The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.

ملاحظة: خلال التجربة بأكملها، يتم تحضين خلايا البلاعم عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة الهواء القسري واتخاذها للخروج من الحاضنة فقط عن التلاعب التجريبية، التي تتم في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. العمل مع L. بكتيريا الليستريا هي وفقا لمستوى السلامة البيولوجية 2 اللوائح. 1. خلية التحضير والعدوى البكتيرية (يوم 1 و 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور نخاع 2.0 × 10 7 العظام الخلايا المشتقة من البلاعم (BMDM) على طبق 145 ملم في 30 مل BMDM + القلم بكتيريا وسائل الإعلام (الجدول 2). البذور 3 لوحات لكل سلالة بكتيرية ليتم تحليلها. احتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة القسري في الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها من النوع البري (WT) L. المستوحدة 10403S السلالة في 10 مل من القلب الدماغ ضخ (BHI) المتوسطة، عند 30 درجة مئوية في حاضنة القياسية. أنابيب مكان ثقافة مائلة دون أن تهتز. ملاحظة:هذه الشروط نمو يصل تنظيم التعبير عن الجينات سياط، وهو ما يعزز العدوى كفاءة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتوسطة قبل الدافئة BMDM (بدون المضادات الحيوية القلم بكتيريا) (الجدول 2) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أحادي الطبقة بلعم مرتين مع 25 مل من قبل تحسنت برنامج تلفزيوني لإزالة المضادات الحيوية. إضافة 30 مل الطازجة BMDM المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 1.5 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي البكتيريا في&gt; 14000 x ج لمدة 1 دقيقة، ونبذ طاف، وإعادة التعليق البكتيريا بلطف في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني قبل pipetting. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب كل لوحة بلعم مع 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها غسلها من النوع البري L. الليستريا. في حالة استخدام لوحات متعددة، ويصيب كل لوحة 15 دقيقة بعيدا. وهذا الفاصل الزمني تمكين حصاد كل لوحة على حدة في نهاية العدوى. ملاحظة: يتم يعاير وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من خلال طلاء التخفيف المتسلسلالصورة من ثقافة البكتيرية المستخدمة للعدوى على لوحات BHI أجار والفرز مستعمرة (كفو) بعد 24 ساعة حضانة لوحات عند 37 درجة مئوية. باستخدام 0.5 مل من WT L. اللستيريا سلالة النتائج 10403S في وزارة الداخلية من ~ 100 (100 البكتيريا كفو لكل خلية بلعم). عند تحليل المسوخ البكتيرية معيبة في نمو الخلايا، ينبغي النظر في وزارة الداخلية أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 0.5 حضانة ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا المصابة مرتين مع برنامج تلفزيوني، لإزالة البكتيريا غير مرتبط، وإضافة 30 مل قبل تحسنت BMDM المتوسطة. والبكتيريا تعلق استيعاب خلال ساعة 0.5 المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 1 ساعة بعد الإصابة، إضافة 30 ميكرولتر من الجنتاميسين (1: 1000 لتصل إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل) لقتل البكتيريا خارج الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز فلتر عن طريق وضع رأس المرشح على قارورة السائل جمع مع منفذ فراغ منفذ. ثم وضع فلتر (0.45 ميكرون) على رأس المرشح، تليها قمع اسطوانة وتأمين مناطق مختلفة مع معدن جمصباح. تحضير الماء ريبونوكلياز خالية من الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 6 ساعة بعد العدوى والبكتيريا الحصاد من الخلايا المصابة كما يلي. علاج كل لوحة على حدة. ملاحظة: عادة، L. اللستيريا يكمل 1-سجل النمو خلال 6 ساعات من العدوى في خلايا البلاعم. حضانات أطول يمكن أن يؤدي إلى فرط نمو جرثومي وموت الخلايا في الضامة، في حين فترات حضانة أقصر يمكن أن يؤدي إلى الحمل البكتيري أقل من ذلك بكثير. وزارة الداخلية والوقت من العدوى يمكن تعديلها للوصول إلى أفضل الظروف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المصابة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة 20 مل من الماء ريبونوكلياز خالية من الجليد البارد لليز خلايا البلاعم. استخدام مكشطة الخلية، كشط الخلايا قبالة اللوحة بسرعة ولكن بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا هي lysed إلى أنبوب مخروطي 50 مل. دوامة لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير طاف من خلال جهاز تصفية باستخدام نظام فراغ. باستخدام الملقط، ولفة من مرشح وبسرعة نقلها إلى 15 مل المخروطأنبوب كال. الأداة الإضافية تجميد أنابيب مع المرشحات في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز الترشيح مع فلتر جديد للعينة القادمة، كما هو موضح في 1.2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين مرشحات المجمدة في -80 درجة مئوية لليوم التالي. بدلا من ذلك، انتقل مباشرة إلى استخلاص الحمض النووي. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. الأحماض النووية استخراج (يوم 3) ملاحظة: تنفيذ كافة التلاعب مع حلول الفينول والكلوروفورم في غطاء الدخان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1: مزيج 1 من الفينول المحمضة: الكلوروفورم، 400 ميكرولتر لكل عينة. خلط في أنابيب منفصلة، ​​ثم سحب الطبقة المائية الناجم عن الطموح. إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الأنابيب التي تحتوي على فلتر على الجليد للحفاظ على البرودة. إلى كل أنبوب يحتوي على فلتر إضافة 650 ميكرولتر من EDTA-خلات (AE) العازلة (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بالخطوات التالية في أقرب وقت ممكن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بقوة الأنبوب الذي يحتوي على فلتر لذلكأن المرشح يخفق إلى المحيط الخارجي للأنبوب وعازلة يغسل تماما التصفية. احتفظ البرد أنبوب عن طريق وضعه مرة أخرى على الجليد. ملاحظة: قد يكون من الضروري بالإضافة إلى دوامة أنبوب بينما مقلوب لغسل بالكامل البكتيريا قبالة التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع الأنابيب. قد يكون من المفيد أن تدور إلى أسفل التعليق قريبا (1 دقيقة في 120 x ج) في نهاية العملية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المخزن المؤقت البكتيريا التي تحتوي على أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على SDS ومزيج الفينول / الكلوروفورم (كما أعد 2.1). أكرر للجميع الأنابيب. قد يكون من الضروري أن تدور التصفية التي تحتوي على أنابيب (1 دقيقة في 120 x ج) مرة أخرى للحصول عازلة المتبقي من التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كل 1.5 مل الأنابيب في جهاز دوامة متعددة أنبوب، ودوامة بأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب في C كتلة الحرارة 65 درجة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (&gt; 14000 x ج) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية (حوالي 400 ميكرولتر) من كل رأوبي إلى أنبوب 1.5 مل جديدة تحتوي على 40 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والايثانول 1.0 مل من 100٪. دوامة كل أنبوب دقيق. ملاحظة: الجليكوجين يمكن أن تضاف إلى هذه الخطوة لتحسين التصور من بيليه عجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان العينات عند -20 درجة مئوية خلال الليل. ثم، الطرد المركزي العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى (&gt; 14000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية قبالة الإيثانول (الطبقة العليا) من كل أنبوب. إضافة 500 ميكرولتر الباردة الايثانول 70٪ لكل عينة ودوامة تماما. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى (&gt; 1 4000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. تجفيف العينات لحوالي 2 دقيقة باستخدام المبخر فراغ دون تدفئة. لا تبالغ في تجفيف العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز لكل عينة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعناية وتدور الدوامة إلى أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي الريبي في تيانه عينات باستخدام microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. نتوقع أن استخراج حوالي 0،5-1 ميكروغرام من الأحماض النووية لكل لوحة. ملاحظة: مكررات التقنية يمكن الجمع في هذه المرحلة. </li></ol> 3. الدناز العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رد فعل وفقا للجدول 1 في أنبوب microfuge. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. إضافة 450 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز و 500 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم-IAA مزيج (الجدول 2)، مراحل منفصلة بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على السرعة القصوى (&gt; 14000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية لأنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولتر الكلوروفورم-IAA مزيج (الجدول 2)، ودوامة مراحل منفصلة من 2 دقيقة الطرد المركزي في السرعة القصوى (&gt; 14000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية لأنبوب جديد وإضافة 1 مل من الايثانول و 50 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2). دوامة. ملاحظة: الجليكوجين يمكن أن تضاف إلى هذه الخطوة لتحسين التصور من بيليه عجل. </li><lط&gt; احتضان لمدة 1 ساعة على -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، احتضان العينات عند -20 درجة مئوية خلال الليل. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. إضافة 500 ميكرولتر الباردة الايثانول 70٪ لكل عينة ودوامة تماما. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى. نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف العينات لحوالي 2 دقيقة باستخدام المبخر فراغ دون تدفئة. لا تبالغ في تجفيف العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، دوامة، وتدور باستمرار. العينات تحتوي على الحمض النووي الريبي النقى الاحتفاظ بها على الجليد. بدلا من ذلك، حل الحمض النووي الريبي في ريبونوكلياز خالية H 2 O مع 0.1 ملي EDTA أو TE العازلة (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. نتوقع ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة (إذا كان يتم الجمع بين مكررات التقنية). ملاحظة: استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لهذا البروتوكول هو مناسبة FOص تحليل النسخ الجيني بواسطة تقنيات متعددة. ونحن عادة استخدام تحليل RT-QPCR لدراسة L. المستوحدة النسخ الجيني خلال العدوى من خلايا البلاعم 1-4. </li></ol>

