This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

우리는 병아리 배아 사지 싹 형성을 방지하는 불 투과성 장벽의 사용을 설명한다. 이 기술은 중요한 단계들을 갖는다. 예비 실험에 따라, 우리는 9에 사용 된 경첩 모양의 장벽, 10 직선 장벽보다 훨씬 더 나은 배아에 그대로 남아 있음을 발견했다. 장벽의 말단 평평한면은 난황 막에 스틱과 장소 (그림 2C &#39;)의 장벽을 유지합니다. 프로토콜 단계 1.6에 기재된 바와 같이 알루미늄 박의 힌지 형 장벽 조심 준비 동작의 성공에 필수적이다. 두 번째 중요한 단계는 계란이 너무 오래 윈도우를 다음과 배아에서 작동하기 전에 준비를위한 인큐베이터에서 제외되지 않도록하는 것입니다. 우리의 경험에서, 배아는 동작이 수행되는 때까지 또는 배양 온도는 근처에있는 경우 동작 더 생존. 따라서 작업 가능한 빨리 수행되어야하고 계란 프롬프트를 재 밀봉LY 좋은 생존율을 보장합니다. 많은 연구자들은 인큐베이터에 달걀을 반환하기 전에 미세 다음 배아에 항생제의 드롭을 추가합니다. 액체의 존재는 위치에 잘 붙지 장벽을 막았다. 항생제의 추가도 배치 후 구슬을 제거 할 수 있습니다. 따라서 항생제, 빠른 작업 및 악기에 좋은 청결을 사용하지 않는 것이 감염을 방지하는 것이 좋습니다. 작업의 모든 단계 다음 70 % 에탄올로 악기를 닦기 (프로토콜 단계 3.1.2.2 참조) 장벽 또는 구슬 모두 집게에 부착시킬 수있는 난황 막과의 접촉에서 스티커가되는 계기를 방지하기 위해 필수적이다. 사용하는 구슬의 두 종류가 작업 다음과 같은 장소에서 떨어질 수 있습니다. 배리어 위치 다음날 체크되었을 때 비드이 제자리에 남아 있는지 여부를 확인하기 위해 장벽을 볼 수 없었다. 비드 밖으로 떨어진 경우에 날개 꽃 봉오리 가지가 구출되지 않았다 ( <st룽&gt; 표 1). 를 주입 할 때 비드와 액체를 전송 피하는 것은 구슬 (프로토콜 2.3.2.3 참조) LPM의 절단면에 더 쉽게 스틱 것을 의미한다. 마지막 배아 수확 좋은 후속 유전자 발현 분석에 중요 직후 고정되는 것을 보장 (프로토콜 단계 4.2 참조). 이 프로토콜은, 사지 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 장벽을 사용 이전에 발행 된 실험을 수정 장벽에 대한 특정 최적의 폭을 정의하고 유전자 발현 분석 한 다음 결합 장벽 비드 위치를 소개합니다. 우리는 저렴하고 모든 실험실에서 쉽게 사용할 기존의 알루미늄 호일을 사용하여 발견, 이전에 탄탈륨 포일을 사용하는 것과 동일한 결과를 생성합니다. 호일 계내 혼성화 (도 2C &#39;)에서 수행 할 때 배아에 남아 있지만, 하나 이상의 배아 배아 손상 포일의 날카로운 모서리를 방지하기 위해 처리되는 경우, 우리는 일반적으로 제거 될 수있다. 피ILOT 연구 레그 영역 장벽의 폭이 특히 중요하다는 것을 보여 주었다. 처음 평가판을 장벽이 너무 짧습니다되었고 다리 버드 파생물을 방지하지 않았다. 1.2-1.3 mm 완전히 다리 꽃 봉오리 가지를 차단하는 장벽에 대한 최적의 폭이다. 하나 정확하게 배치 할 수있는 좁은 날개 장벽은 꽃 봉오리 가지가 가장 생존율을 줄 방지합니다. 이것은 0.5 내지 0.7 mm만큼 좁아 질 수있다. 그러나, 조금 더 넓은 장벽 (우리는 0.7-1 mm를 사용)가 배치 약간의 부정확성을 허용하기 때문에 날개 꽃 봉오리 가지의 완전한 차단이 발생할 가능성이 더 높습니다. 혈관의 회피는 때 절개를 만드는 것은 날개 꽃 봉오리 수준의 장벽 중요합니다. 반 투과 장벽은 이전에 병아리 사지 꽃 봉오리를 양분하는 데 사용되었다. MacCabe과 파커, 1976 Summerbell 1979 년 모두 사용되는 필터는 각각 0.45 μm의 0.8 μm의 기공 크기, 16, 17. 