This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

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The authors declare they have no competing financial interests.

Wir beschreiben die Verwendung von undurchlässigen Barrieren Extremitätenknospe Bildung im Hühnerembryo zu verhindern. Diese Technik hat eine Anzahl von kritischen Schritte. Nach Vorversuchen haben wir festgestellt , dass die Scharnierförmigen verwendet Barrieren in 9, 10 bleiben an Ort und Stelle im Embryo weit besser als gerade Barrieren. Das distale flache Seite der Barriere hält sich an die Dotterhaut und hält die Barriere in Platz (2C &#39;). Eine sorgfältige Vorbereitung des Scharniers förmigen Barrieren aus Aluminiumfolie als 1,6 in Protokollschritt beschrieben ist für den Erfolg der Operation von wesentlicher Bedeutung. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, um sicherzustellen, dass Eier nicht zu aus dem Inkubator gelassen lange Fensterung folgenden und auf den Embryo vor dem Betrieb Staging. Nach unserer Erfahrung überleben Embryonen eine Operation besser, wenn sie bei oder nahe Inkubationstemperatur sind, wenn die Operation durchgeführt wird. Operationen sollte daher so schnell wie möglich durchgeführt werden, und die Eier wieder verschlossen promptly gute Überlebensraten zu gewährleisten. Viele Forscher einen Tropfen von Antibiotika auf den Embryo Mikrochirurgie folgende bevor die Eier in den Inkubator zurück. Das Vorhandensein der Flüssigkeit verhindert die Barrieren Ankleben gut in Position. Die Zugabe von Antibiotika könnte auch Perlen nach der Platzierung entfernen. Daher keine Antibiotika, schnelle Operationen und gute Sauberkeit mit Instrumenten wird empfohlen, um Infektionen zu vermeiden. nach jeder Stufe einer Operation Instrumente mit 70% Ethanol Abwischen ist ein wesentliches Instrument, um zu verhindern klebrig vom Kontakt mit der Dottermembran, die beide Barrieren oder Kügelchen dazu führen können, Zange zu halten (Protokoll Schritt 3.1.2.2 sehen). Beide Sorten von Perlen verwendet werden könnten, nach der Operation fehl am Platz fallen. Wenn die Barriere Position am nächsten Tag geprüft wurde, war es nicht möglich, durch die Barriere, um zu sehen, um festzustellen, ob die Perle an Ort und Stelle oder nicht geblieben. In Fällen, in denen der Wulst hatte Flügel Knospe Auswuchs überworfen wurde nicht gerettet ( <strong&gt; Tabelle 1). Vermeiden mit dem Wulst übertragen Flüssigkeit, wenn sie das Implantieren bedeutet, dass Perlen leichter auf die Schnittfläche des LPM-Stick (siehe Protokoll 2.3.2.3). Schließlich gewährleistet, dass Embryonen sofort behoben werden nach der Ernte gut nachfolgende Genexpressionsanalyse kritisch ist (Protokoll Schritt 4.2). Dieses Protokoll ändert veröffentlichte Experimente zuvor die Barrieren verwendet Extremitätenknospe Einleitung definiert für Barrieren spezifische optimale Breite und stellt Barriere und Perlen Platzierung durch Genexpressionsanalyse gefolgt Kombination zu verhindern. Wir fanden herkömmliche Aluminiumfolie, die billig ist und ohne weiteres in allen Labors verfügbar, produziert Ergebnisse gleich denen, die vorher Tantalfolie verwendet. Die Folie kann im Embryo gelassen werden , wenn in situ - Hybridisierung (2C &#39;) Ausführung aber wir es in der Regel entfernt werden, wenn mehr als ein Embryo verarbeitet wird, um die scharfen Kanten der Folie zu verhindern Embryonen zu beschädigen. Pilot Studien zeigten, dass die Breite der Beinbereich Barrieren besonders wichtig ist. Zunächst trialed die Barrieren waren zu kurz und Beinknospe Auswuchs wurde nicht verhindert. 