<ol>
	<li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA.">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li><li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence.">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).</li><li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP,+which+contribute+to+type+I+interferon+induction,+play+a+role+in+cell+wall+stress.">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li><li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence.">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li><li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+human+listeriosis.">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li><li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+a+multifaceted+model.">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li><li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence.">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li><li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection:+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity.">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li><li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+(SCOTS).">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages:+Insights+into+the+Phagosomal+Environment.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li><li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome.">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li><li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts.">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li><li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing.">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34 (2015).</li><li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+3'Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells.">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323 (2015).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li><li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD,+10403S,+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity.">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li><li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity.">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بروتوكول صفها هنا يمثل طريقة الأمثل لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من L. المستوحدة نمو البكتيريا داخل الخلية في خلايا البلاعم. ويستند هذا البروتوكول على تحلل الخلية التفاضلية وتضم اثنين من الخطوات الرئيسية لتخصيب اليورانيوم من الحمض النووي الريبي البكتيري...

مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا ─ البكتيريا المسببة للأمراض المعدية وقادرة على النمو والتكاثر داخل الخلايا الجنود البشري ─ لا مشكلة صحية رئيسية في جميع أنحاء العالم 5. غزو ​​وتكرار داخل الخلية الثديية، وقد اكتسبت مسببات الأمراض داخل الخلايا آليات الفوعة متطورة والعوامل. في حين أن هذه الآليات الأساسية إلى القدرة على التسبب في المرض، ونحن لا نعرف إلا القليل عن تنظيم وديناميتها. منذ ملامح التعبير الجيني من البكتيريا نما في وسائل الإعلام السائل لا تعكس البيئة الفعلية داخل الخلايا المضيفة، هناك حاجة متزايدة لTranscriptome على تحليل البكتيريا نما في منافذها داخل الخلايا. وهذه التحليلات تمكين فك رموز من التعديلات البكتيرية المحددة الناجمة عن المضيف، وسوف تساعد على تحديد أهداف جديدة للتصميم العلاجية. تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية التي تشكل تحديا كبيرا منذ RNA الثدييات يفوق عدد الجيش الملكي النيبالي البكتيرية التي كتبها فيلا يقل عن عشرة أضعاف. في هذا المخطوط، وصفنا طريقة تجريبية لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من الليستيريا المستوحدة نمو البكتيريا داخل خلايا البلاعم الفئران. الحمض النووي الريبي المستخرج يمكن استخدامها لدراسة التعديلات داخل الخلايا وآليات الفوعة من البكتيريا المسببة للأمراض من خلال تقنيات مختلفة من التحليل النسخ، مثل RT-PCR، RNA تسلسل، ميكروأري وغيرها من التكنولوجيات التهجين مقرها. اللستيريا L. هي العامل المسبب لداء الليستريات في البشر، وهو مرض مع المظاهر السريرية تستهدف في المقام الأول الأفراد المناعة والمسنين والنساء الحوامل 6. هذا هو الممرض داخل الخلايا الاختياري موجبة الجرام أن يغزو مجموعة واسعة من خلايا الثدييات التي استخدمت لعقود نموذجا في التفاعلات المضيف الممرض يدرس 7. على الغزو، ويقيم في البداية في فجوة أو يبلوع (في حالة الخلايا البلعمية)، والتي يجب أن الهروب إلى رانه استضافة العصارة الخلوية الخلية من أجل تكرار. وقد تبين أن عدة عوامل الفوعة للتوسط في عملية الهروب، وعلى رأسها ما يسمى بحالة دموية تشكيل المسام، Listeriolysin O (LLO) واثنين من فوسفوليباز إضافية 8. في العصارة الخلوية للبكتيريا تستخدم المضيف الآلات الأكتين البلمرة لدفع أنفسهم على خيوط الأكتين داخل الخلية وتنتقل من خلية إلى أخرى (الشكل 1). كلها عوامل الفوعة الرئيسية للL. اللستيريا