موانئ دبي هي المستفيدة من جائزة روث 1F32 - 01A1 كيرشتاين DA021977 من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة مارغريت Alkek M. إلى RHF.

<html> أولا تخطيطي لمحة عامة : <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="الشكل 1" width="460" height="384" /> هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ. الأول ، هو explanted الجنين المضيف في ثقافة جديدة [NI1]. إذن ، هو explanted الجنين donnor في المياه المالحة وعقدة هنسن (في &quot;منظم&quot; في الفرخ) هو المسمى مع صبغة الفلورسنت الجاذبة [NI2]. ويستأصل عقدة هنسن من جنين donnor [NI3] وزرع الجنين إلى المضيف [NI4 ، NI5]. هو مثقف ثم الجنين المضيف لتصل إلى 22 ساعة ، وبعد هذه الفترة النسيج donnor قد يسببها محور خارج الرحم في منطقة المضيف المعتمة [NI6]. التالية والثقافة ، ويتم إصلاح الجنين المضيف والمجهزة للphotooxidation في حضور DAB : بواسطة هذا التفاعل الكيميائي ، والخلايا المشتقة donnor ، والتي تظهر تحت الحمراء مضان FITC قبل photooxidation [NI7] ، وتصبح ردود الفعل التالية البني مع DAB [NI8]. ثم تتم معالجة الجنين للتهجين في الموضع مع علامة العصبية [NI8] ؛ الأنسجة المشتقة المضيف شكلت الأنسجة العصبية في وجود الفساد donnor. هذا النسيج يظهر اللون الأزرق. 1 : تحضير الجنين المضيف لثقافة جديدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا الاختبار الحث العصبي بروتوكول يبدأ مع البيض التي تم المحتضنة للهمبرغر وهاميلتون المرحلة 3 + (أو HH3 +). وقد حضنت هذه البويضات وضعت على جانبهم في حاضنة الرطبة لمدة 13 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الجنين المضيف لثقافة جديدة (الخطوات 3.1. إلى 5.5 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية سطح الجنين المضيف مع 200 ميكرولتر المالحة. وهذا تسهيل نقل في وقت لاحق وتحديد المواقع من الكسب غير المشروع donnor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، تغطية التجمع مع مقلوب فالكون 35 مم طبق الثقافة. </li></ol> 2 : Explanting الجنين donnor في المياه المالحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البويضة بواسطة التنصت على قذيفة بالملقط وإزالة قطعة من قذيفة ، في جميع أنحاء قذيفة. إزالة رأس قذيفة وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ألبومين سميك بالملقط ، والميل كيس المح مع ملقط الخشنة بحيث الجنين يواجه صعودا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص غرامة ، وقطع مربعة من الكيس المحي حول الجنين. إزالة الجنين من صفار البيض مع ملعقة ، والمكان في صحن يحتوي على برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط ، فصل الجنين donnor الشفافة من المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> donnor نقل الجنين الى صحن Sylgard مغطاة تحتوي على برنامج تلفزيوني. </li></ol> 3 : وضع العلامات ، واستئصال وزرع donnor الكسب غير المشروع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجتذب microelectrode ، وسحب 50 ميكرولتر microcapillary ماصات زجاجية. تحت المجهر ، وقطع غيض من micropipette باستخدام الملقط الغرامة. واصطف micropipette مكان في طبق بتري بشريط من plasteline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الصبغة التي سيتم استخدامها لتسمية طعم قبل الزرع : carbocyanine الصبغة الجاذبة (1،1 &#39;- dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) : أولا ، إعداد وتقييم الجاذبة في 1ml المطلقة الإيثانول بنسبة 0.5 ٪. ويمكن تخزين هذا المخزون في دورتها الحادية و20C في الظلام. في حمام مائي