그들은 확산 신호가 필터 및 그 구멍을 통과 할 수 있다고보고결과는 반 투과 장벽이 불 침투성 탄탈 박 장벽없이 존재하는 장벽과 하나 사지 꽃 봉오리 사이의 중간이었다 사용되었습니다. 이 프로토콜은 크기 나 확산 신호의 동적을 수정하는 기초 후보 신호를 구별하기 위해 다양한 기공 크기의 반 투과 장벽을 사용하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 주로 모델 생물 자체와 관련된 다양한 제한 사항이 있습니다. 이러한 기술은 사지 개발에 추가 질문도 척추 동물 배아의 다른 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 단은 병아리 배아 개입에 액세스 할 때 해당 기관 / 지역 개발해야한다는 것입니다. 장벽이 배치 될 필요가있는 영역의 큰 혈관의 존재는 차단 위치 이후 단계 13 또는 14보다 기술적 도전한다. 큰 혈관 장벽 배치하는 동안 절단하는 경우이 태아 사망의 원인이 될 수 있습니다. 전사가 T 요인을 때의 조사bx5 및 Tbx4가 먼저 LPM에 유도는 우리가 나중에 각각 반대 하나 날개 또는 다리 새싹을 끝낼 것 장벽을 배치 할 수있는 초기 단계에 의해 제한되었다. 낭배에 가까운 초기 단계에서 TBX 유전자 도입을 차단하는 시도를 조명 할 수있다. 초기 배리어가 추정 윙 영역에 배치 될 수 성공적 스테이지 (8)이었고, 이후의 급속한 성장은 배리어 결과를 변위 때문에 다리 영역 스테이지 (10)에서이 프로토콜은 아마도 사지 싹 단계 이후의 유전자 발현 연구에 적합하지 않다 단지 배리어의 초기 위치에 관한 것이다. 이러한 맥락에서 병아리 배아의 한계를 관련하는 데, 다른 척추 동물 모델 생물을 통해 그 장점이 많다. 병아리 배아는 척추 동물 배아의 물리적 간섭이 유형의 매우 적합한 동물 모델이다. 배아 비교적 크고 throu 쉽게 접근달걀 껍질을 GH. 하나는 추가 실험을위한 배아로 돌아갈 수 있습니다 (예를 들면, 비드 (18) 또는 장벽의 제거) 또는 단순히 테이프 창을 제거하여 진행 상황을 확인. 라이브 영상 또는 시간 경과 영상을 포함 가능 범위가 있습니다. 우리는 특히 초기 단계의 배아에서 작동에 적합 닭 계란을 윈도하는 방법을 설명합니다. 사지 연구의 경우에 각 생물학적 복제 이상적인 내부 대조군으로서 작용 각 실험에 대한 반대측 제어 사지가 매우 중요하고 유용하다. 신호 분자에 침지 사지 가지 비즈 않도록 투과성 장벽을 이용하는 조합은 이전에보고되지 않았다. 이러한 개입을 다음과 mRNA 발현의 우리의 분석은 또한 소설이다. 이러한 기술은 사지 특정 전사가 Tbx5 및 Tbx4도 LPM에 유도하는 요인 때의 어려운 문제를 해부 할 수있게이상, 종래 새싹 개시 사지 것을 보여주기 위해 상기 LPM TBX 이러한 유전자의 존재 Fgf10 전사의 활성화 및 사지 싹 생장 개시 충분하지 않다. 2G, 2D 및 2E는 또한 이러한 결과를 도시한다. 그림 2G에서 스테이지 (10)에서 장벽의 삽입 다음 Tbx4 식의 부재는 Tbx4의 유도 후, 단계 15에서 장벽 삽입 다음 2D 및 2E에서 자신의 존재에 대한 대조적이다. RA 배어 구슬의 주입 장벽 삽입 및 사지 꽃 봉오리 가지 시작하기 전에 LPM에 필수 인 somites에서 RA 너무 포인트를 다음과 사지 버드 개시의 구조를 촉진. 이러한 기술은 사지 개발에 더 질문뿐만 아니라 척추 동물 배아의 다른 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌, 눈과 트렁크의 분야 적합 할 것으로 보인다.