1,2-1,3 mm ist die optimale Breite für eine Barriere vollständig Bein Knospe Auswuchs zu blockieren. Die engste Flügel Barrieren, die eine genau platzieren können Knospe Auswuchs geben die besten Überlebensraten zu verhindern. Dies kann so schmal wie 0,5-0,7 mm betragen. Allerdings Barrieren, die ein wenig breiter sind eher in vollständige Blockierung der Flügel Knospe Auswuchs zu führen, weil sie für eine kleine Ungenauigkeit der Platzierung ermöglichen (wir 0,7-1 mm) verwendet. Vermeidung von Blutgefäßen bei der Einschnitt ist für Flügel Knospe Ebene Barrieren kritisch. Semipermeable Barrieren wurden zuvor verwendet worden, um die Küken Gliedmaßenknospe zu halbieren. MacCabe und Parker, 1976 Summerbell 1979 beide verwendeten Filter von 0,45 um und 0,8 um Porengrße, jeweils 16, 17. Sie berichteten , dass diffundierbare Signale durch die Poren in den Filtern passieren kann und dassGegenwart und einer mit einer undurchlässigen Tantalfolie Barriere gewonnenen Ergebnisse mit semipermeable Barrieren ohne Barriere zwischen einer Gliedmaßenknospe auf halbem Weg waren. Dieses Protokoll könnte semipermeable Barrieren unterschiedlicher Porengröße Kandidatensignale zu unterscheiden auf Umfang zu nutzen angepasst werden, oder die Dynamik der Signal Diffusion zu modifizieren. Dieses Protokoll hat verschiedene Einschränkungen vor allem mit dem Modellorganismus selbst verbunden sind. Solche Techniken könnten weitere Fragen in der Extremitätenentwicklung und auch andere Fragen der wirbel Embryonalentwicklung zu sondieren verwendet werden. Eine Bedingung ist, dass das Organ / fragliche Gebiet entwickeln sollte, wenn der Hühnerembryo zugänglich Intervention ist. Das Vorhandensein von großen Blutgefäße in dem Bereich, wo eine Barriere platziert werden muss, macht Barriere Platzierung später als Stufe 13 oder 14 technisch anspruchsvoll. Wenn große Blutgefäße während der Barrieren Platzierung geschnitten werden kann dieser Embryo Sterblichkeit verursachen. Unsere Untersuchung , wenn die Transkriptionsfaktoren TBX5 und TBX4 werden zuerst in der LPM induziert wurde von der frühesten Phase begrenzt , mit der wir eine Schranke setzen könnten , die später gegenüber jeweils entweder den Flügel oder Schenkel Knospe enden würde. Es könnte erhellend sein , um zu versuchen Tbx Genaktivierung in früheren Stadien, näher an der Gastrulation zu blockieren. Die früheste eine Barriere erfolgreich in der vermutlichen Flügelbereich platziert werden konnte, war die Stufe 8 und im Beinbereich Stufe 10. Dieses Protokoll ist wahrscheinlich für die Untersuchung von Genexpression über Extremitätenknospe Stufen nicht geeignet, da anschließende schnelle Wachstum der Barriere und die Ergebnisse verdrängen würde würde nur in die Ausgangsstellung der Barriere beziehen. Nachdem die Grenzen des Hühnerembryos in diesem Zusammenhang seine Vorteile gegenüber anderen Wirbelmodellorganismen Zusammenhang sind viele. Hühnerembryo ist ein sehr geeignetes Tiermodell für diese Art der physischen Eingriff in einem Vertebraten embryo. Die Embryos sind relativ groß und sind leicht zugänglich through die Eischale. Man kann sich für weitere Experimente für den Embryo zurückkehren (zB die Entnahme einer Wulst 18 oder sogar eine Barriere) oder über die Fortschritte zu überprüfen , indem einfach das Band Fenster zu entfernen. Es ist möglich, Umfang Live-Bildgebung oder Zeitraffer-Bildgebung aufzunehmen. Wir beschreiben eine Methode von Hühnereiern Windowing, die besonders zum Betrieb auf Embryonen im Frühstadium geeignet ist. Im Fall der Extremität Studien ist es sehr wichtig und hilfreich, dass es eine kontralaterale Extremität Steuer für jedes Experiment, das für jede biologische Replikation als ideale interne Kontrolle dient. Die Kombination undurchlässige Barrieren der Verwendung von Extremitätenwachstum