This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

وصفنا استخدام الحواجز غير منفذة لمنع تشكيل براعم الأطراف في أجنة الدجاج. هذه التقنية لديها عدد من الخطوات الحاسمة. وبعد التجارب الأولية، وجدنا أن الحواجز يتوقف على شكل المستخدمة في 9 و 10 تبقى في مكانها في الجنين أفضل بكثير من الحواجز على التوالي. الجانب المسطح البعيدة من الجدار العصي على الغشاء المحي ويحافظ على حاجز في مكان (الشكل 2C). التحضير المتأني للالمفصلي على شكل حواجز من رقائق الألومنيوم كما هو موضح في البروتوكول خطوة 1.6 ضروري لنجاح العملية. والخطوة الثانية المهمة هي ضمان أن البيض لا استبعد من الحاضنة لفترة طويلة جدا بعد النوافذ وتنظيم قبل التشغيل على الجنين. في تجربتنا، والأجنة البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية أفضل إذا كانوا في أو بالقرب من درجة حرارة الحضانة عند تنفيذ العملية. ولذلك، ينبغي تنفيذ العمليات في أسرع وقت ممكن والبيض أعادت موجهلاي لضمان بقاء معدلات جيدة. العديد من الباحثين إضافة قطرة من المضادات الحيوية إلى الجنين بعد جراحة قبل أن تعود البيض إلى الحاضنة. وجود السائل منعت الحواجز من الالتصاق جيدا في الموقف. يمكن إضافة المضادات الحيوية أيضا طرد حبات بعد التنسيب. لذلك لا تستخدم المضادات الحيوية، وعمليات سريعة ونظافة جيدة مع الصكوك ينصح لتجنب العدوى. محو الأدوات مع 70٪ من الإيثانول بعد كل مرحلة من مراحل العملية أمر ضروري لمنع الأدوات من أن تصبح لزجة من الاتصال مع الغشاء المحي الذي يمكن أن يسبب كل من الحواجز أو الخرز التمسك ملقط (انظر بروتوكول خطوة 3.1.2.2). كلا أصناف من الخرز المستخدمة يمكن تسقط من مكان بعد العملية. عندما تم فحص موقف حاجز في اليوم التالي لم يكن من الممكن أن نرى من خلال حاجز للتأكد ما إذا كانت حبة بقيت في مكانها أم لا. في الحالات التي يكون فيها حبة قد انخفض من لم انقاذ الجناح برعم ثمرة ( <stرونغ&gt; الجدول 1). تجنب نقل السائل مع حبة عند زرعها يعني أن حبات عصا بسهولة أكبر إلى قطع وجه LPM (انظر بروتوكول 2.3.2.3). وأخيرا ضمان أن الأجنة ثابتة مباشرة بعد الحصاد أمر بالغ الأهمية لتحليل التعبير الجيني لاحق جيدة (انظر بروتوكول خطوة 4.2). هذا البروتوكول يعدل التجارب التي نشرت في وقت سابق ان تستخدم الحواجز لمنع برعم الطرف بدء، ويعرف بعرض المثلى محددة الحواجز ويقدم الجمع بين الجدار ووضع حبة تليها تحليل التعبير الجيني. لقد وجدنا باستخدام رقائق الألومنيوم التقليدية، وهي رخيصة ومتاحة بسهولة في جميع المختبرات، وتنتج نتائج مساوية لتلك التي كانت تستخدم في السابق احباط التنتالوم. احباط يمكن أن تترك في الجنين عند تنفيذ في الموقع التهجين (الشكل 2C &#39;) لكننا عادة إزالته إذا كان يتم تجهيزها أكثر من جنين واحد لمنع الحواف الحادة من احباط إتلاف الأجنة. Pأثبتت الدراسات في Ilot أن عرض الحواجز منطقة الساق أهمية خاصة. في البداية كانت الحواجز محاكمتهم قصيرة جدا ولم تمنع نمو الساق مهدها. 