وضعت في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 prewarmed مزيج الأسهم الجاذبة ميكرولتر إلى سكروز 0.3M 360μl. درجة حرارة مياه الاستحمام أمر ضروري من أجل منع ترسب الجاذبة وتشكيل بلورات غير قابلة للذوبان. تدور لفترة وجيزة على حل spectrafuge مصغرة (لثانية 5-10). الحل الجاذبة الآن جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام دبابيس الحشرات ، وتأمين donnor الجنين في أسفل الطبق Sylgard تغطيتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة ملء micropipette مع الجاذبة. من خلال تطبيق ضغط لطيف باستخدام أنبوب التجميع الشافطة ، وتطبيق بلعة صغيرة من الجاذبة إلى عقدة هنسن. تأكد من تسمية كامل عقدة هنسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting ، وقطع عقدة هنسن (&quot;المنظم&quot; ، donnor الكسب غير المشروع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الجانب البطني ونهاية الخلفي من الكسب غير المشروع مع القرمز. وهذا ضمان أن يتم وضع الطعم مع التوجه السليم بطني ظهراني في الخطوة 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 200μl جيلسون ، ونقل والكسب غير المشروع إلى الجنين المضيف. </li></ol> 4 : تأمين الكسب غير المشروع وزرع الجنين المضيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الملوحة من الجنين المضيف ، والتأكد من الكسب غير المشروع لا يزال وضعه على مقربة من موقع المضيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting ، إجراء شق صغير (80 100μm) في منطقة الشفافة / منطقة الحدود المنطقة المعتمة ، على مستوى عقدة هنسن من جنين المضيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة microcapillary أو سكين microdissecting الموقف ، والكسب غير المشروع بحيث يواجه الجانب البطني نحو لكم ونهاية الخلفي موازية لمنطقة ما يعادلها في الجنين المضيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الملوحة المتبقية ، وعملية الجنين المضيف للثقافة الجديدة من أجل 81-22 ساعة (الخطوات 6،1-6،6 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم إصلاح الجنين المضيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الخطوات 7،1-7،7 9). </li></ol>ه &quot;&gt; 5 : Photooxidise الكسب غير المشروع في إطار مضان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء الدخان ، يعد حل DAB العاملة في تريس العازلة : ذوب الركيزة DAB (3،3 &#39;- diaminobenzidine tetrahydrochloride) في تريس العازلة (100mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4) في 500μg/ml ؛ ابقاء الحل في الظلام ، وعلى الثلج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجنين مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 مليون مرة واحدة في كل وتريس العازلة لمدة 5 مليون سهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين الى تجويف كوب الشريحة تحتوي على 1 مل تريس العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل تريس العازلة مع 1.5 مل من محلول DAB. التخلص من غيض إيبندورف في دلو يحتوي على محلول التبييض 10 ٪ من أجل تطهير DAB. ساترة وضع على رأس الشريحة تجويف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت مضان (فلوريسئين ثيوسيانات) FITC ، والتركيز على الهدف من هذا المجهر على الكسب غير المشروع (الخلايا الحمراء سوف تظهر donnor الفلورسنت) وفضح لمضان FITC حتى جميع الخلايا الحمراء الفلورسنت أصبحت البني (وهذا يحدث نتيجة لالجاذبة ملون تألقي يجري photoconverted لبلورات البني غير قابلة للذوبان ، من خلال التعرض لموجة الإثارة FITC (488nm) في حضور