und Perlen in Signalmoleküle durchtränkt zu verhindern ist bisher nicht berichtet worden. Unsere Analyse der mRNA-Expression solcher Interventionen finden Sie ebenfalls neu. Diese Techniken konnten wir das schwierige Problem der zu sezieren , wenn Gliedmaßen spezifische Transkriptionsfaktoren Tbx5 und TBX4 sind in der LPM induziert und auchnicht ausreichend für die Aktivierung der Transkription FGF10 und dem Beginn der Extremitätenknospe Auswuchs zu zeigen , dass später vor bud Initiation Extremität, ist die Anwesenheit dieser Gene in Tbx der LPM. Figuren 2G, 2D und 2E diese Ergebnisse gut illustrieren. Das Fehlen von TBX4 Ausdruck nach dem Einsetzen einer Barriere in der Stufe 10 in Figur 2G ist im krassen Gegensatz zu ihrer Präsenz in 2D und 2E folgenden Barriere Einsetzen in Stufe 15, nach der Induktion von TBX4. Die Implantation von RA getränkten Kügelchen erleichtert die Rettung von Extremitätenknospe Einleitung folgende Barriere Einsetzen und so Punkte zu RA aus den Somiten wesentlich in der LPM ist vor Extremitätenknospe Auswuchs beginnen kann. Solche Techniken könnten weitere Fragen in der Extremitätenentwicklung, sondern auch andere Fragen der wirbel Embryonalentwicklung zu lösen verwendet werden. Bereiche des Gehirns, der Augen und des Rumpfes sind wahrscheinlich geeignet sein.

Klassische embryologists traditionell physikalische Verfahren eingesetzt, um die Mechanismen zu steuern Embryonalentwicklung zu befragen. In den 1960er und 1970er Jahren Forscher entwickelten Techniken, die undurchlässige Barrieren zwischen den Geweben des sich entwickelnden Embryo eingeführt verwendet, um die Bedeutung der induktive Signale während der Embryonalentwicklung zu demonstrieren. Unser Interesse ist es in wirbelGliedmaßenEntwicklung und insbesondere, welche Ereignisse Gliedmaßenknospe Auswuchs vorangehen. B. Insertion einer Barriere kann Extremitätenknospe Auswuchs von dem Auftreten auf einer Seite des Hühnerembryos verhindern, während ermöglicht es normalerweise auf der kontralateralen, nicht operierten Seite fortzufahren. Materialien verwendet, um diese Barrieren vielfältig zu machen; beispielsweise Glimmerplatten 1 und Tantalfolie 2. Diese Barrieren effektiv trennen die Seitenplatte Mesoderm (LPM), aus dem die Gliedmaßenknospe Formen, von den Somiten vom paraxialen Mesoderms gebildet. Chirurgische Pfropfungstechniken zeigen, dass die enge Verbindung Witzh die Somiten ist wichtig , wenn Gliedmaßenknospe Initiation in der LPM 3 4 auftritt. In den 80er und 90er Jahren Entwicklungsbiologen entdeckt diffusionsfähige Signalmoleküle, die bei der Kontrolle der Entwicklungsprozesse wesentlich sind. Perlen getränkt mit dieser Signalmoleküle können in bestimmten Regionen des Embryos implantiert werden und produzieren Veränderungen der embryonalen Entwicklung. Zum Beispiel, aufgenommen Retinsäure (RA) durch Ionenaustauscherkörner wird über einen Zeitraum von 24 Stunden freigesetzt wird, wenn in einem Hühnerembryo implantiert und kann spiegelbildlichen Verdoppelung der Ziffern 5 produzieren. Heparin akrylperlen FGF - Protein enthalten , können Gliedmaßenknospe Auswuchs aus dem interlimb LPM 6 einzuleiten. In jüngerer Zeit Maus und Fisch Genetik haben die Untersuchung der wirbel Extremität Einleitung in eine neue Ära ( zusammengefasst in 7) entnommen. Es gibt gute Hinweise, dass RA, die in den vorherigen Somiten zu Gliedmaßenknospe Initiation ist das wesentliche diffusionsfähig Signal von der LP erforderlichM Glied Austrieb zu initiieren. Wir wollten die Zugänglichkeit und experimentelle Robustheit des Hühnerembryos zu nutzen, um die Wirkung der Barriere Implantation auf die Genexpression in der LPM um die Zeit der Extremitätenknospe