1،2-1،3 مم هو العرض الأمثل لحاجز لمنع الساق ثمرة برعم تماما. أضيق الحواجز الجناح يمكن للمرء أن وضع بدقة لمنع نمو برعم تعطي أفضل معدلات البقاء على قيد الحياة. وهذا يمكن أن تكون ضيقة مثل 0،5-0،7 مم. ومع ذلك، الحواجز التي هي أوسع قليلا من المرجح أن يؤدي إلى إتمام حظر الجناح برعم ثمرة لأنها تسمح لعدم دقة صغيرة من وضع (كنا 0،7-1 ملم). تجنب الأوعية الدموية عندما جعل شق أمر بالغ الأهمية للحواجز مستوى الجناح مهدها. وقد سبق استخدام حواجز شبه منفذة للشطر برعم كتكوت أطرافهم. MacCabe وباركر، 1976 وSummerbell، 1979 مرشحات كلاهما يستخدم 0.45 ميكرون و 0،8 ميكرون حجم المسام، على التوالي 16، 17. وذكرت ان اشارات إنتشاري يمكن أن تمر من خلال المسام في الفلاتر والتياكتسبت النتائج باستخدام حواجز شبه منفذة منتصف الطريق بين براعم الأطراف مع عدم وجود حاجز الحالي واحد مع حاجز احباط التنتالوم بردة. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لاستخدام الحواجز شبه منفذ متفاوتة حجم المسام للتمييز إشارات مرشح على أساس الحجم أو تعديل ديناميكية انتشار إشارة. هذا البروتوكول لديه العديد من القيود المرتبطة أساسا مع كائن النموذج نفسه. ويمكن استخدام هذه التقنيات لتحقيق المزيد من الأسئلة في تطوير أطرافه وأيضا أسئلة أخرى من التطور الجنيني الفقاريات. والشرط هو أن الجهاز / المنطقة المعنية يجب أن تتطور عند الجنين الفرخ هو الوصول إلى التدخل. وجود الأوعية الدموية الكبيرة في المنطقة حيث يحتاج إلى حاجز لتوضع يجعل في وقت لاحق حاجز تنسيب من المرحلة 13 أو 14 تحديا تقنيا. إذا يتم قطع الأوعية الدموية الكبيرة خلال وضع حاجز هذا يمكن أن يسبب وفيات الأجنة. تحقيقنا متى عوامل النسخ Tوبفعل bx5 وTbx4 لأول مرة في LPM كان محدودا من قبل أقرب المرحلة التي نحن يمكن أن تضع حاجزا من شأنه أن ينهي في وقت لاحق العكس إما الجناح أو برعم الساق على التوالي. كان من الممكن إلقاء الضوء على محاولة لمنع TBX تحريض الجينات في مراحل سابقة، أقرب إلى تكون المعيدة. يمكن وضعها في أقرب حاجز في منطقة الجناح الظني كان بنجاح مرحلة 8 و في مرحلة منطقة الساق 10. هذا البروتوكول هو ربما غير مناسبة لدراسة التعبير الجيني وراء مراحل برعم الطرف بسبب النمو السريع لاحق من شأنه أن يزيح الحاجز والنتائج أن تتصل فقط على الموقف المبدئي من الجدار. بعد أن تتصل القيود المفروضة على أجنة الدجاج في هذا السياق، مزاياه أكثر الكائنات نموذج الفقاريات الأخرى كثيرة. الجنين الفرخ هو نموذج حيواني مناسبة جدا لهذا النوع من التدخل المادي في جنين الفقاريات. الأجنة كبيرة نسبيا، ويمكن الوصول إليها بسهولة throuGH قشر البيض. يمكن للمرء أن العودة إلى جنين لمزيد من التجارب (على سبيل المثال، وإزالة حبة 18 أو حتى حاجز) أو للاطمئنان على التقدم ببساطة عن طريق إزالة نافذة الشريط. وهناك مجال الممكن إدراج التصوير الحي أو الوقت الفاصل بين التصوير. نحن تصف طريقة وضع النوافذ بيض الدجاج التي تناسب بشكل خاص لتعمل على الأجنة مرحلة مبكرة. في حالة الدراسات أطرافهم من المهم والمفيد جدا أن هناك أحد أطرافه السيطرة المقابل لكل التجربة التي تعد بمثابة الرقابة الداخلية مثالية لكل تكرار البيولوجي. لم يتم الابلاغ عن مزيج من استخدام الحواجز غير منفذة لمنع نمو