يمكن أن يتسبب العمر والعدوى والأدوية السامة للأذن في تنكس خلايا الشعر في الأذن الداخلية ، مما يؤدي فينا إلى فقدان السمع. في الفقاريات غير الثديية ، مثل الفرخ ، يمكن تجديد خلايا الشعر. تستفيد التقنيات الموضحة هنا من فعالية التكلفة للعمل على أجنة الفرخ ، وسهولة الحصول على الأجنة ، والتطور الجيد لنباتات الأنسجة.
يمكن أن يوفر فهم نمو شعر الأذن الداخلية للطيور وتجديده رؤى مهمة حول فقدان السمع والعلاجات المحتملة ، ويمكن أن تكون زراعة النباتات مهمة لتقييم التأثيرات السامة للأذن للأدوية المختلفة. قبل البدء في التجربة ، قم بشراء البيض الطازج ، ونظفه بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث. احتضان البيض لمدة 3.5 إلى 4 أيام ، عند 37 إلى 38 درجة مئوية مع رطوبة 45٪.
بعد الحضانة ، أعد وضع الجنين في أعلى صفار البيض ، عن طريق وضع بيضة على جانبه لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، استخدم ملقط لعمل ثقب صغير في الجزء العلوي ونهاية حادة للبيضة لتمرير إبرة قياس 21. باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر وإبرة قياس 21 ، قم بإزالة ملليلتر من الألبومين من ثقب في الطرف الحاد للبيضة.
قم بتغطية الفتحة في النهاية الحادة باستخدام شريط شفاف. لجعل نافذة البيض تلصق الشريط الشفاف على الجزء العلوي من قشرة البيضة. امسك الإبر من الحقن المجهري من الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية باستخدام مجتذب ماصة عمودي.
بعد السحب ، قم بقطع الطرف الشعري باستخدام ملقط دقيق للحصول على قطر طرف يبلغ حوالي 50 ميكرومتر بنهاية مدببة. بالنسبة لتجربة خروج المغلوب الجيني ، امزج التركيبات الثلاثة ، وهي البلازميد الإرشادي ، pcU6.1sgRNA ، T2KeGFP ، T2TP بنسبة واحد إلى واحد إلى واحد مع ميكروجرام واحد من بروتين SP Cas9 ، 30٪ سكروز ، و 0.1٪ صبغة خضراء سريعة ، وحجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر. أثناء البلازميدات المتعددة ، تأكد من أن التركيز النهائي للحمض النووي لا يقل عن أربعة ميكروجرامات لكل ميكرولتر.
مع مساعدة من مقص springbow قطع مفتوحة حول نافذة طولها سنتيمترين وعرضها 1.5 سم ، وفضح الجنين. ثم استخدم الملقط لفتح الأغشية المشيمية التي تغطي الجنين ، مما يسمح بالوصول إلى الجنين. حقن حوالي 200 نانولتر من مزيج محلول الحمض النووي لملء الحويصلة الأذنية.
لتحديد دليل كفاءة الحمض النووي الريبي إجراء فحص نوكلياز T7. أضف 0.719٪ قطرات ملحية إلى الجنين لخفض المقاومة الكهربائية ، ومنع ارتفاع درجة الحرارة. بعد ذلك ، ضع القطب الموجب من خلال الفتحة المصنوعة في الجانب الحاد من البيضة ، وقم بمناورة القطب بحيث يكون تحت صفار البيض.
ضع القطب السالب فوق كيس الأذن المملوء. لنقل البلازميد إلى الحويصلة الأذنية باستخدام التثقيب الكهربائي ، استخدم مولد نبضة مربعة ، وقم بتطبيق خمس نبضات من 25 فولت لمدة 100 مللي ثانية لكل منها ، بفارق 50 مللي ثانية. تحديد الظروف تجريبيا على أساس إعداد التثقيب الكهربائي الفردي.
بعد التثقيب الكهربائي ، رطب الجنين بإضافة بضع قطرات من 0.719٪ محلول ملحي. أعد ختم البيضة بشريط شفاف ، والعودة إلى الحاضنة المرطبة عند 37 إلى 38 درجة مئوية لمزيد من الحضانة. تطهير الطاولة الجراحية ، ومرحلة المجهر ، والمنطقة المحيطة بها باستخدام 70٪ من الإيثانول والحرارة ، أو الكحول تعقيم معدات التشريح الدقيقة ، بما في ذلك مقص قوس الربيع الحد الأدنى ، ومكشطة دقيقة ، وزوجين من الملقط الناعم.
قم بإعداد ألواح التشريح بما في ذلك طبق بتري زجاجي بقاعدة سيليكون سوداء ، وطبق بتري بلاستيكي 90 ملم ، وطبق بتري 60 ملم. حافظ على محلول الملح المتوازن من PBS أو Hanks المعروف أيضا باسم HBSS جاهزا للتشريح. اكسر البيضة برفق في طبق بتري 90 ملم.
ثم حدد الأذن الخارجية للفرخ ، وانقل الرأس إلى طبق بتري 60 ملم مملوء بالجليد البارد PBS. بعد ذلك ، قم بتوجيه الجنين بحيث يكون الجزء العلوي من المنقار مواجها للداخل ، وأمسك المنقار باستخدام أحد الملقط رقم خمسة. استخرج العينين باستخدام ملقط الرقم خمسة الثاني.
ثم ، من المنبر إلى الذيلي ، قطع على طول الجمجمة على طول خط الوسط ، واستخراج الدماغ. أضف المزيد من PBS البارد ، أو HBSS ، وحدد موقع اثنين من otoliths من lagena كهياكل لامعة في نهاية قناة القوقعة ، وعلى مقربة من خط الوسط. لعزل أذنين داخليتين ، اقطع بين اللاجينات ، وأعلى وأسفل المنطقة.