المشاركة في الغزو، والبقاء داخل الخلايا وتكرارها، وتفعيلها من خلال النسخ المنظم الفوعة الماجستير، PrfA. 8-10. في العقد الماضي، العديد من الدراسات التي أجريت من قبل الولايات المتحدة وآخرون أساليب تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية تطبيقها بنجاح داخل الخلايا المضيفة 2،11-15. وتستخدم نهجين رئيسيين لفصل الحمض النووي الريبي البكتيرية من المضيف الحمض النووي الريبي والتي تقوم على: 1) إثراء الانتقائي من الحمض النووي الريبي البكتيرية و2) عزل الحمض النووي الريبي عن طريق زراعية مختلفةتحلل الخلية rential. يعتمد الأسلوب الأول على التهجين مطروح من إجمالي مقتطفات الحمض النووي الريبي لجزيئات الحمض النووي الريبي الثدييات (على سبيل المثال باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا) أو التقاط الانتقائي للتسلسل كتب البكتيرية (الاسكتلنديين) 11. ويعتمد النهج الثاني على تحلل التفاضلية من البكتيريا والخلايا المضيفة، التي يتم فيها هي lysed الخلايا المضيفة بينما تبقى الخلايا البكتيرية سليمة. ثم يتم فصل الخلايا البكتيرية من المحللة الخلية المضيفة، عادة عن طريق الطرد المركزي، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام التقنيات القياسية. المشكلة الرئيسية باستخدام هذا النهج هو الذي جنبا إلى جنب مع البكتيريا سليمة، يتم عزل الخلايا المضيفة أيضا نوى، وبالتالي فإن الاستعدادات الحمض النووي الريبي لا تزال تحتوي على الحمض النووي الريبي الثدييات. طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة هي فصل البكتيريا سليمة من نوى الخلايا المضيفة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، رغم أن هذا الإجراء عادة ما يستغرق وقت رفع قلق من التغيرات في الجينات الشخصية التعبير أثناء الاستخراج. في هذه الورقة نقدم لبا تحسين والسريعبروتوكول استخراج cteria RNA، الذي يقوم على نهج تحلل الخلية التفاضلية. أولا، L. وهي lysed اللستيريا إصابة خلايا البلاعم مع الماء البارد. وبعد ذلك، تتم إزالة النوى بلعم بواسطة الطرد المركزي وجيزة والبكتيريا سليمة يتم جمع بسرعة على مرشحات، والتي من الحمض النووي الريبي المعزولة من خلال استخراج الفينول SDS الساخن من الأحماض النووية البكتيرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Listeria monocytogenes 10403S</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">20</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">21</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O, RNAse free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DEPC-treated water can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline-PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion (BHI)</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>1104930500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol saturated pH 4.3</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1751I-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W205702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Fermentas,</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1070174000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 forced-air incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 3111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontes glass holder for 45 mm filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>K953755-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD131DDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Model G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>145 mm cell culture dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 ml tubes, RNase-free</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 &#176;C heat block</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 &#176;C table centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes, 25 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 ml</td>
			<td>Greiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

ويرد في النظام النموذجي في الشكل (1) ويشمل خلايا البلاعم المصابين L. المستوحدة البكتيريا، التي تكرار في العصارة الخلوية بلعم الشكل 2 يمثل المخطط التجريبي الشكل 3 يمثل نتائج نموذجية من هذا التحليل RT-QPCR الجينات الفوعة خل...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells at JoVE.com

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

9.1K Views.  Tel Aviv University. Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Video: RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

النقل الشفوي لل<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في الفئران عن طريق ابتلاع الطعام الملوث

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

العدوى التجريبية مع<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; نموذجا لدراسة المضيف الردود انترفيرون γ

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

تنقية من الفجوات المرضي من

النقل الشفوي لل

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

العدوى التجريبية مع