الأطراف والخرز غارقة في الجزيئات يشير من قبل. لدينا تحليل مرنا التعبير التالي مثل هذه التدخلات هو أيضا رواية. هذه التقنيات مكنتنا من تشريح المشكلة الصعبة المتمثلة في حين عوامل أطرافهم النسخ محددة هي التي يسببها Tbx5 وTbx4 في LPM وأيضالتظهر في وقت لاحق، وذلك قبل بدء أطرافهم برعم، فإن وجود هذه الجينات TBX في LPM لا يكفي لتفعيل Fgf10 النسخ وبداية نمو برعم الطرف. أرقام 2G، 2D و 2E توضح هذه النتائج أيضا. غياب التعبير Tbx4 بعد الإدراج حاجز في المرحلة 10 في الشكل 2G هو في تناقض صارخ مع وجودها في 2D و 2E التالية الإدراج حاجز في المرحلة 15، بعد تحريض Tbx4. غرس حبات RA غارقة تسهيل إنقاذ برعم الطرف بدء التالية الإدراج الحاجز وحتى نقطة لالتهاب المفاصل الروماتويدي من و somites أساسية في عملية LPM قبل برعم الطرف ثمرة يمكن أن تبدأ. ويمكن استخدام هذه التقنيات على حل المزيد من الأسئلة في تطوير أطرافه ولكن أيضا أسئلة أخرى من التطور الجنيني من الفقاريات. ومن المرجح أن تكون مناسبة مناطق الدماغ والعين والجذع.

عالم أجنة الكلاسيكية تستخدم عادة تقنيات المادية لاستجواب الآليات المتحكمة في التطور الجنيني. في 1960s و 1970s طور الباحثون التقنيات التي تستخدم حواجز منيعة تدرج بين أنسجة الجنين النامي للتدليل على أهمية إشارات الاستقرائي خلال مرحلة التطور الجنيني. مصلحتنا هي في وضع الطرف الفقاريات وعلى وجه الخصوص ما أحداث تسبق برعم الطرف ثمرة. على سبيل المثال، يمكن ادراج حاجزا يمنع برعم الطرف ثمرة من الحدوث على جانب واحد من أجنة الدجاج في حين يسمح لها المضي قدما عادة على الجانب، unoperated المقابل. المواد المستخدمة لجعل هذه الحواجز متنوعة. على سبيل المثال، لوحات الميكا 1 والتنتالوم احباط 2. هذه الحواجز تفصل بشكل فعال لوحة الأديم المتوسط ​​الجانبي (LPM)، والتي من أشكال برعم الطرف، من و somites تتشكل من الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور. تقنيات تطعيم الجراحية تثبت أن وثيقة الارتباط خفة دمح و somites ضروري إذا برعم الطرف بدء هو أن يحدث في LPM 3 4. في 80s و 90s اكتشف علماء البيولوجيا التطورية قابل للانتشار الجزيئات مما يشير التي لا غنى عنها في السيطرة على العمليات التنموية. حبات غارقة مع هذه الجزيئات يشير يمكن زرعها في مناطق معينة من الجنين وينتج تعديلات على التطور الجنيني. على سبيل المثال، يتم تحرير حمض الريتينويك (RA) التي اتخذت من قبل الخرز التبادل الأيوني على مدى فترة 24 ساعة عند زرعها في أجنة الدجاج ويمكن ان تنتج ازدواجية مرآة صورة من الأرقام 5. يمكن الهيبارين الخرز الاكريليك تحتوي على البروتين صندوق الأجيال القادمة بدء برعم الطرف ثمرة من interlimb LPM 6. وفي الآونة الأخيرة أخذت الماوس والأسماك الوراثة دراسة بدء الفقاريات الأطراف إلى عهد جديد (إعادة النظر في 7). وهناك أدلة قوية على ان RA موجودة في و somites قبل بدء برعم الطرف هو إشارة إنتشاري الأساسية المطلوبة من قبل ليرة لبنانيةM للشروع الطرف مهدها. أردنا استغلال الوصول ومتانة التجريبية للجنين فرخ لتشريح تأثير زرع حاجز على التعبير الجيني في LPM في وقت قريب من