DAB. تستغرق هذه العملية ما بين 20 مليون و 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من رد الفعل photooxidation ، إزالة ساترة باستخدام الملقط الغرامة. نقل الجنين الى قارورة من الزجاج التلألؤ 20 مل تحتوي على PBTw (أو برنامج تلفزيوني مع 0.1 ٪ توين - 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط DAB ساترة من تجويف والزجاج الشريحة التي تفرخ في محلول التبييض 10 ٪. </li></ol> 6 : عملية الجنين في الموقع عن التصوير الفوتوغرافي ، والتهجين وsectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في الموقع التهجين (الخطوات 3،7-6،5 9) ، لاحتضان الجنين DIG المسبار المسمى فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في تصوير (8.2 الخطوة 9) وsectioning (الخطوات 8،3 8،4 و 9). </li></ol> ممثل النتائج في المثال التالي من مقايسة الحث العصبي ، يظهر طعم donnor لحث على التعبير عن أبتر من الأنسجة العصبية علامة المضيف مشتقة. في هذا المثال معينة ، قمنا بتقييم اكتساب القدرة على إحداث العصبية الجنينية في المناطق التي عادة لا يكون &quot;منظم&quot; قدرات : الكسب غير المشروع donnor تنبع من جنين التي كانت &quot;منظم&quot; منطقة ازالتها جراحيا من الجنين في مرحلة donnor 3 +. بعد التذرية ، لا يسمح للجنين لتطوير donnor في الثقافة الجديدة ، حتى ثقب تعافى وبنية تشبه عقدة هنسن وقد تشكلت. يسمى هذا الهيكل ثم مع صلاح الغيدان ، يستأصل من الجنين donnor والمطعمة على حدود المنطقة المعتمة الشفافة / منطقة جنين المضيف. التالية الثقافة الجديدة ، وتشكيل محور مصغرة المتاخمة لجنين المضيف : هذا المحور مصغرة تتكون من قضيب من خلايا الدم الحمراء (donnor المشتقة) وهيكل رأس مثل (المضيف المشتقة) : في الفقرة (أ) ، المشتقة من donnor الجاذبة المسمى وتظهر الخلايا قبل تثبيت تحت المجهر مضان FITC. وقد تكاثرت هذه الخلايا المشتقة من donnor لتشكيل notochord مصغرة ، والتي كما يبدو قضيب من خلايا الدم الحمراء. (ب) photoconversion عقب الجاذبة ، وهذه الخلايا المشتقة من donnor تظهر البني. والكسب غير المشروع الناجم donnor تشكيل الأنسجة العصبية من المضيف : هذا النسيج يتكون من السلائف للمخ ، كما يتضح من التعبير عنها ما يلي علامة أبتر التهجين في الموضع [طبع في الفترة من 6]. <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="الشكل 2" width="230" height="154" /> ملاحظة : في هذا الإجراء ، ونحن قد استخدمت خلايا الجاذبة المسمى من أجل التفريق الأنسجة العصبية donnor حمل (الأحمر / البني) مشتقة من المضيف &quot;العصبية&quot; الأنسجة (الأزرق). بدلا من استخدام كتكوت المشتقة ، صلاح الغيدان donnor الكسب غير المشروع المسمى ، وبعض الكتاب أيضا استخدام donnor الأنسجة المشتقة من الأجنة السمان بدلا من الفرخ [على سبيل المثال 6]. هذا أسلوب بديل يسمح أيضا للتمييز donnor من الأنسجة المضيف. في هذه الحالة ، والكسب غير المشروع (donnor الأنسجة) تنبع من بيض السمان بدلا من بيض الدجاج. الخطوة التالية هي حذف 4.5 ، يتم معالجة المضيف المناعية لتحميل كامل مع جسم معين إلى الأنسجة السمان (QCP1) والخطوات و3،1-3،4 5،1-5،7 من البروتوكول. ويرد مثال على هذا الإجراء البديل التالي : في هذه الحالة ، علينا استخدام نفس الإجراء التجريبي كما في ألف وباء ، ولكن كنا السمان المستمدة donnor الأنسجة (كما هو موضح من خلال التعبير عن الأضداد QCPN [البني]) : إن إعادة إحياء وقد يتسبب العقدة المستمدة من الأجنة السمان التعبير عن Sox2 علامة عموم العصبية في المضيف [طبع في الفترة من 6] : <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="الشكل 3" width="154" height="230" />