ثم تحت الإضاءة المائلة تصور الخطوط العريضة للأذن الداخلية ، وإزالة الأنسجة الدخيلة والدهليز. انقل القوقعة المعزولة إلى صفيحة قاعدة سيليكون سوداء مع PBS بارد مثلج. انزع كبسولة القوقعة الغضروفية باستخدام ملقط رقم خمسة للحصول على قناة القوقعة.
ثم حدد موقع الطبقة المتموجة أو tegmentum من القناة القوقعية ، وقم بإزالتها باستخدام عدد 55 ملقط لكشف الحليمة القاعدية أو BP. بعد ذلك ، قم بإزالة الغشاء التكتوري لفضح خلايا الشعر والخلايا الداعمة باستخدام عدد 55 ملقط. بالنسبة للاستزراع الغشائي للحليمة القاعدية ، خذ صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار ، وقم بترتيب إدراج غشاء زراعة واحد لكل بئر. ارسم بعض الوسائط في ماصة سعة 200 ميكرولتر ، ثم قم بشفط نبات الحليمة القاعدية المشريح باستخدام مخزن مؤقت X HBSS.
انقل النبات إلى غشاء ، وقم بتوجيهه بحيث تواجه الحليمة القاعدية لأعلى ، ويكون الشعر والخلايا الداعمة مرئية من الأعلى. بمجرد وضع explant ، قم بشفط المخزن المؤقت HBSS ببطء من سطح غشاء الثقافة. في هذه العملية ، سوف يعلق النبات على غشاء الثقافة.
املأ بئر صفيحة الآبار الستة بإضافة 1.2 ملليلتر من وسط النسر المعدل من دولبيكو ، أو وسائط الاستزراع DMEM ، بين إدخال الغشاء وجدار البئر. لتحضير مزرعة الكولاجين في قناة القوقعة ، أضف ثلاث قطرات من خليط الكولاجين الطازج في كل بئر من صفيحة أربعة آبار ، وانقل قناة القوقعة تشريح إلى كل قطرة كولاجين. احتضان الطبق لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لعلاج مصفوفة الكولاجين.
للحصول على معالجة جزيء صغير للمزارع ، استبدل وسائط الاستزراع ب 700 ميكرولتر من الوسائط المكملة بالمغير الدوائي ، مثل البنسلين ، واحتضان الألواح كما هو موضح من قبل. استبدال 50٪ من وسائل الإعلام الثقافية كل يوم. بعد وقت الحضانة المناسب ، قم بإزالة وسائط الاستزراع ، واستخدم النباتات الخارجية لفحوصات المصب.
في إعداد التثقيب الكهربائي ، أدى وضع القطب الكهربائي الصحيح إلى تعبير GFP أعلى في الأذن الداخلية في كلا الجهازين الدهليزيين ، والحليمة القاعدية السمعية التي تؤكد النقل. كريسبر كاس 9 بوساطة الضربة القاضية الجين Atoh1 في الأذن الداخلية ، مما أدى إلى فقدان خلايا الشعر. خروج جين Atoh1 عن طريق التثقيب الكهربائي للبيض متبوعا بالحضانة حتى أظهر E10 انخفاضا في نمو خلايا الشعر مقارنة بالتحكم في البلازميد الفارغ.
على الرغم من أن التثقيب الكهربائي عبارة عن فسيفساء ، إلا أن الخلايا الضابطة بالكهرباء كانت قادرة على تكوين خلايا شعرية. في عينات Atoh1 gRNA الكهربائية ، لم تظهر الخلايا الإيجابية لبروتين الفلورسنت الأخضر أبدا علامات تطور خلايا الشعر. قدمت ثقافة الجهاز من الحليمة القاعدية في مصفوفة 3D ، مثل الكولاجين والبقع مع الأجسام المضادة ضد مستضد خلايا الشعر الحفاظ على ممتازة من مورفولوجيا الأنسجة لمدة تصل إلى خمسة أيام.
تم الحفاظ على تنظيم خلايا الشعر والخلايا الداعمة في ظروف المزرعة هذه. يمكن الحفاظ على مزارع الأعضاء على الغشاء لمدة تصل إلى خمسة أيام مع الحفاظ على سلامة حزمة الشعر. يمكن ملاحظة ذلك في الصورة التمثيلية من خلال توطين بروتين رابط الطرف ، protocadherin 15.
للتحقيق في تطور حزمة الشعر ، يمكن أن يوفر التصوير عالي الدقة ، مثل الفحص المجهري فائق الدقة أو المجهر الإلكتروني الماسح مزيدا من المعلومات. يجب الحفاظ على الظروف المعقمة طوال العملية. أثناء التفريغ الكهربائي ، تأكد من أن الأجنة لا تجف.
عند معايرة مثبطات الدوائية ، يمكن للمرء تقليل التركيز للتغلب على أي فتك. يمكن أخذ كل من الأجنة والنباتات الخارجية لإجراء تجارب التصوير. إما عن طريق إجراء المجهر بالفيديو في الوقت الفعلي ، أو المجهر الإلكتروني البؤري للضوء الثابت ، كما هو موضح في البروتوكول.
نظرا لسهولة وإمكانية استخدام نباتات الأذن الداخلية للكتكوت ، يمكننا استخدام وسيط من خلال فحص الدليل لتحديد جزيئات جديدة ضرورية لتجديد خلايا الشعر.