بدء برعم الطرف. والتكيف الرواية من أسلوبنا هو الجمع بين حاجز يمنع إشارات من الأنسجة المحورية مع الجانبية حبة التنسيب إلى حاجز لعوامل داخلية المنشأ مرشح العرض خارجيا التي تم حظرها من قبل حاجز. البروتوكولات التالية هي تلك التي وضعت لاستخلاص آليات الطرف تحريض برعم وبدء. دراسة برعم الطرف بدء يعني استخدام الأجنة مرحلة مبكرة. الكثير من البيض الباحثين نافذة الدجاج عن طريق إزالة أولا بعض الزلال من خلال كيس الهواء مع إبرة تحت الجلد. الجنين، والتي تقع على رأس صفار البيض، وبعد ذلك تكمن أقل في البيض. هذه هي ميزة لبعض التقنيات، مثل Electroporation لل، ولكن يمكن أن يكون العيب إذا كان المطلوب معالجة جراحية للجنين.نجد وجود الجنين أقرب إلى فتحة في البيض ممكن هو ميزة. ما زالت هناك تساؤلات بشأن الإشارات التي تتحكم في أطرافهم الفقاريات برعم تحريض وبدء والبروتوكولات التالية هي مناسبة لمعالجتها. نحن أول من وضع بروتوكول لإدخال الحواجز لمنع الفرخ برعم الطرف ثمرة في مرحلة مبكرة من المرحلة 12 8. ويمكن أيضا أن نسخ معدلة من هذه البروتوكولات يتم استخدامها لمعالجة مسائل أخرى على الأصل وتوقيت الاشارات الاستقرائي حيث تقع على الأنسجة على حث الوصول المتاخمة للمنشم التي يسببها. تقدم منطقة جنين يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التنموية ذات الصلة، ثم حاجز يمكن أن توضع بين الأنسجة والتغيرات اللاحقة في التنمية المدروسة. يمكن العثور على أمثلة في نمو الدماغ، والإرشاد محور والتنمية ربما الأعضاء مثل الكبد أو الكلى الاستقراء.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

يوفر الجنين الفرخ نموذجا الفقاريات رائعة التي يمكن استخدامها لتشريح الأسئلة التنموية بطريقة مباشرة. إمكانية الحصول عليها ومتانة بعد التدخل الجراحي هي نقاط القوة التجريبية الرئيسية. وكانت لوحات الميكا الحواجز الأولى تستخدم لمنع الفرخ برعم الطرف بدء 1. يتم وصف البروتوكولات التي تستخدم رقائق الألومنيوم بمثابة حاجز كتيم إلى برعم الجناح أو تحريض الساق برعم وأو البدء. نحن الجمع بين هذه التقنية مع الجانبية حبة التنسيب للعائقا أمام خارجيا العوامل الداخلية مرشح العرض التي تم حظرها من قبل حاجز. ويتم تحليل النتائج باستخدام التهجين الموضعي التعبير الجيني لاحق. هدفنا الرئيسي هو التركيز على دور الإشارات حمض الريتينويك في تحريض والشروع في وقت لاحق من الصدارة كتكوت الجنين وhindlimb. نحن نستخدم BMS 493 (ناهض معكوس مستقبلات حمض الريتينويك (RAR)) حبات غارقة مزروع في لوحة جانبية الأديم المتوسط ​​(LPM) لتقليد أثر باررير وضعت بين و somites (مصدر لحمض الريتينويك (RA)) وLPM التي تنمو براعم الأطراف. ويمكن أيضا أن نسخ معدلة من هذه البروتوكولات يتم استخدامها لمعالجة مسائل أخرى على الأصل وتوقيت الاشارات الاستقرائي. تقدم منطقة جنين الفرخ يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التنموية ذات الصلة، ويمكن وضع حاجز بين الأنسجة والتغيرات اللاحقة في التنمية المدروسة. يمكن العثور على أمثلة في الدماغ، والإرشاد محور تطوير وفي تطوير الجهاز، مثل الكبد أو الكلى الاستقراء.