<ol>
	<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos,+cultivated+in+vitro.">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick.">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li><li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+et+transplantation+des+diff&amp;eacute;rentes+r&amp;eacute;gions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet.">Excision et transplantation des diff&amp;eacute;rentes r&amp;eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li><li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+induction+in+birds.">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li><li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108.">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li><li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen's+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122.">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li><li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation.">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li><li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation.">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li><li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+(New+Culture.">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li></ol>

هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في إجراء عملية فحص لتحريض العصبي ، ويستخدم هذا الاختبار أساسا لتوصيف جزيئات المفترضة تحريض العصبي في الفرخ ، وبالتالي يمكن استخدامه لمجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات ، بدءا من micromanipulations الجنينى 1-4 ؛ 6 إلى شلالات جديدة كشف إشار...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>Premium Fertile</td>
<td>Fertilized, HH3+ (14 hr)</td>
</tr>
<tr>
<td>Stereomicroscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>MZ9.5 or similar</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Robbins Scientific</td>
<td>M1000</td>
<td>Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker</td>
</tr>
<tr>
<td>Marsh Automatic Incubator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lyon</td>
<td>RX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyrex dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watchmaker's glass 50mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>66112-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass rings</td>
<td>Tool</td>
<td>Physical Plant facility</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.</td>
</tr>
<tr>
<td>Curved Forceps (1)</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72991-4C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps (2)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11002-13</td>
<td>blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14161-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber Bulb</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DiI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aspirator tube assembly</td>
<td>Tool</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177-5EA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microelectrode puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Sutter Instruments	P-97 Flaming/Brown Micropipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur Capillary Pipette</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70950-12</td>
<td>round edge under flame</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Pioneer Plastics</td>
<td>030C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcapillary tube</td>
<td>Tool</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1049-1PAK</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microdissecting knife</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10056-12</td>
<td>Use to puncture cavities prior to in situ hybridization</td>
</tr>
<tr>
<td>Minuten pins 0.2mm diam</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethylpyrocarbonate (depc)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>0001986475</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethylpyrocarbonate (depc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>10025025</td>
<td>Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave</td>
</tr>
<tr>
<td>16% PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assay for neural induction in the chick embryo

الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة تشكيل والزخرفة الأولية للنظام العصبي. هذا الفيديو يوضح كيفية نسيج منظم الكسب غير المشروع إلى المضيف ، والطريقة التي يتم المطعمة عقدة هنسن ق (المنظم في جنين الفرخ) إلى الأديم الظاهر المضيف المختصة. الكسب غير المشروع منظم يرشد المغطي غ لقد الأنسجة لاعتماد مصير العصبية عبر إشارات العصبية المحفزة. ويشار إلى هذه الآلية والحث العصبي ، ويشكل الخطوة الأولى في تكوين الدماغ والحبل الشوكي في amniotes. ويستخدم هذا الأسلوب أساسا لتوصيف جزيئات المفترضة تحريض العصبي في الفرخ. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في مقايسة لتحريض العصبي ؛ أولا ، explanted الجنين donnor ويعلق على طبق. ثم ، على استعداد الجنين المضيف للثقافة الجديدة. والكسب غير المشروع ورفعه إلى الهامش زرع المنطقة الشفافة المضيف. هو مثقف المضيف 18-22 ساعة. تم إصلاح التجمع وتجهيزها لتطبيقات أخرى (مثل التهجين في الموقع). ولقد ابتكر هذا الأسلوب أصلا بواسطة ادينغتون<sup&gt; 1،2</sup&gt; وGallera<sup&gt; 3،4</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Neural Induction in the Chick Embryo at JoVE.com

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

الحث العصبي هو الخطوة الأولى في تكوين الدماغ. وهو الآلية التي عقدة هنسن (المنظم) ، يرشد النسيج المجاور لاعتماد مصير العصبية ، أي أن تثير الجهاز العصبي. هذا الفيديو يوضح مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

assay-for-neural-induction-in-the-chick-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

17.1K Views.  Texas A&M University (TAMU). الحث العصبي هو الخطوة الأولى في تكوين الدماغ. وهو الآلية التي عقدة هنسن (المنظم) ، يرشد النسيج المجاور لاعتماد مصير العصبية ، أي أن تثير الجهاز العصبي. هذا الفيديو يوضح مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ.