Einleitung zu sezieren. Eine neuartige Anpassung unserer Methode ist, eine Barriere, die Blöcke Signale von axialen Gewebe mit Wulst Platzierung seitlich an der Barriere zu exogen Versorgung Kandidaten endogene Faktoren zu kombinieren, die durch die Barriere blockiert wurden. Die folgenden Protokolle sind diejenigen entwickelt, um die Mechanismen der Extremitätenknospe Induktion und Einleitung herauszukitzeln. Gliedmaßenknospe Einleitung Studieren bedeutet frühen Stadium Embryonen. Viele Forscher Fenster Hühnereier, indem zuerst mit einer Injektionsnadel etwas von dem Albumin durch den Luftsack zu entfernen. Der Embryo, die auf der Oberseite des Dotters liegt, liegt dann tiefer in das Ei. Dies ist ein Vorteil für einige Techniken, wie Elektroporation, kann jedoch ein Nachteil, wenn chirurgische Manipulation des Embryos sein, erwünscht ist.Wir finden, die den Embryo als nahe der Öffnung in dem Ei wie möglich ein Vorteil ist. Fragen bleiben die Signale in Bezug auf die wirbelGliedmaßenKnospe Induktion und die Einleitung und die folgenden Protokolle sind geeignet zu steuern, um zu adressieren. Wir sind das erste , ein Protokoll für die Einführung von Barrieren zu entwickeln Küken Gliedmaßenknospe Auswuchs in einem Stadium , früher als Bühne zu verhindern 12 8. Modifizierte Versionen dieser Protokolle könnten auch über den Ursprung und den Zeitpunkt der induktive Signale zu adressieren andere Fragen verwendet werden, wo eine leicht zugängliche Induzierung Gewebe liegt angrenzend an das primordium induziert wird. Vorausgesetzt, der Bereich des Embryos in der entsprechenden Entwicklungsstadium zugänglich ist, dann kann eine Barriere zwischen den beiden Geweben und damit Veränderungen in der Entwicklung untersucht platziert werden. Beispiele sind in der Entwicklung des Gehirns, Achserweiterung und möglicherweise Organentwicklung wie Leber oder Niere Induktion gefunden werden.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

Der Hühnerembryo bietet eine hervorragende wirbelModell, das verwendet werden kann, Entwicklungs-Fragen auf direktem Weg zu sezieren. Die Zugänglichkeit und Robustheit nach einem operativen Eingriff sind wichtige experimentelle Stärken. Mica Platten waren die ersten Barrieren verwendet Küken Gliedmaßenknospe Einleitung 1 zu verhindern. Protokolle, die Aluminiumfolie als undurchlässige Barriere für Flügel Knospe oder Bein Knospe Induktion und oder Initiierung verwenden beschrieben. Wir kombinieren diese Technik mit Wulst Platzierung seitlich an der Barriere zu Versorgung Kandidaten endogene Faktoren exogen, die durch die Barriere blockiert wurden. Die Ergebnisse werden unter Verwendung von in situ Hybridisierung von nachfolgenden Genexpression analysiert. Unser Schwerpunkt liegt auf der Rolle der Retinsäure-Signalisierung bei der Induktion und später Einleitung des Hühnerembryos nach vorne und hinteren Gliedmaßen. Wir verwenden BMS 493 (ein inverser Agonist von Retinsäure-Rezeptoren (RAR)) getränkten Kügelchen in der Seitenplatte implantiert Mesoderm (LPM) der Wirkung einer Stange zu imitierenRier zwischen den Somiten (Quelle von Retinsäure (RA)) und der LPM platziert, von dem Extremitätenknospen wachsen. Modifizierte Versionen dieser Protokolle könnten auch über den Ursprung und den Zeitpunkt der induktive Signale zu adressieren andere Fragen verwendet werden. Vorausgesetzt, der Bereich des chick embryo ist an dem betreffenden Entwicklungsstadium erreichen könnte eine Barriere zwischen den beiden Geweben und damit Veränderungen in der Entwicklung untersucht platziert werden. Beispiele können in der Entwicklung des Gehirns, Achserweiterung und in der Organentwicklung, wie Leber oder Niere Induktion gefunden werden.