يصف بروتوكول المفصلة أعلاه الأساليب المستخدمة في نيشوموتو وآخرون. ، عام 2015. ورقة دراسات برعم الطرف تحريض والشروع في كل من الصدارة وhindlimb الجنين الفرخ. وقد نشرت النتائج التالية ادراج حواجز منيعة لمنع نمو البرعم forelimb السابق 1، 2، 9 ولكن كان هناك فقط واصفا الحواجز دراسة واحدة منع الساق برعم بدء 1. البيانات Hindlimb من نيشوموتو وآخرون. ، يتم عرض 2015 هنا النتائج ممثل دراسة التعبير مرنا بعد إدخال الحاجز. التعبير Tbx4 في LPM غير كاف لبدء Hindlimb ثمرة: الأرقام 2B و ج (الجدول رقم 2) تبين أن الإدراج حاجز في المرحلة 15 (الشكل 2A) (انظر بروتوكول 3.2) يؤدي إلى كل من Fgf10وFgf8 التعبير غائب المنطقة الساق برعم (الرمز بواسطة قوس) على الجانب الأيمن تشغيلها. مقارنة مع الجانب الأيسر unoperated. ومع ذلك، لوحظ Tbx4 التعبير في كل مرحلة 19 و 23 مرحلة على الجانب تعمل (الشكل 2D و E). نخلص إلى أن التعبير Tbx4 وحدها ليست كافية لبدء hindlimb ثمرة من LPM. وأشارت دراسات أخرى في فرخ هذا التعبير TBX الجين هو كاف لبدء تشكيل forelimb برعم 12 و 13. يتم تضمين الشكل 2C &quot;لتوضيح كيفية حاجز يبدو جعلهما في منطقة الساق وظيفة الجنين التثبيت. في معظم الحالات الحواجز أزيلت قبل في الموقع التهجين (بروتوكول 4.3). التهاب المفاصل الروماتويدي من و somites ضروري في LPM قبل Fgf10 يقنع الاطراف برعم ياutgrowth: الشكل 3A هو التخطيطي تمثل إضافة لالقاصي حبة RA غارقة إلى حاجز إدراجها في المرحلة 15 (بروتوكول 3.2.1.3). لاحقا إلى هذه العملية برعم الطرف ثمرة (الرمز بواسطة علامة النجمة) ويلاحظ على الجانب الأيمن تشغيلها وTbx4، Fgf10 وFgf8 يتم التعبير عنها في مهدها كما هي في الجانب الأيسر التحكم (الشكل 3B، C و D، الجدول 2) . وبالتالي إضافة RA إلى LPM تتغلب على تأثير الجدار وأطرافهم عائدات برعم بدء. نستنتج أن في الاتحاد الإقليمي تنمية العادي من و somites أمر ضروري في LPM قبل ويمكن البدء في نمو برعم الطرف. براعم hindlimb الناتجة أصغر عموما من تلك الموجودة على الجانب السيطرة. قد يكون هذا بسبب جرعة RA في LPM كونها لا تعادل الوضع النوع البري. إذا كانت الجرعة RA عالية جدا وقمي الأدمة ريدج (آي إي آر) يمكن اختصارها، وسوف يؤدي البراعم الصغيرة14، 15. للتأكد من أن التهاب المفاصل الروماتويدي (من و somites) في LPM مطلوب للالعادي برعم الطرف بدء ناهض معكوس من RAR، BMS 493، تم استخدامها. تزرع حبات في LPM منطقة الساق في المرحلة 15 (انظر بروتوكول 3.2.1.4) (الشكل 3E). وdownregulated التعبير Fgf10 تطبيق التالي من BMS 493 حبات في LPM، مما أدى إلى براعم hindlimb أصغر بالمقارنة مع الجانب السيطرة (الشكل 3F، الجدول 3). حبات السيطرة DMSO لا تسبب هذه العيوب (الأرقام الجيل الثالث 3G و3H، الجدول 3). العيوب وحظ التالية BMS 493 التطبيق هي أخف من تلك التي تحدثها عملية الحاجز. أي Fgf10 لا يزال أعرب وتتشكل براعم الأطراف. هذا ومن المرجح أن يكون ذلك بسبب تقتصر آثار BMS 493 محليا في جميع أنحاء الخرز وقد لا تكون قادرة على استعداء كل RA التي