고전 발생 학자들은 전통적으로 배아 발달을 조절하는 메커니즘을 심문하는 물리적 인 기술을 사용. 1960 년대와 1970 년대 연구자들은 배아 동안 유도 신호의 중요성을 보여주기 위해 개발 배아의 조직 사이에 삽입 불 투과성 장벽을 사용하는 기술을 개발했다. 우리의 관심은 사지 꽃 봉오리 가지를 앞에 어떤 이벤트 척추 사지 개발에 특히입니다. 예를 들어, 배리어 삽입는 반대측, 작동이되지 않는 측에서 정상적으로 진행시키면서 병아리 배아의 한쪽에 발생하는 사지 싹 생장을 방지 할 수있다. 이러한 장벽을 변화하기 위해 사용 재료; 예를 들어, 운모 판 (1) 및 탄탈륨 호일이. 이 장벽은 효과적으로 somites에서 사지 꽃 봉오리 형태, 근축 중배엽에서 형성되는 측면 판 중배엽 (LPM)를 분리합니다. 외과 이식 기술은 가까운 관계 위트를 보여사지 꽃 봉오리 개시가 LPM 3 사에서 발생하는 경우 시간이 somites이 필수적이다. 80 년대와 90 년대에 발달 생물 학자들은 발달 과정을 조절하는 필수적인 신호 분자 확산을 발견했다. 이러한 신호 전달 분자와 적신 비즈는 배아의 특정 지역에 이식 및 배아 발달에 변화를 생성 할 수 있습니다. 병아리 배아 주입 및 숫자 5의 거울상 중복을 생성 할 때, 예를 들어, 이온 교환 비드 차지하는 레티노 산 (RA)가 24 시간에 걸쳐 방출된다. FGF 단백질을 함유 헤파린 아크릴 구슬은 interlimb의 LPM 6에서 사지 꽃 봉오리 가지를 시작할 수 있습니다. 최근에 마우스와 물고기 유전학 (7 검토) 새로운 시대로 척추 사지 개시의 연구를 수행하고있다. 사지 싹 개시 전의 somites에서 RA 존재는 LP에 필요한 필수적인 확산 신호 인 것이 좋은 증거가있다M은 사지 신진를 시작합니다. 우리는 사지 꽃 봉오리 개시시 주변의 LPM에서 유전자 발현에 장벽 주입의 효과를 해부하는 병아리 배아의 접근성과 실험 견고성을 악용하고 싶었다. 우리의 방법의 새로운 적응은 장벽을 결합하는 것입니다 장벽에 의해 차단 된 외생 적 공급 후보 내생 적 요인 장벽에 비드 배치 측면과 축 조직에서 블록 신호. 다음 프로토콜은 사지 봉오리 유도 및 개시의 메커니즘을 애타게하기 위해 개발 된 것들이다. 사지 꽃 봉오리 개시를 공부하는 것은 초기 단계의 배아를 사용하는 것을 의미한다. 먼저 피하 주사 바늘로 공기 주머니를 통해 알부민의 일부를 제거하여 많은 연구자 창 닭고기 달걀. 노른자의 상단에 놓여 배아는 다음 계란에 낮은 거짓말을합니다. 이는 전기 일부 기술에 대한 장점이지만, 배아 수술 조작을 원하는 경우 단점이 될 수있다.가능이 장점으로 우리는 계란의 구멍에 가까운 배아를 갖는 찾을 수 있습니다. 질문은 척추 동물의 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 제어하는 ​​신호에 대한 남아 다음과 같은 프로토콜은이를 해결하기 적합하다. 우리는 초기 단계 (12) (8)보다 단계에서 병아리 다리 버드 파생물을 방지하기 위해 장벽의 삽입을위한 프로토콜을 개발하는 첫 번째입니다. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 primordium가 유도되는에 접근 유도부 조직이 인접한 자리하고있는 곳 기원과 유도 단서의 타이밍에 다른 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 다음 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장 유도 뇌 발달 축 확장 가능성이 장기 개발에서 발견 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="926">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dumont No.5 watchmakers forceps, x2&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td style="width:149px;">11251-20</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.4 watchmakers forceps, x2&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont strong forceps, type AA&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11210-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved scissors with blades 2.5 cm long</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt ended curved forceps,&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ends approx 0.5 cm long</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steel pin, 0.2 mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharpening stone, square</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear tape, 50 mm x 66 m</td>
