض في عينات الدم من البشر والحيوانات (التي تقاس فحوصات السمية الخلوية) 6،7. ويمكن أن يعزى هذا التفاوت إلى وجود في الجسم الحي من السكان الكريات البيض متميزة، مثل السالفةالمذكور السكان الكريات البيض النائب، وعلى وجه التحديد في من السكان من الخلايا القاتلة الطبيعية تنشيط 3. في الواقع، عرضت خلايا الورم مسانج (MADB106)، التي وجدت لتكون مقاومة للتعميم والكريات البيض الطحال، إلى أن هي lysed الخلايا MP-NK 3،8. وبالتالي، يتم التحكم في &quot;المقاومة NK &#39;يزعم خلايا MADB106 أن metastasize إلى الرئتين من fischer344 (F344) الفئران بخلايا MP-NK، ولكن ليس من خلال تعميم أو الخلايا القاتلة الطبيعية الطحال، والتي عادة دراستها نظرا سهولة وصولها. النقاء ونشطة MP-الكريات البيض لا يمكن الوصول إليها من خلال أساليب الحصاد القياسية من الكريات البيض من الرئتين، والتي تقوم على طحن أنسجة الرئة أو التدهور البيولوجي 9. نهجنا واثنين من المزايا الرئيسية مقارنة بالنهج معالجة الأنسجة. أولا، النهج نضح يحصد انتقائي MP-الكريات البيض، التي تفصلها عن غيرها من الخلايا التي تنشأ من متني الرئة، بيني، وcompar النزلة السنخtments. ثانيا، تقنية نضح أفضل تحافظ على سلامة وبيئة الفسيولوجية MP-الكريات البيض، على عكس الطحن والمعالجة البيولوجية النهج التي تتلف الخلايا، يغير التشكل، وتحفز إنتاج وإطلاق العوامل المختلفة التي تعدل النشاط المناعي، وعلى وجه التحديد قمع NK السمسة 10. الرئتين هي جهاز هدفا رئيسيا لورم خبيث من السرطان والأمراض المعدية المختلفة. كل الخلايا الخبيثة المنتشرة والخلايا المصابة تمر من خلال الشعيرات الدموية في الرئة، حيث أنها تحتاج إلى تشوه والتفاعل مع الخلايا البطانية الشعرية والكريات البيض المقيم. في ظل هذه الظروف، والخلايا المنتشرة يمكن أن تستهدف بسهولة عن طريق MP-الكريات البيض المقيم. وهكذا يبدو من المفيد من الناحية البيولوجية أن يكون الكريات البيض تفعيلها في هذا الحيز المناعة، وأنه من المهم دراسة هذه فريدة من نوعها MP-السكان في إعدادات البيولوجية، التجريبية، وسريرية مختلفة. ومن الجدير بالذكر أن سيتفعيل stemic المناعي عن طريق مختلف، استجابة معدلات البيولوجية (على سبيل المثال، حمض polyinosinic-polycytidylic (بولي الأول: C) أو oligodeoxynucleotides نوع C الدليل السياسي الشامل (الدليل السياسي الشامل-C ODN)) وقد ثبت أن تفعيل MP-الكريات البيض أكثر من تعميم الكريات البيضاء 3، 8،11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4&quot;</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selective harvesting of marginating-pulmonary leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

المعرض MP-المقصورة مختلف تكوين الكريات البيض فرعية مقارنة تعميم الكريات البيض. باستخدام تحليل التدفق الخلوي، وقد تم تحديد الفئات السكانية الكريات البيض وكميا لتحديد خصائص تكوين كلا تعميم والكريات البيض النائب. وقد تم تحديد المحببة والخلايا الليمف?...