تنتجها AXIآل الأنسجة. في وقت مبكر إشارات المحورية التخصص خلايا LPM أن عبر عن وقت لاحق Tbx4: اختبرنا عندما LPM يكتسب القدرة على التعبير عن Tbx4 في المنطقة التي تشكل المحطة المرتقبة. أقرب المرحلة التي يمكن إدراج حاجزا التي من شأنها عرقلة في وقت لاحق الساق برعم ثمرة، هي مرحلة 10. نحن أول من وضع بروتوكول لادخال الحواجز على مراحل في وقت سابق من مرحلة 12. الحواجز تدرج بين الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور والساق الظني LPM في المرحلة 10 (انظر بروتوكول 3.4) تشكيل برعم كتلة الساق والتعبير عن Tbx4 في LPM تشكيل الساق (أرقام 2F و 2G، الجدول 2)، مما يدل على أن إشارة من الأنسجة المحورية في المرحلة 10 مطلوب للتعبير في وقت لاحق من Tbx4 في LPM hindlimb. قارن هذه النتيجة مع شخصيات 2D و E حيث يسمح لاحق حاجز الإدراج التعبير Tbx4حتى تتاسس. وعلاوة على ذلك، نحن اختبار ما إذا كان هذا إشارة محوري يمكن أن يكون التهاب المفاصل الروماتويدي من خلال مراقبة ما إذا كان ناهض معكوس من RAR يقلل التعبير Tbx4. وBMS 493 حبة توضع في LPM hindlimb في المرحلة 10 (انظر بروتوكول 3.4.1.3) downregulates التعبير Tbx4 (أرقام 2H و2I)، في حين حبات السيطرة غارقة في DMSO لا تؤثر Tbx4 التعبير (أرقام 2J و2K). معا، وهذه النتائج تدعم نموذجا إشارة RA من الأنسجة المحورية تنظم أطرافهم تحريض من خلال تنظيم إيجابيا Tbx4 في LPM hindlimb 7. الموت بعد الجراحة: الجدولين 1 و 2 و 3 تعطي تفاصيل النتائج التجريبية بما في ذلك عدد من افراخ الدجاج التي نفقت بعد العملية وقبل الحصاد. بعض الوفيات وينتظر أن تتم بعد جراحة من هذا النوع. الموت أرقام يمكن أن تظل<html> إلى أدنى حد ممكن عن طريق التأكد من أن الصكوك نظيفة، وثقب في البيضة هو الحد الأدنى لحجم المطلوبة، التي تترك الأجنة دون حماية ختم شريط لاصق للحد الأدنى من الوقت وبالتزامن مع هذه النقطة الأخيرة أن العملية ونفذت في أسرع وقت ممكن. أيا من هذه العمليات هم قتا طويلا جدا ولكن العمليات التي تنطوي على الخرز والحواجز تأخذ وقتا أطول قليلا. وعلى الرغم من هذه الإجراءات، العمليات التي تتم في المراحل الأولى وتلك الموجودة في منطقة الجناح على الأرجح أن يؤدي إلى الوفاة. هناك الأوعية الدموية الكبيرة في جميع أنحاء المناطق التي تشكل الأطراف وتمزق عرضية من هذه السفن قد يؤدي إلى الوفاة بسبب فقدان الدم. نجد أن البيض فتحت في مرحلة 8 أو 9، الذي الأجنة لم تعمل على، وغالبا ما يموت في اليوم التالي. ولذلك، فإن الحل الوحيد لهذه المشاكل هو تنفيذ عدد كبير من التجارب. د / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. ماركر التغييرات التعبير الجيني التالية الحاجز أو الخرزة الإدراج في افتراض والساق مستوى. (أ) وضع عرض تخطيطي الحاجز (الخط الأخضر) في الظني مستوى الساق (القطع البدنية النمطية 26-32) في جنين المرحلة 15. (B - E و G) تحليل WISH على الأجنة تشغيلها. ويرد منطقة الساق (بين قوسين). (ب) التعبير Fgf10 غائب في LPM تعمل، ولكن تم الكشف عن التعبير القوي في مهدها الأيسر. (ج) التعبير Fgf8 