Das Protokoll detailliert beschreibt über die in Nishimoto et al angewandten Methoden. 2015. Das Papier untersucht Gliedmaßenknospe Induktion und Initiierung sowohl in der vorderen und hinteren Gliedmaßen des Hühnerembryos. Folgende Ergebnisse der Einführung von undurchlässige Barrieren das Auswachsen der forelimb Knospe zu verhindern , wurden bisher 1, 2, veröffentlicht 9 , aber es hat nur eine Studie beschreibt Barrieren verhindern Bein Knospe Einleitung 1 gewesen. Hindlimb Daten von Nishimoto et al. Werden 2015 hier als repräsentative Ergebnisse der Studie von mRNA-Expression nach Schranke Insertion. TBX4 Expression in der LPM ist nicht ausreichend hindlimb Auswuchs zu initiieren: Die 2B und C (Tabelle 2) zeigen , dass die Barriere Einfügung in der Stufe 15 (2A) (siehe Protokoll 3.2) führt sowohl zu FGF10und Fgf8 Expression , während es in der Beinknospe Region fehlt (bezeichnet mit Halterung) auf der operierten rechten Seite. Vergleichen Sie mit dem nicht operierten linken Seite. Jedoch ist TBX4 Ausdruck sowohl auf Stufe 19 und Stufe 23 auf der operierten Seite (2D und E) beobachtet. Wir schließen , dass TBX4 Expression allein nicht ausreicht, hindlimb Auswuchs aus dem LPM einzuleiten. Andere Studien im Küken haben vorgeschlagen , dass Tbx Genexpression ausreichend ist forelimb Knospenbildung 12, 13 zu initiieren. 2C &#39;ist eingeschlossen , um darzustellen , wie eine Barriere im Beinbereich des Embryos Post Fixierung eingebettet sieht. In der Mehrzahl der Fälle Barrieren wurden vor der in situ - Hybridisierung (Protokoll 4.3) entfernt werden . RA aus den Somiten Is Essential in der LPM vor FGF10 induziert Gliedmaßenknospe Outgrowth: 3A ist eine schematische Darstellung der Zugabe eines RA getränkte bead distal Barriere bei Stufe 15 eingeführt (protocol 3.2.1.3). Im Anschluss an diesen Vorgang Extremitätenknospe Auswuchs (mit einem Stern bezeichnet) auf der operierten rechten Seite beobachtet wird und TBX4, FGF10 und Fgf8 im Keim ausgedrückt werden , wie sie in der Kontrolle der linken Seite (3B, C und D, Tabelle 2) sind . So Zugabe von RA zu dem LPM überwindet die Wirkung der Barriere und Gliedmaßenknospe Einleitung voranschreitet. Wir schließen daraus, dass in der normalen Entwicklung RA von der Somiten im LPM wesentlich ist vor Auswuchs Gliedmaßenknospe eingeleitet werden kann. Die resultierenden hindlimb Knospen sind im Allgemeinen kleiner als die auf der Steuerseite. Dies kann in der LPM ist nicht auf die Wildtyp-Situation entspricht der RA Dosis fällig. Wenn die RA-Dosis zu hoch ist, kann die Apikale Ectodermal Ridge (VRE) verkürzt werden und kleinere Knospen würde14, 15. Um diese RA bestätigen (aus den Somiten) in der LPM ist für den normalen Gliedmaßenknospe Initiierung erforderlich ein inverser Agonist von RAR, BMS 493, verwendet wurde. Perlen sind in den Beinbereich LPM im Stadium implantiert 15 (siehe Protokoll 3.2.1.4) (Abbildung 3E). FGF10 - Expression wird nach Anwendung von BMS 493 Kügelchen in der LPM, was zu kleineren hindlimb Knospen Vergleich zu der Kontrollseite (; Tabelle 3 3F) herunterreguliert. Kontrolle DMSO Perlen verursachen nicht diese Mängel (Figuren 3G und 3H; Tabelle 3). Die Defekte folgende BMS 493 Anwendung beobachtet wurden, sind milder als die durch eine Barriere Betrieb induziert wird; dh, FGF10 noch ausgedrückt und Extremitätenknospen gebildet werden. Dies ist wahrscheinlich, weil die Auswirkungen von BMS 493 um die Wülste lokal begrenzt sind und nicht in der Lage sein, all die RA von axi hergestellt antagonisierenal Geweben. Frühe Axial Signale der LPM Zellen an , die später TBX4 Express: Wir testeten , wenn der LPM seine Fähigkeit erwirbt TBX4 in der prospektiven Bein Bildungsregion zum Ausdruck bringen. Die früheste Stadium, in dem eine Barriere eingesetzt werden kann, die anschließend Bein Knospe Auswuchs blockieren, ist Stufe 10. Wir sind das erste ein Protokoll einfügen Barrieren in den Stadien früher als Stufe 12 Barrieren zwischen dem paraxialen Mesoderm und dem vermutlichen Bein