Watch this Scientific Journal Video about Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes at JoVE.com

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

حصاد الانتقائي للMarginating-الرئوية الكريات البيضاء

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.8K Views.  Tel-Aviv University. Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Video: Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

تخصيب خالية من تسمية العَدلات من إفراز مجرى الهواء المستمدة من المريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Distinguishing Intrapulmonary Immune Cells from Intravascular Immune Cell Populations: the Intrajugular Approach

Circadian rhythms refer to oscillations in various biological process that occur with a 24 h period. At the molecular level, such rhythms are comprised of a web of transcriptional-translational feedback loops (TTFL) of core clock genes. Individual tissues and organ systems, including the immune system, have their own clock. In the systemic circulation, various members of the CD45+ population oscillate across the day; however, many of these rhythms are not identical or even similar in the tissue resident CD45+ leukocyte population. When studying the role of circadian regulation of lung inflammation, CD45+ within the lung may need to be investigated. However, despite optimized perfusion methods, leukocytes trapped from the circulation persist in the lungs. The goal in designing this protocol was to distinguish between intravascular and intraparenchymal leukocytes. Towards this end, mice are injected with a fluorescent tagged CD45 antibody intrajugularly shortly before lung harvest. Thereafter, the lung is digested using a customized lung digestion technique to obtain a single cell suspension. The sample is stained for the regular panel of antibodies for intraparenchymal immune cells (including another CD45 antibody). Flowcytometric analyses shows a clear elucidation of the populations. Thus, the method of labeling and defining intrapulmonary CD45+ cells will be particularly important where the behavior of intrapulmonary and circulating immune cells are numerically and functionally distinct.

The aim of the current study is to describe a protocol for differentiating between intravascular and intraparenchymal immune cells in studies of lung inflammation. We use an intrajugular injection of a fluorescent tagged antibody prior to lung harvest. Further, we use an inflation-based lung digestion process to improve the yield of leukocytes from the lung.

Circadian rhythms refer to oscillations in various biological process that occur with a 24 h period. At the molecular level, such rhythms are comprised of ...

Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further diagnose and manage PH, patients undergo repeated right heart catheterizations (RHC) wherein a Swan-Ganz catheter is advanced into a branch of the pulmonary artery and a balloon is inflated to wedge the catheter tip. This article illustrates a protocol whereby pulmonary artery endothelial cells (PAECs) may be harvested from the balloon tips of Swan-Ganz catheters after RHC, and purified with an anti- CD146 affinity column technique to purify putative PAECs. These cells might be used to provide an in situ snapshot of the biological state of the pulmonary vasculature endothelium to complement hemodynamic measurements obtained during RHC. Harvested and purified PAECs may be used for either cell culture or for subsequent analytical assays such as flow cytometery.

This protocol describes the removal and purification of pulmonary artery endothelial cells (PAECs) that adhere to the balloon tips of Swan-Ganz catheters while they are wedged in the pulmonary artery during right heart catheterization and remain adherent to the deflated balloon following removal from the patient's body.

حصاد خلايا بطانية من تلميحات البالون من سوان-غانز القسطرة بعد قسطرة القلب الصحيح

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further ...

Medicine

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

تحليل التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية للرئة الفخذية

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

<meta charset="utf8"></head><body>عزل الخلايا المناعية وغير المناعية من رئتي الفئران لقياس التدفق الخلوي

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>عزل مجموعات الخلايا النخاعية والظهارية الحية عن رئة الفأر

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

عزل مجموعات الخلايا النخاعية والظهارية الحية عن رئة الفأر

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

إنشاء مزارع LLEC في المختبر باستخدام اختيار الخلايا المغناطيسية

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

الحصاد والزراعة الأولية للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

حصاد الانتقائي للMarginating-الرئوية الكريات البيضاء

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

تخصيب خالية من تسمية العَدلات من إفراز مجرى الهواء المستمدة من المريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي

Distinguishing Intrapulmonary Immune Cells from Intravascular Immune Cell Populations: the Intrajugular Approach

حصاد خلايا بطانية من تلميحات البالون من سوان-غانز القسطرة بعد قسطرة القلب الصحيح

تحليل التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية للرئة الفخذية

عزل مجموعات الخلايا النخاعية والظهارية الحية عن رئة الفأر

عزل مجموعات الخلايا النخاعية والظهارية الحية عن رئة الفأر

عزل مجموعات الخلايا النخاعية والظهارية الحية عن رئة الفأر

الحصاد والزراعة الأولية للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal