Name: selective harvesting of marginating-pulmonary leukocytes
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes at JoVE.com

המחברים ועבודה זו נתמכו # מענק NIH / NCI R01CA172138 (כדי SBE).

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב. 1. עכברוש פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים 2 פרפר 21 מחטים G. לחלופין, להכין 2 מחטים בוטות פיפיות פרפר 21 G על ידי הגשת הקצה החד של המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים: 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, hemostat, מלקחי שן-רקמות מעוקרות ידי חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכת הגדרה (יבשה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ&quot;ל) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין לכל מ&quot;ל של בופר פוספט פתרון (1x PBS). השתמש ב RT. 35 מיליליטר הוא הנפח המינימאלי הדרוש לכל בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרים heparinized PBS לתוך קווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר כדי למנוע בועות אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף של הריאות והגבייה-לויקוציטים MP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. אשר המתת חסד על ידי הפסקת נשימה ניטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפסקת נשימה, לפתוח לאלתר את החללים הצפק ובחזה באמצעות מספרי סטרילית מלקחי שן-רקמה. לבצע חתך בבטן קו האמצע לאורך הבטן עד לתהליך xiphoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החזה באמצעות המלקחיים, חיתוך כלוב צלעות בזהירות משני הצדדים, ללא ניקוב כל איבר פנימי או כלי דם גדולים. קלאמפ hemostat על עצם החזה, rostrally לקפל את בית החזה כדי לחשוף את מורכבות לב-ריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר לתוך החדר ימני של הלב, ובתוך כ דק לאסוף את הנפח המקסימאלי של דם לתוך מזרק (~ 6 מיליליטר מבעל חי 250 גרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הווריד הנבוב עם hemostat להימנע זלוף לאחור של הכבד (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מחט פרפר בתוך החדר הימני תוך החלפת מזרק המכיל את הדם עם צינור יצוא של pמשאבת eristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר שני מחובר מזרק קציר 5 מ&quot;ל לתוך החדר השמאלי, הימנעות חדירה של מחיצת האף interventricular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 5 מ&quot;ל / דקה בעדינות לאסוף לתוך המזרק מיליליטר הראשון של perfusate כי הם מזוהמים עם דם. המשך עד שהצבע perfusate פונה מכהה אדום חיוור. (מחק את perfuste דם מזוהם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא הפסקת המשאבה peristaltic, במהירות להחליף את המזרק קציר 5 מ&quot;ל עם מזרק קציר 20 מ&quot;ל ולאסוף 20 מ&quot;ל של perfusate ריאות העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 7 mL / min). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, תוך הימנעות היווצרות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את הזרימה של המשאבה peristaltic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב g 400 ×. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 10 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. חזור על פעולה זו פעמיים. שימוש PBS או בינוני תלוי בשימוש הסוגר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את התאים לריכוז הרצוי, מבוסס על השימוש במדגם (FACS, PCR, וכו &#39;). </li></ol></li></ol> 2. עכבר פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים 2 פרפר 25 מחטים G. לחלופין, להכין 2 מחטים בוטות פיפיות פרפר 25 G על ידי הגשת הקצה החד של המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים: 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, hemostat, מלקחי שן-רקמות מעוקרות ידי חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכת הגדרה (יבשה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ&quot;ל) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין לכל מ&quot;ל של תמיסת 1x PBS. השתמש ב RT. 25 מיליליטר הוא הנפח המינימאלי הדרוש לכל בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> streאני heparinized PBS לתוך קווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר כדי למנוע בועות אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף של הריאות והגבייה-לויקוציטים MP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. אשר המתת חסד על ידי הפסקת נשימה ניטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפסקת נשימה, לפתוח לאלתר את החללים הצפק ובחזה באמצעות מספרי סטרילית מלקחי שן-רקמה. לבצע חתך בבטן קו האמצע לאורך הבטן עד לתהליך xiphoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את החזה באמצעות המלקחיים, חיתוך כלוב צלעות בזהירות משני הצדדים, ללא ניקוב כל איבר פנימי או כלי דם גדולים. קלאמפ hemostat על עצם החזה, rostrally לקפל את בית החזה כדי לחשוף את מורכבות לב-ריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הווריד הנבוב עם hemostat להימנע זלוף לאחור של הכבד (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר המחובר לצינור היצוא של משאבת peristaltic לתוך ven התקיןtricle של הלב, וכן מחט פרפר שני מחובר מזרק קציר 2 מ&quot;ל לתוך החדר השמאלי של הלב, avoidingpenetration של מחיצת האף interventricular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה למהירות של כ 2 מ&quot;ל / דקה לאסוף את מיליליטר הראשון של perfusate דם מזוהמים לתוך המזרק קציר עד perfusate פונה מכהה אדום חיוור (מחק את perfuste דם מזוהם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא הפסקת המשאבה peristaltic, במהירות להחליף את המזרק קציר 2 מ&quot;ל עם מזרק קציר 10 מ&quot;ל ולאסוף 10 מ&quot;ל של perfusate ריאות העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 4 מ&quot;ל / דק &#39;). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, תוך הימנעות היווצרות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את הזרימה של המשאבה peristaltic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב g 400 ×. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. שימוש PBS או בינוני תלוי בשימוש הסוגר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS או בינוני, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, לשאוב את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את התאים לריכוז הרצוי, מבוסס על השימוש במדגם (FACS, PCR, וכו &#39;). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginated+pool.">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li><li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics.">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats:+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells.">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li><li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC:+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis.">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li><li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy.">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li><li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice.">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li><li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis:+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor.">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li><li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia.">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li><li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+role+for+marginating-pulmonary+and+marginating-hepatic+NK+cells+in+cancer+anti-metastatic+surveillance+and+in+immunotherapy.">A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy.</a> , (2014).</li><li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12).">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של לויקוציטים MP. לעומת מחזורי או לויקוציטים טחול, אוכלוסיית MP מאופיינת רכב מובהק של תת-אוכלוסיות לויקוציטים, רמות הפעלה גבוהות, שחרור גבוה של ציטוקינים שונים, ורמות גבוהות יותר של mRNA תומך ציטוקינ?...