eingefügt zu entwickeln LPM bei Stufe 10 (siehe Protokoll 3.4) block Beinknospenbildung und die Expression von TBX4 im Bein bildenden LPM (Figuren 2F und 2G, Tabelle 2), was darauf hindeutet , dass ein Signal von der axialen Gewebe in der Stufe 10 für die spätere Expression erforderlich ist , TBX4 in hindlimb LPM. Vergleichen Sie dieses Ergebnis mit den Figuren 2D und E , wo später Barriere Einfügen TBX4 Ausdruck erlaubtsich etablieren. Darüber hinaus haben wir getestet , ob diese axiale Signal RA könnte durch Beobachten , ob der inversen Agonisten von RAR TBX4 Ausdruck reduziert. Ein BMS 493 Perle in der hinteren Gliedmaßen LPM in der Stufe 10 angeordnet (siehe Protokoll 3.4.1.3) downregulates TBX4 Ausdruck (Figuren 2H und 2I), während die Kontrollkügelchen in DMSO getränkt haben keinen Einfluss auf TBX4 Ausdruck (Figuren 2J und 2K). Gemeinsam unterstützen diese Ergebnisse ein Modell , das ein RA - Signal von der axialen Gewebe durch positiv regulieren TBX4 in der hinteren Gliedmaßen LPM 7 Glied Induktion reguliert. Post-operative Tod: Die Tabellen 1, 2 und 3 geben Details der experimentellen Ergebnisse , einschließlich der Anzahl von Hühnerembryonen , die nach der Operation starb und vor der Ernte. Einige Todesfälle sind zu erwarten, nachdem die Mikro dieser Art. Die Zahlen Sterben kann gehalten werden<html> auf ein Minimum, indem sichergestellt wird, dass die Instrumente sauber sind, ist das Loch im Ei die Mindestgröße erforderlich, dass die Embryonen ohne den Schutz des Klebebands Dichtung für ein Minimum an Zeit und in Verbindung mit diesem letzten Punkt gelassen werden, dass der Betrieb wird so schnell wie möglich durchgeführt. Keiner dieser Vorgänge sind sehr zeitaufwendig, sondern Operationen Perlen und Barrieren nehmen Sie ein wenig mehr Zeit, beteiligt sind. Trotz dieser Maßnahmen sind Interventionen in den frühesten Stadien und die im Flügelbereich sind eher in den Tod zur Folge haben. Es gibt große Blutgefäße rund um die Schenkel bildenden Bereiche und der zufälligen Bruch dieser Schiffe zu Tod durch Blutverlust führen kann. Wir finden, dass Eier in der Stufe 8 oder 9 geöffnet, deren Embryonen wurden am nächsten Tag nicht operiert, wird oft sterben. Daher ist die einzige Lösung für diese Probleme eine hohe Anzahl an Experimenten durchzuführen. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Änderungen Abbildung 2. Marker Genexpression nach Barrier oder Wulsteindrücken bei Präsumptive Leg Ebene. (A) schematische Darstellung Sperrposition (grüne Linie) an den vermutlichen Bein Ebene (Somiten 26-32) in einer Stufe 15 Embryo. (B - E und G) WISH Analyse operierten Embryonen. Der Schenkelbereich skizziert (Klammern). (B) FGF10 - Expression ist in der betätigten LPM abwesend, aber robust Ausdruck wird in der linken bud detektiert. (C) Fgf8 Ausdruck ist in der operierten Seite nicht vorhanden, was darauf hindeutet , gibt es keine AER. (C &#39;) Das gleiche Embryo vor der Barriere entfernt wurde. (D) TBX4 in der LPM in der gleichen rostro-Schwanz- Ebene als Steuer Knospe ausgedrückt. (E) TBX4 Ausdruck wird in der rechten Beinbereich trotz Abwesenheit Extremität Wachstum aufrechterhalten. (F) Schematische Darstellung einer Stufe<html> 10 Hühnerembryo zeigen Barriere Position (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene. (G) TBX4 Ausdruck ist in der operierten rechten LPM (Halterung) fehlen. (H) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigt BMS 493 Wulstposition (lila Kreis) an der vermutlichen Bein Ebene. (I) TBX4 Ausdruck wird auf der operierten rechten Seite nach der Behandlung downregulated mit BMS 493. (J) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigt Kontrolle DMSO Wulstposition (grauer Kreis). (K) TBX4 wird auf einem ähnlichen Niveau auf der operierten rechten Seite zum Ausdruck gebracht , die der Kontrolle der linken Seite nach der Behandlung mit allein DMSO. Diese Zahl wurde von 7 modifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. RA Rettungen Gliedmaßenknospe Abwesenheit