غائب في الجانب تشغيلها، مما يشير إلى عدم وجود هيئة تنظيم الكهرباء. (C &#39;) نفس الجنين قبل إزالة الجدار. وأعرب عن (D) Tbx4 في LPM على نفس المستوى rostro-الذيلية كما مهدها السيطرة. وحافظت (E) التعبير Tbx4 في منطقة الساق اليمنى على الرغم من عدم وجود نمو أطرافهم. (F) رسم تخطيطي للمرحلة<html> 10 كتكوت الجنين الذي يظهر في موضع الحاجز (الخط الأخضر) على مستوى الساق الافتراضي. (G) التعبير Tbx4 غائب في تشغيلها الصحيح LPM (قوس). (H) رسم تخطيطي للكتكوت الجنين المرحلة 10 يظهر BMS 493 موقف حبة (دائرة البنفسجية) على مستوى الساق الافتراضي. وdownregulated (I) التعبير Tbx4 على الجانب الأيمن تشغيلها بعد العلاج مع BMS 493. (J) رسم تخطيطي للكتكوت الجنين المرحلة 10 يظهر سيطرة على الموقف DMSO حبة (الدائرة الرمادية). وأعرب عن (K) Tbx4 على الجانب الأيمن تعمل على مستوى مماثل لتلك التي تحكم الجانب الأيسر بعد العلاج مع DMSO وحدها. تم تعديل هذا الرقم من 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> د / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; غياب الشكل 3. RA تنقذ برعم الطرف الناجمة عن الجدار الإدراج وضروري في LPM قبل الساق برعم ثمرة. (A) رسم تخطيطي مشيرا إلى موقف الحاجز (الخط الأخضر) على مستوى الساق المفترض (القطع البدنية النمطية 26-32) وحبة غارقة RA (الدائرة الحمراء). (B - D) RA الإنقاذ الساق برعم ثمرة (يتضح من النجمة). (ب) التعبير Tbx4 موجود في مهدها الساق انقاذ مماثلة إلى جانب الامم المتحدة وتعمل. وأعرب عن (C) Fgf10 في ساقه انقاذ برعم على غرار الجانب تديرها الامم المتحدة. وأعرب عن (D) Fgf8 في هيئة تنظيم الكهرباء من المهد الساق اليمنى انقاذهم. (E) التخطيطي مشيرا إلى حيث وضعت BMS 493 الخرز (الدوائر البنفسجية) في LPM الساق افتراضية المرحلة 15 الأجنة. وdownregulated (F) التعبير Fgf10 على الجانب الأيمن تشغيلها وبرعم الساق صغير التالي BMS 493 العلاج. حبات بنجمة. (G) التخطيطي على غرار (E)، مما يدل على موقف السيطرة الخرز DMSO (الدوائر الرمادية). لم (H) حبات DMSO (كما هو موضح من قبل العلامات النجمية) لن يؤثر على التعبير Fgf10 أو حجم الساق مهدها. تم تعديل هذا الرقم من 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مرحلة الحاجز وضعت (+ حبة) * </td><td> عدد تعمل </td><td> الجناح المفقودين ** </td><td> الجناح الحاضر ** </td><td> العدد القتلى </td></tr><tr><td> مرحلة 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> مرحلة 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> مرحلة 12-13 (FGF4 حبة) </td><td> 41 </td><td> 7 (المفقودين حبة) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> مرحلة 12-13 (RA حبة) </td><td> 75 </td><td> 9 (المفقودين حبة) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> المرحلة 13 (حبة السيطرة) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0،7-1 ملم الحواجز احباط وضعت بين القطع البدنية النمطية 15-20 ولوحة الأديم المتوسط ​​الجانبي. 