לויקוציטים דבקים בנימי הריאות (כלומר, marginating-ריאתי (MP) לויקוציטים) 1 הוצג להציג רכב לויקוציטים ברור פעילות ייחודית לעומת לויקוציטים מ תאים חיסוניים אחרים (למשל, מחזור, טחול, מח עצם) 2- 4. לדוגמה, MP-לויקוציטים התערוכה גבוה הרג טבעיים (NK) cytotoxicity התאים מפני תאים סרטניים שונים, לעומת מחזורי הטחול תאי NK, כמו גם RNA שליח הבדיל (mRNA) רמות הפרשה מוגברת של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים. הרכב של תאים הוא מובחן גם לויקוציטים במחזור כמו שיש MP-לויקוציטים יחס גבוה יותר של חסינות אדפטיבית / מולד לעומת לויקוציטים במחזור (50% לעומת 30%, בהתאמה). מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של MP-לויקוציטים, כדי ללמוד תא החיסון חשוב וייחודי זה (אוכלוסיית תאים), וכדי elucidate השפעת מניפולציות שונות (למשל, הפעלה חיסונית) על תאים ספציפיים אלה. כדי להבין את המשמעות של אוכלוסייה ייחודית זו, חשוב לציין כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחלות שיורית באמצעות פונקציות vivo של חסינות בתיווך התא (CMI). יכולת זו באה לידי ביטוי למרות כישלון התקדים של מערכת החיסון על מנת לשלוט בגידול הראשוני, ונתמך על ידי מספיק ראיות vivo בחולי סרטן ומודלים של בעלי חי 5. חשוב לציין, הממצאים הללו הם לעתים קרובות עולה בקנה אחד עם במבחנה במחקרים vivo לשעבר, אשר מדווחים כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי לויקוציטים בדגימות דם מבני אדם ובעלי חיים (נמדד על ידי מבחני רעילות) 6,7. אי התאמה זו ניתן לייחס לקיומה in vivo של אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כגון שצויןאוכלוסייה לויקוציטים MP נזכרת, ו-האוכלוסייה שלה במיוחד של תאי NK מופעלים 3. ואכן, תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו להיות עמיד במחזור לויקוציטים טחול, הוצגו להיות lysed ידי תאי MP-NK 3,8. לפיכך, התאים MADB106 &#39;NK עמיד&#39; לכאורה כי גרורות לריאות של fischer344 (F344) חולדות נשלטים על ידי תאים MP-NK, אבל לא על ידי מחזורי או תאי NK הטחול, אשר בדרך כלל נלמדים נתון קלות הגישה שלהם. מטוהרים פעילים MP-לויקוציטים אינם נגישים באמצעות שיטות קציר רמה לויקוציטים מהריאות, אשר מבוססות על שחיקה רקמת ריאה או 9 שפלה ביולוגית. הגישה שלנו כוללת שני יתרונות מרכזיים לעומת גישות עיבוד רקמות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי יבול MP-לויקוציטים, תוך הפרדה תאים אחרים שמקורן parenchymal ריאות, ביניים, ו compar broncho-מכתשיםtments. שנית, טכניקת זלוף טוב יותר שומרת על השלמות ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MP, בניגוד שחיקה והעיבוד ביולוגי גישות הפוגעים בתאים, לשנות המורפולוגיה שלהם, ולגרום לייצור ושחרור של גורמים שונים כי לווסת את הפעילות חיסונית במיוחד לדכא NK cytotoxicity 10. הריאות הן איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטן ועבור מחלות זיהומיות שונות. כל התאים הממאירים במחזור התאים נגועים לעבור דרך נימי הריאות, בה הם צריכים לעוות ולתקשר עם תאי אנדותל נימים לויקוציטים תושב. בתנאים אלה, תאים במחזור יכולים להיות ממוקדים בקלות על ידי-לויקוציטים MP תושב. נראה, אם כן ביולוג יתרון יש לויקוציטים מופעלים בתא החיסון הזה, וזה חשוב ללמוד אוכלוסייה-MP הייחודית זאת בהגדרות ביולוגיות, ניסיוני, וקליניים שונים. ראוי לציין כי סאיההפעלה החיסונית stemic ידי-מכפילי ביולוגי-תגובה שונות (למשל, חומצה polyinosinic-polycytidylic (פולי לי: C) או מסוג C CPG oligodeoxynucleotides (CPG-C ODN)) הוכחו להפעיל MP-לויקוציטים יותר לויקוציטים במחזור 3, 8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4&quot;</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selective harvesting of marginating-pulmonary leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