			<td>www.5staroffice.com</td>
			<td align="right">295985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF4 protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Cliff Tabin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">all-trans-retinoic acid</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Remember to protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BMS 493</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>B6688-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade No. 15</td>
			<td>www.swann-morton.com</td>
			<td>cat no. 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>153-7301</td>
			<td>Beads for delivering protein.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AG1-X2 Ion exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>140-1251</td>
			<td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator for eggs</td>
			<td>Memmert&#160; www.hce-uk.com</td>
			<td>LAB128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>Harmful, irritant, corrosive.&#160; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco&#160; www.thermofisher.com</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160; webshop.fishersci.com</td>
			<td>D/4121/PB08</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;&#160; www.leica-microsystems.com</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Replaced by M60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chicken eggs</td>
			<td>Henry Stewart &#38; Co Ltd&#160;&#160; sales@medeggs.com</td>
			<td></td>
			<td>Brown Eggs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

병아리 배아은 직접 방식으로 개발 질문을 해부하는 데 사용할 수있는 최상의 척추 동물 모델을 제공합니다. 수술 적 치료 다음의 접근성과 안정성이 중요한 실험의 강점이다. 운모 판 병아리 사지 싹 개시 한 것을 방지하기 위해 사용되는 제 장벽이었다. 날개 꽃 봉오리 또는 다리 꽃 봉오리 유도 또는 개시에 불 투과성 장벽으로 알루미늄 호일을 사용하여 프로토콜 설명한다. 우리는 장벽에 의해 차단 된 공급 후보 내생 적 요인을 외생하는 장벽에 비드 배치 측면과이 기술을 결합합니다. 결과는 다음 유전자 발현 원위치 혼성화에 사용하여 분석된다. 우리의 주요 초점은 유도에서 레티노 산 신호와 병아리 배아 앞과 뒷다리 이후 개시의 역할이다. 우리는 BMS (493) 사용 (레티노 산 수용체의 역작용을 (RAR)) 측면 판 중배엽 (LPM) 이식 불린 비드 바의 영향을 모방rier somites (레티노 산의 소스 (RA)) 및 사지 싹이 자라는에서 LPM 사이에 위치. 이러한 프로토콜의 수정 된 버전은 또한 유도 큐의 기원 및 다른 시점에 질문을 해결하기 위해 사용될 수있다. 병아리 배아의 지역 관련 개발 단계에서 액세스 제공, 장벽은 공부 두 조직 및 개발 결과의 변화 사이에 배치 될 수있다. 예를 들면, 간 또는 신장의 유도로, 현상 뇌 축 확장 및 개발 기관에서 발견 될 수있다.

위에서 설명한 프로토콜은 니시 모토 등의 알에 사용 된 방법을 설명합니다. 2015 년 논문은 전면과 병아리 배아의 뒷다리 모두 사지 꽃 봉오리 유도 및 개시를 연구합니다. 앞다리 새싹의 생장을 방지하기 위해 불 침투성 장벽의 삽입 다음과 같은 결과는 이전 1, 2, 9을 발표되었지만 다리 버드 개시 1을 방지 단 하나의 연구 기술 장벽이되고있다. 니시 모토 등의 알에서 뒷다리 데이터입니다. 2015 년은 장벽 삽입 다음 mRNA 발현의 연구의 대표적인 결과로 여기에 표시됩니다. LPM에서 Tbx4 표현은 뒷다리 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 : 도 2B와 C (표 2) 단계 15 (그림 2A)에서 그 장벽 삽입을 보여 모두 Fgf10 리드 (프로토콜 3.2 참조)및 Fgf8 표현은 운영 오른쪽에 (괄호로 표시) 다리 새싹 지역의 결석. 작동이되지 않는 왼쪽 비교. 그러나 Tbx4 식은 조작 측 (도 2D 및 E)의 양 단 (19)과 스테이지 (23)에서 관찰된다. 우리는 혼자 Tbx4 표현은 LPM에서 사지 파생물을 시작하기에 충분하지 않습니다 결론 지었다. 병아리의 다른 연구 TBX 유전자 발현은 앞다리 봉오리 형성 (12, 13)을 개시하기에 충분한 것을 제안했다. 도 2c는 &#39;장벽이 배아 포스트 고정의 다리 부분에 새겨 져 보이는 방법을 설명하기 위해 포함되어 있습니다. 경우 장벽의 대부분에서 사전 현장 하이브리드 (프로토콜 4.3)의에 제거 하였다. Somites에서 RA는 Fgf10 유도 사지 버드 O 전에 LPM 필수적이다utgrowth : 도 3A는 스테이지 (15) (프로토콜 3.2.1.3)에 삽입 배리어에 RA 침지 비드 선단부의 추가를 나타내는 개략도이다. (별표로 표시)이 작업 사지 꽃 봉오리 가지가 컨트롤 왼쪽에있는대로 봉오리로 표현되는 동작 오른쪽과 Tbx4, Fgf10 및 Fgf8에 관찰 이후 (그림 3B, C 및 D, 표 2) . 따라서, LPM에 RA를 첨가 배리어 사지 싹 개시 진행의 효과를 극복한다. 우리는 사지 꽃 봉오리 가지가 시작되기 전에 somites에서 정상적인 개발 RA의 LPM에 필수적이라고 결론 지었다. 얻어진 사지 싹은 제어 측보다 일반적으로 작다. 이 LPM은 야생형 상황에 해당하지 인에서 RA 용량 때문일 수 있습니다. 적경 용량이 너무 높으면 꼭대기 외배엽 릿지 (AER)를 짧게 할 수 있고 작은 싹 초래14, 15. LPM에서합니다 (somites에서) 그 RA를 확인하는 것은 정상적인 사지 꽃 봉오리 개시 RAR, BMS (493)의 역작용 필요, 사용되었다. 비즈 스테이지 (15)의 다리 지역 LPM에 주입된다 (그림 3E)을 (프로토콜 3.2.1.4 참조). Fgf10 식 제어 측 (표 3도 3f)에 비해 작은 사지 싹 결과 493 비즈 LPM에서 BMS의 다음 프로그램을 하향 조절한다. 제어 DMSO 비즈는 이러한 결함 (표 3도 3G 및 3H)를 발생하지 않습니다. BMS (493) 애플리케이션에 따라 관찰 된 결함은 배리어 조작에 의한 것보다 온화한; 즉,이 Fgf10 여전히 표현과 사지 싹이 형성된다. BMS 493의 효과가 구슬 주위에 로컬로 제한되며, AXI에 의해 생성 된 모든 RA를 적대시하지 못할 수 있기 때문 될 가능성이 높습니다등 조직. 조기 축 신호는 나중에 Tbx4 급행 LPM 셀을 지정합니다 : LPM은 미래의 다리 형성 영역에서 Tbx4을 표현하는 능력을 획득 할 때 우리는 시험했다. 장벽 이후 다리 버드 파생물을 차단하는 것 삽입 할 수있는 초기 단계는, 우리는 무대보다 이전 단계에서 근축 중배엽 및 추정 다리 사이에 삽입 (12) 장벽 장벽을 삽입하는 프로토콜을 개발 최초로 단계 10입니다 스테이지 (10)에 LPM은 스테이지 (10)의 축선 조직에서 신호의 이상 발현을 위해 필요하다는 것을 시사 블록 레그 봉오리 형성 레그 형성 LPM을에 Tbx4의 발현 (도 2F 및 2G, 표 2) (프로토콜 34 참조) 뒷다리 LPM에서 Tbx4. 나중에 장벽 삽입 Tbx4 식을 수도 2D 및 E와이 결과를 비교설립합니다. 또한, 우리는이 축 신호가 RAR의 역작용이 Tbx4 발현을 저하 여부를 관찰하여 RA가 될 수 있는지 여부를 테스트했다. 스테이지 (10) (프로토콜 3.4.1.3 참조)에서 뒷다리 LPM에 배치 BMS 493 비드 DMSO에 배어 제어 비즈 Tbx4 식 (도 2J 및 2K)에 영향을주지 않는 반면, Tbx4 식 (그림 하반기 및 2I)을 downregulates. 함께, 이러한 결과는 축 조직에서 RA 신호가 긍정적으로 뒷다리 LPM 7 Tbx4을 조절함으로써 사지 유도를 조절하는 모델을 지원합니다. 수술 후 죽음 : 표 1, 2 및 3에 게시 작업 수확 전에 사망 병아리 배아의 개수를 포함한 실험 결과의 세부 사항을 제공한다. 