0.35 ملغ / مل FGF4 حبة. 0،05-،1 ملغ / مل RA حبة. </td></tr><tr><td colspan="5"> [دمس] حبة السيطرة. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** مراحل الأجنة الفرخ ثابتة 21-23 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الجناح مستوى الجدار والخرزة تجربة النتائج. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مرحلة الحاجز وضعت (+ حبة) * </<html> td&gt; <td> عدد تعمل </td><td> ساق في عداد المفقودين ** </td><td> الساق الحاضر ** </td><td> العدد القتلى </td></tr><tr><td> مرحلة 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> مرحلة 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> المرحلة 15 (حبة FGF4) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> المرحلة 15 (حبة RA) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0،7-1،3 مم الحواجز احباط وضعت بين القطع البدنية النمطية 26-32 ولوحة الأديم المتوسط ​​الجانبي. 0.35 ملغ / مل FGF4 حبة. 0،05-،1 ملغ / مل RA حبة. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** مراحل الأجنة الفرخ ثابتة 18-24 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الساق مستوى الجدار والخرزة تجربة النتائج. <table bor</html style=";text-align:right;direction:rtl">دير = &quot;1&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot; FO: المحافظة على مع next.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <tbody><tr><td> عدد تعمل </td><td> برعم صغير الساق </td><td> برعم صغير الساق قليلا </td><td> الساق برعم الحجم العادي </td><td> العدد القتلى </td></tr><tr><td> BMS 493 الخرز * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> حبات DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 حبات غارقة في 5 ملغ / مل BMS 493 وضعت في حق مرحلة 14-15 LPM على مستوى الساق. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 حبات غارقة في DMSO ضعت وحدها في حق المرحلة 15 LPM على مستوى الساق. </td></tr><tr><td colspan="5"> افراخ الدجاج ثابتة في مراحل 17-19. </td></tr></tbody></table> الجدول 3. الساق مستوى BMS 493 حبة تجربة النتائج.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

application-impermeable-barriers-combined-with-candidate-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Views.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Video: Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

الأمثل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Neuroscience

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

تحليل تمايز الخلايا ، والتشكل ، والتنميط أثناء التكوين الجنيني للدجاج باستخدام فحص الخرز المنقوع

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

تقييم استجابة جذع الدماغ السمعي في فراخ الدجاج

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الأمثل