verursacht durch Barrier Insertion und ist wesentlich im LPM Vor Leg Bud Auswuchs. (A) Schematische Darstellung zeigt Sperrposition (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene (Somiten 26-32) und einer RA-getränkten Wulst (roter Kreis). (B - D) RA Rettungen Bein Knospe Auswuchs (durch ein Sternchen dargestellt). (B) TBX4 Ausdruck ist in der geretteten Bein Knospe ähnlich der un-operierten Seite. (C) FGF10 ist in der geretteten Bein ausgedrückt Knospe ähnlich der un-operierten Seite. (D) Fgf8 ist in der AER des geretteten rechten Bein Knospe zum Ausdruck gebracht. (E) Schematische anzeigt , wo BMS 493 Perlen (lila Kreise) in der vermutlichen Bein LPM von 15 Embryonen Bühne platziert wurden. (F) FGF10 Ausdruck wird auf der operierten rechten Seite nach unten reguliert und die Beinknospe ist klein folgende BMS 493 Behandlung. Perlen sind mit Sternchen gekennzeichneten. (G) Ähnliche Schaltplan (E), die die Position Kontrolle DMSO - Perlen (graue Kreise). (H) DMSO - Kügelchen (durch Sternchen dargestellt) hatte keinen Einfluss auf FGF10 Ausdruck oder Bein Knospe Größe. Diese Zahl wurde von 7 modifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bühnen Barriere platziert (+ Perle) * </td><td> Anzahl betrieben </td><td> Flügel fehlt ** </td><td> Flügel vorhanden ** </td><td> Anzahl tot </td></tr><tr><td> Stufe 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Stufe 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Stufe 12-13 (FGF4 Wulst) </td><td> 41 </td><td> 7 (Perle fehlt) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Stufe 12-13 (RA Wulst) </td><td> 75 </td><td> 9 (Perle fehlt) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Stufe 13 (Kontrollbead) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1 mm Folie Barrieren, die zwischen Somiten 15-20 und der seitlichen Mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO Kontrollbead. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Hühnerembryonen Feststufen 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Flügellevel Barriere und Korn Experiment Ergebnisse. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bühnen Barriere platziert (+ Perle) * </td&gt; <td> Anzahl betrieben </td><td> Leg fehlt ** </td><td> Leg vorhanden ** </td><td> Anzahl tot </td></tr><tr><td> Stufe 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stufe 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Stufe 15 (FGF4 Wulst) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Stufe 15 (RA Wulst) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1,3 mm Folie Barrieren, die zwischen Somiten 26-32 und der seitlichen Mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Hühnerembryonen Feststufen 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Leg Level Barriere und Bead Experiment Ergebnisse. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-mit-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Anzahl betrieben </td><td> Leg Knospe klein </td><td> Leg Knospe etwas klein </td><td> Leg Knospe normale Größe </td><td> Anzahl tot </td></tr><tr><td> BMS 493 Perlen * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO Perlen ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 in 5 mg getränkten Kügelchen / ml BMS 493 in der richtigen Stufe 14-15 LPM in Beinhöhe platziert. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 Perlen in DMSO getränkt allein in der richtigen Stufe 15 LPM in Beinhöhe platziert. </td></tr><tr><td colspan="5"> Hühnerembryos in den Stadien 1 fixiert19.07. </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Leg Stufe BMS 493 Bead Experiment Ergebnisse.

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Aufrufe.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Serie: Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biologie

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Neurowissenschaften

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Zusammenfassung

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