Video: Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study angiogenesis but also to study tumorigenesis. After the chick chorioallantoic membrane (CAM) has developed, its blood vessel network can be easily accessed, manipulated and observed and therefore provides an optimal setting for angiogenesis assays. Since the lymphoid system is not fully developed until late stages of incubation, the chick embryo serves as a naturally immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition to nurturing developing allo- and xenografts, the CAM blood vessel network provides a uniquely supportive environment for tumor cell intravasation, dissemination, and vascular arrest and a repository where arrested cells extravasate to form micro metastatic foci.
For experimental purposes, in most of the recent studies the CAM was exposed by cutting a window through the egg shell and experiments were carried out in ovo, resulting in significant limitations in the accessibility of the CAM and possibilities for observation and photo documentation of effects. When shell-less cultures of the chick embryo were used1-4, no experimental details were provided and, if published at all, the survival rates of these cultures were low. We refined the method of ex ovo culture of chick embryos significantly by introducing a rationally controlled extrusion of the egg content. These ex ovo cultures enhance the accessibility of the CAM and chick embryo, enabling easy in vivo documentation of effects and facilitating experimental manipulation of the embryo. This allows the successful application to a large number of scientific questions: (1) As an improved angiogenesis assay5,6, (2) an experimental set up for facilitated injections in the vitreous of the chick embryo eye7-9, (3) as a test environment for dissemination and intravasation of dispersed tumor cells from established cell lines inoculated on the CAM10-12, (4) as an improved sustaining system for successful transplantation and culture of limb buds of chicken and mice13 as well as (5) for grafting, propagation, and re-grafting of solid primary tumor tissue obtained from biopsies on the surface of the CAM14.
In this video article we describe the establishment of a refined chick ex ovo culture and CAM assay with survival rates over 50%. Besides we provide a step by step demonstration of the successful application of the ex ovo culture for a large number of scientific applications. 
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, and Sebastian Gustmann contributed equally to this study.

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is a unique, naturally immunodeficient supportive culture environment to study angiogenesis and tumorigenesis. This video article demonstrates the different steps in chick ex ovo culture, application of potentially angiogenic substances and successful inoculation of tumor cells and tissues on the surface of the CAM.

كتكوت البيضة السابقين الثقافة و البيضة السابقين CAM الفحص : كيف يعمل حقا

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

فك رموز محواري مقررات تمهيدية للمجموعات المحددة وراثيا من الخلايا العصبية في الأنبوبة العصبية الاستفادة الفرخ في البيضة Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the behavior of cells in a standardized in vivo environment. The main advantages of the chicken embryo include low cost, high accessibility, ease of surgical manipulation and lack of a fully developed immune system. Xenotransplantation into chicken embryos can provide valuable information about cell proliferation, differentiation and behavior, the responses of cells to signals in defined embryonic tissue niches, and tumorigenic potential. Transplanting cells into chicken embryos can also be a step towards transplantation experiments in other animal models. Recently the chicken embryo has been used to evaluate the neurogenic potential of human stem and progenitor cells following implantation into neural anlage1-6. In this video we document the entire procedure for transplanting human stem cells into the developing central nervous system of the chicken embryo. The procedure starts with incubation of fertilized eggs until embryos of the desired age have developed. The eggshell is then opened, and the embryo contrasted by injecting dye between the embryo and the yolk. Small lesions are made in the neural tube using microsurgery, creating a regenerative site for cell deposition that promotes subsequent integration into the host tissue. We demonstrate injections of human stem cells into such lesions made in the part of the neural tube that forms the hindbrain and the spinal cord, and into the lumen of the part of the neural tube that forms the brain. Systemic injections into extraembryonic veins and arteries are also demonstrated as an alternative way to deliver cells to vascularized tissues including the central nervous system. Finally we show how to remove the embryo from the egg after several days of further development and how to dissect the spinal cord free for subsequent physiological, histological or biochemical analyses.

In this paper we present a method for transplanting human stem cells into various regions of the central nervous system of the chicken embryo. This provides an in vivo model for assessing the proliferation and differentiation of various types of human stem cells in embryonic tissue environments.

زرع الأعضاء من الخلايا الجذعية البشرية إلى الأجنة الدجاج

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...