일부 사망이 자연 미세 후 예상하여야한다. 숫자의 죽음은 유지 될 수있다<html> 악기가 깨끗한 지 확인함으로써 최소로, 계란의 구멍은 배아이 마지막 지점 운영과 함께, 최소한의 시간에 대한 접착 테이프 인감의 보호없이 왼쪽되어, 최소 크기 필요하다 가능한 빨리 수행된다. 이러한 작업 중에 아주 많은 시간이 소요되지만 구슬과 장벽을 포함하는 작업이 좀 더 시간이 걸릴 수 없습니다. 이러한 조치에도 불구하고, 작업은 초기 단계에서 수행과 날개 지역의 사람들은 사망을 초래할 가능성이 더 높습니다. 죽음으로 인한 혈액 손실로 이어질 수있는 사지 형성 지역과 이들 선박의 사고 파열 주변의 큰 혈관이 있습니다. 우리는 계란 누구의 배아에 작동되지 않은, 종종 그 다음날에 의해 죽을 것이다 단계 8 또는 9에서 열 것을 찾을 수 있습니다. 따라서이 문제의 유일한 해결책은 실험의 높은 숫자를 수행하는 것입니다. D / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; 추정 다리 수준에서 배리어 또는 구슬 삽입을 다음 그림 2. 마커 유전자 발현의 변화. (A) 단계 15 배아의 추정 다리 레벨 (somites 26-32)에서 도식 보여주는 장벽 위치 (녹색 선). (B - E 및 G) 운영 배아에 위시 분석. 다리 지역 (괄호)에 설명되어있다. (B) Fgf10 식은 작동 LPM에 존재하지만 강력한 발현 왼쪽 뇌에서 검출된다. (C) Fgf8 발현은 AER이없는 암시 상기 구동 측 부재. (C &#39;) 장벽이 제거되기 전에 동일한 배아. (D)은 제어 Tbx4 새싹 같은 rostro - 꼬리 LPM 수준에서 표현된다. (E) Tbx4 발현 사지 성장의 부재에도 불구하고 오른쪽 다리 영역에 유지된다. (F) 단계의 개략도<html> 추정 적 다리 수준에서 차단 위치 (녹색 선)를 보여주는 10 병아리 배아. (G) Tbx4 표현식은 운영 오른쪽 LPM (브라켓)에 존재하지 않는다. (H)를 추정 다리 수준에서 BMS 493 비드 위치 (보라색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도. (I) Tbx4 식 BMS 493 (J) 제어 DMSO 비드 위치 (회색 원)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도 치료 다음 운영 오른쪽에 하향 조절된다. (K) Tbx4 단독 DMSO로 처리 추종 제어 좌측과 유사한 수준에서 작동 오른쪽에 표시된다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> D / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. RA 구출 사지 버드의 부재는 배리어 삽입에 의한과 다리 버드 파생물에 앞서 LPM에서 필수입니다. (A)를 추정 다리 레벨 (somites 26-32)와 RA-적신 비드 (빨간색 원)에서 차단 위치 (녹색 선)를 나타내는 개략도. (B - D) (별표로 표시) RA 구출 다리 꽃 봉오리 가지. (B) Tbx4 발현은 수술하지 않은면에 동일한 구조의 다리 뇌에 존재한다. (C) Fgf10은 구출 다리되지 않은 운영 측면과 유사한 꽃 봉 오리 표현된다. (D) Fgf8는 구출 오른쪽 다리 버드의 AER 표현된다. BMS 493 비즈 (보라색 원)가 단계 15 배아의 추정 다리 LPM에 배치 된 위치 (E) 도식을 나타낸다. (F) Fgf10 표현은 운영 오른쪽에 하향 조절하고 다리 새싹 작은 다음과 BMS 49입니다(3) 치료. 비즈는 * 표입니다. 제어 DMSO 비드 (회색 원)의 위치를 나타내는 (E) 내지 (G) 유사 개략도. (별표로 표시) (H) DMSO 비즈 Fgf10 표현이나 다리 봉오리의 크기에 영향을 미치지 않았다. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * </td><td> 수 운영 </td><td> 날개없는 ** </td><td> 윙 본 ** </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 14 </td><td> (40) </td><td> (24) </td><td> 1 </td><td> (15) </td></tr><tr><td> 단계 8/9 </td><td> (65) </td><td> (23) </td><td> 0 </td><td> (42) </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 13 (FGF4 비드) </td><td> (41) </td><td> 7 (비드 누락) </td><td> (17) </td><td> (17) </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 13 (RA 비드) </td><td> (75) </td><td> 9 (비드 누락) </td><td> (32) </td><td> (34) </td></tr><tr><td> 스테이지 (13) (제어 비드) </td><td> (5) </td><td> 삼 </td><td> 0 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="5"> * somites 15 ~ 20과 측면 판 중배엽 사이에 위치 0.7-1 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO 제어 비드. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 병아리 배아 고정 단계 21-23 </td></tr></tbody></table> 표 1. 윙 레벨 장벽과 구슬 실험 성과. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 스테이지 장벽 배치 (+ 비드) * </TD&gt; <td> 수 운영 </td><td> 다리 누락 ** </td><td> 다리 본 ** </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> 스테이지 12 ~ 15 </td><td> (43) </td><td> (39) </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 무대 10/11 </td><td> (23) </td><td> (16) </td><td> 0 </td><td> (7) </td></tr><tr><td> 스테이지 15 (FGF4 비드) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> (5) </td><td> 삼 </td></tr><tr><td> 스테이지 15 (RA 비드) </td><td> (18) </td><td> 0 </td><td> (18) </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * somites 26-32과 측면 판 중배엽 사이에 0.7-1.3 mm 박 장벽. 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 비드. 0.05-0.1 ㎎ / ㎖의 RA 구슬. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 병아리 배아 고정 단계 18 ~ 24 </td></tr></tbody></table> 표 2. 다리 레벨 장벽과 구슬 실험 성과. <table bor데르 = &quot;1&quot;FO : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 수 운영 </td><td> 다리는 작은 꽃 봉오리 </td><td> 다리가 약간 작은 꽃 봉오리 </td><td> 다리 새싹 정상 크기 </td><td> 번호 죽은 </td></tr><tr><td> BMS 493 구슬 * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (15) </td><td> (12) </td><td> 삼 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO 비즈 ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (12) </td><td> 0 </td><td> 삼 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 5 밀리그램에 담가 2 ~ 3 구슬 / ㎖ BMS 493 다리의 수준에 적절한 단계 14 ~ 15 LPM에 위치. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO에 배어 ** 2-3 구슬 혼자 다리의 수준에 적절한 단계 15 LPM에 위치. </td></tr><tr><td colspan="5"> 병아리 배아 단계에서 고정 (1)7-19. </td></tr></tbody></table> 표 3. 다리 레벨 BMS 493 구슬 실험 성과.

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K 조회수.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

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Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

수축 성 활동 유도 된 쥐 골격 근육 Phenotypic 적응 연구 만성 자극에의 응용

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...