תערוכת MP-תא קומפוזיצית משנה לויקוציטים שונה לעומת מחזורים לויקוציטים. באמצעות ניתוח תזרים cytometry, תת-אוכלוסיות לויקוציטים זוהו לכמת ולאפיין את הרכב של שני מחזורי לויקוציטים MP. גרנולוציטים ו לימפוציטים זוהו מבוסס על מחליקי קדימה והצד. בתוך לימפוציטי...

Watch this Scientific Journal Video about Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes at JoVE.com

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.8K Views.  Tel-Aviv University. Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Video: Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioengineering

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Distinguishing Intrapulmonary Immune Cells from Intravascular Immune Cell Populations: the Intrajugular Approach

Circadian rhythms refer to oscillations in various biological process that occur with a 24 h period. At the molecular level, such rhythms are comprised of a web of transcriptional-translational feedback loops (TTFL) of core clock genes. Individual tissues and organ systems, including the immune system, have their own clock. In the systemic circulation, various members of the CD45+ population oscillate across the day; however, many of these rhythms are not identical or even similar in the tissue resident CD45+ leukocyte population. When studying the role of circadian regulation of lung inflammation, CD45+ within the lung may need to be investigated. However, despite optimized perfusion methods, leukocytes trapped from the circulation persist in the lungs. The goal in designing this protocol was to distinguish between intravascular and intraparenchymal leukocytes. Towards this end, mice are injected with a fluorescent tagged CD45 antibody intrajugularly shortly before lung harvest. Thereafter, the lung is digested using a customized lung digestion technique to obtain a single cell suspension. The sample is stained for the regular panel of antibodies for intraparenchymal immune cells (including another CD45 antibody). Flowcytometric analyses shows a clear elucidation of the populations. Thus, the method of labeling and defining intrapulmonary CD45+ cells will be particularly important where the behavior of intrapulmonary and circulating immune cells are numerically and functionally distinct.

<meta charset="utf8"></head><body>הבחנה בין תאי חיסון תוך-ריאתיים לבין אוכלוסיות תאי חיסון תוך-וסקולריים: הגישה התוך-צווארית

The aim of the current study is to describe a protocol for differentiating between intravascular and intraparenchymal immune cells in studies of lung inflammation. We use an intrajugular injection of a fluorescent tagged antibody prior to lung harvest. Further, we use an inflation-based lung digestion process to improve the yield of leukocytes from the lung.

הבחנה בין תאי חיסון תוך-ריאתיים לבין אוכלוסיות תאי חיסון תוך-וסקולריים: הגישה התוך-צווארית

Circadian rhythms refer to oscillations in various biological process that occur with a 24 h period. At the molecular level, such rhythms are comprised of ...

Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further diagnose and manage PH, patients undergo repeated right heart catheterizations (RHC) wherein a Swan-Ganz catheter is advanced into a branch of the pulmonary artery and a balloon is inflated to wedge the catheter tip. This article illustrates a protocol whereby pulmonary artery endothelial cells (PAECs) may be harvested from the balloon tips of Swan-Ganz catheters after RHC, and purified with an anti- CD146 affinity column technique to purify putative PAECs. These cells might be used to provide an in situ snapshot of the biological state of the pulmonary vasculature endothelium to complement hemodynamic measurements obtained during RHC. Harvested and purified PAECs may be used for either cell culture or for subsequent analytical assays such as flow cytometery.

This protocol describes the removal and purification of pulmonary artery endothelial cells (PAECs) that adhere to the balloon tips of Swan-Ganz catheters while they are wedged in the pulmonary artery during right heart catheterization and remain adherent to the deflated balloon following removal from the patient's body.

הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further ...

Medicine

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד של תאים חיסוניים ולא חיסוניים מריאות עכברים עבור ציטומטריית זרימה

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

הבחנה בין תאי חיסון תוך-ריאתיים לבין אוכלוסיות תאי חיסון תוך-וסקולריים: הגישה התוך-צווארית

הבחנה בין תאי חיסון תוך-ריאתיים לבין אוכלוסיות תאי חיסון תוך-וסקולריים: הגישה התוך-צווארית

הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר