We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

أجريت الإجراءات التي تجرى على الحيوانات في الامتثال للحيوانات في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) وأبقى قانون عام 1986، والحيوانات وفقا للوزارة الداخلية نشرت مدونة الممارسات للإسكان ورعاية الحيوانات ولدت، الموردة أو المستخدمة للأغراض العلمية. ملاحظة: التجارب التي أجريت باستخدام النوع البري C57BL / 6J الفئران راسخة وهو موضح أدناه. الأمشاط الجنينية من سلالات مختلفة الماوس قد يكون بالمثل مثقف في المختبر، على الرغم من معدلات النمو وتمعدن بهم قد تختلف لتلك المفصلة هنا. 1. شروط تشريح وإعداد الأدوات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء جميع إعداد وسائل الاعلام، والأنسجة تشريح والعمل والثقافة في غطاء تدفق الصفحي لضمان العقم وسائل الإعلام وأساسيات جنينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتيح للثقافة وتشريح وسائل الإعلام لكي تتوازن لا يقل عن 1 ساعة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم تشريحمقص، دومون # 5 و دومون # 4 ملاقط جنبا إلى جنب مع زوج من رقيق Vannas المقص الصغير (8 سم على التوالي، شفرات 3 مم) من خلال التعقيم. بعد التعقيم، تزج المعدات تشريح في الايثانول 70٪ قبل استخدامها. </li></ol> 2. إعداد تشريح والثقافة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وسائل الإعلام الأساسية α-الحد الأدنى (بدون نوكليوسدس، αMEM) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (01:13) و resuspend زلال المصل البقري (BSA) في 2 ملغ / م ل قبل فلتر تعقيم من خلال حقنة قطرها 0.22 ميكرون، 33 مم فلتر. ملاحظة: يمكن أن يتم المتوسطة تشريح، فلتر تعقيمها وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستنبت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأمشاط ثقافة الجنينية في 300 ميكرولتر من مستنبت (في كل بئر من لوحة الثقافة 24 أيضا). إعداد مستنبت بإضافة 0.2٪ ث / ت جيش صرب البوسنة. 5 ميكروغرام / مل L-ASCOالفوسفات حمض rbic. 1 ملم β-سكرولي (βGP؛ اختياري - انظر القسم النتائج)؛ 0.05 ملغ / مل الجنتاميسين و 1.25 ميكروغرام الامفوتريسين إلى αMEM وتصفية تعقيم من خلال 0.22 ميكرون، 33 مم مرشح قطر حقنة. </li></ol></li></ol> 3. الفئران الجنينية الأمشاط تشريح والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعدام الماوس حاملا أو إيواء أجنة عمرها 15 يوما، عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية زارة الداخلية في المملكة المتحدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مستلق الحيوان وتطهير الجلد عن طريق الرش مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص تشريح جعل شق كبير في خط الوسط، واختراق كل من الجلد والغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد قرون الرحم اثنين من الحيوانات في المنطقة الظهرية من تجويف الجسم. إزالة قرون الرحم عن طريق تحرير أولا كل الرحم من مسراق الرحم عن طريق شقوق دقيقة مع مقص تشريح ثم أخيرا قطع قرون الرحم مجانا في قاعدتهم. PLACقرون الرحم ه إلى المتوسطة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل كل الجنين عن طريق خفض بين المواقع زرع طول قرن الرحم وإزالة الأجنة من الحويصلات الفردية باستخدام ملقط. الأجنة إعدام بقطع الرأس وفقا للمبادئ التوجيهية زارة الداخلية في المملكة المتحدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تطهير الجلد عن طريق الرش مع الايثانول 70٪، استخدم Vannas المقص الصغير لإزالة أطرافه الخلفية من الأجنة عن طريق عمل قطع في جميع أنحاء الفخذ القريبة. وهذا يضمن أكبر قدر من أطرافهم هند ممكن تتم إزالة. وضع أطرافه الخلفية في طبق بتري غارقة في المتوسط ​​تشريح قبل تشريح مشط القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، والبدء في إزالة الجلد المحيطة القدم الجنينية، التي معسر وبجذبه باستخدام # 5 ملاقط حين عقد أطرافه الخلفية ثابتة باستخدام رقم 4 ملاقط. يتم تنفيذ هذا أكثر فعالية من خلال استيعاب الجلد حول مستوى من الساق وسحب نحو السلاميات. استخدام مقص في هذه المرحلة لقطعليس مطلوبا الجلد رقيقة جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد بعناية tarsals القدم الجنينية مع # 4 ملاقط وإزالة الأمشاط الأولى والخامسة عن طريق معسر قبالة بالقرب من tarsals باستخدام # 5 ملاقط وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع القدم الذي عقد في نفس الموقف، استخدم رقم 5 ملاقط لتعطيل الأنسجة الضامة بين الكتائب الثلاث المتبقية والأمشاط. إدراج غيض من # 5 ملاقط في المفصل بين السلاميات والأمشاط لإزالة السلاميات من الأمشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، استخدام # 5 ملاقط لتعطيل الأنسجة الضامة بين tarsals والأمشاط. وضع مرة أخرى غيض من # 5 ملاقط في الفضاء المشترك بين tarsals والأمشاط وبلطف حرة والأمشاط من tarsals. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار بلطف صعودا والأمشاط الآن مجانا مع رقم 4 ملاقط ومكان في المتوسطة تشريح جديدة. ملاحظة: تشريح دقيق وينبغي أن توفر 6 الأمشاط من كل جنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم تشريح جميع الأمشاط المطلوبة، يتنبهLLY الأمشاط مكان بشكل فردي في 24 لوحات جيدا استعد مسبقا يحتوي على 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة. الأمشاط الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة تصل إلى 14 يوما. ملاحظة: لا تغيير وسائل الإعلام من الثقافات E15 على الأقل حتى يوم 5 من الثقافة لأن هذا يؤثر على قدرة تمعدن من 26. أسباب ذلك غير واضحة ولكن النمو الخطي وتمعدن المصفوفة قد تكون تعتمد على التحفيز عن طريق عوامل النمو التي صدرت من الأمشاط. </li></ol> 4. تحليل والتلاعب الثقافات الأمشاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من تشريح (يوم 0) إجراء قياسات الطولية الأولية باستخدام المجهر مع كاميرا مثبتة وتحليل الصور البرمجيات الرقمية. قياس طول منطقة التمعدن المركزية عند ظهوره بعد أيام قليلة من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بصفة دورية حسب الحاجة، تقديم مزيد من القياسات (عادة كل يوم 2 الثانية) حتى اليوم الأخير من ثقافة وعند هذه النقطة متتم معالجة العظام etatarsal تعتمد على النتائج المطلوبة (التي نوقشت في المقدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الملحق المتوسطة الثقافات مشط القدم الجهاز مع العوامل الخارجية المختلفة مثل عوامل النمو والهرمونات وكلاء الدوائية من يوم 0 الثقافة 22،24. في جميع الدراسات من هذا النوع، والسيطرة يطلب الأمشاط غير المعالجة. ملاحظة: على الرغم من أنه من المستحسن أن عظام السيطرة هي رديم ما يعادلها من الساق المقابل، لم تكن هناك أي اختلافات في النمو الخطي أو إمكانات تمعدن مثقف E15 الثانية 2، 3 و الأمشاط ال 4 (انظر أدناه، الشكل 2) . </li></ol>

<ol>
	<li>Farquharson, C., Staines, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+no+bones+about+it.">The skeleton: no bones about it.</a> J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).</li><li>Berendsen, A. D., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development.">Bone development.</a> Bone. 80, 14-18 (2015).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423, 332-336 (2003).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+development+and+extracellular+matrix+protein+genes+by+RUNX2.">Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.</a> Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).</li><li>de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+the+pathways+of+cartilage+and+bone+formation.">Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).</li><li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , (2005).</li><li>Farquharson, C., Jefferies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+and+longitudinal+bone+growth:+The+development+of+tibial+dyschondroplasia.">Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia.</a> Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495, 375-378 (2013).</li><li>Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles:+structure,+composition,+formation+and+function+in+calcification.">Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification.</a> Front. Biosci. 16, 2812 (2011).</li><li>Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+involvement+of+PHOSPHO1+in+matrix+vesicle-mediated+skeletal.">Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal.</a> J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).</li><li>Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+matrix+vesicles+in+skeletal+and+soft+tissue+mineralisation.">Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation.</a> Bone. 87, 147-158 (2016).</li><li>Brighton, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Growth+Plate.">Structure and Function of Growth Plate.</a> Clin. Orthop. , 22-32 (1978).</li><li>Shim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+growth+and+epiphyseal+fusion.">Pubertal growth and epiphyseal fusion.</a> Annals of pediatric endocrinology &amp; metabolism. 20, 8-12 (2015).</li><li>Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transitions+in+health+and+disease.">Cartilage to bone transitions in health and disease.</a> J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).</li><li>Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Chondrocyte+Performance+in+Growth-Plate+Cartilage+During+Longitudinal+Bone-Growth.">Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth.</a> Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).</li><li>Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Relationship+Between+The+Volume+Of+Hypertrophic+Chondrocytes+And+The+Rate+Of+Longitudinal+Bone-Growth+In+Growth+Plates.">Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates.</a> J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).</li><li>Thesingh, C. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchyme+in+embryonic+long+bones+as+early+deposition+site+for+osteoclast+progenitor+cells.">The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells.</a> Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).</li><li>Scheven, B. A., Hamilton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+bone+growth+in+vitro:+effects+of+insulin-like+growth+factor+I+and+growth+hormone.">Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone.</a> Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).</li><li>Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+IGF+regulation+of+longitudinal+bone+growth+in+rat+metatarsal+rudiments+cultured+in+serum-free+medium.">Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium.</a> Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).</li><li>Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+cartilage+and+bone+development.">Methods to study cartilage and bone development.</a> Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).</li><li>Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+augments+chondrocyte+hypertrophy+and+reverses+glucocorticoid-mediated+growth+retardation+in+fetal+mice+metatarsal+cultures.">Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures.</a> Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).</li><li>Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+plate+sparing+effects+of+the+selective+glucocorticoid+receptor+modulator,+AL-438.">The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).</li><li>MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+restricted+potential+for+recovery+of+growth+plate+chondrogenesis+and+longitudinal+bone+growth+following+exposure+to+pro-inflammatory+cytokines.">The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines.</a> J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).</li><li>Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch-up+growth+after+dexamethasone+withdrawal+occurs+in+cultured+postnatal+rat+metatarsal+bones.">Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones.</a> J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).</li><li>Haaijman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+terminal+chondrocyte+differentiation+by+bone+morphogenetic+protein+7+(OP-1)+in+vitro+depends+on+the+periarticular+region+but+is+independent+of+parathyroid+hormone-related+peptide.">Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide.</a> Bone. 25, 397-404 (1999).</li><li>Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OP-1+(BMP-7)+affects+mRNA+expression+of+type+1,+II,+X+collagen,+and+matrix+Gla+protein+in+ossifying+long+bones+in+vitro.">OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro.</a> J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEPE+is+a+novel+regulator+of+growth+plate+cartilage+mineralization.">MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization.</a> Bone. 51, 418-430 (2012).</li><li>Kaufman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Boskey, A. L., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture+Systems+for+Studies+of+Bone+and+Tooth+Mineralization.">Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization.</a> Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined.</a> Bone Miner. 12, 141-155 (1991).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+calcification+of+growth+plate+cartilage+as+a+result+of+compressive+force+in+vitro.">Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro.</a> Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+osteoclastic+bone-resorption+by+mechanical+stimulation+in+vitro.">Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro.</a> Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).</li><li>Dobie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+linear+bone+growth+by+GH+in+the+absence+of+SOCS2+is+independent+of+IGF-1.">Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1.</a> J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).</li><li>Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+1+receptor+(IGF1R)+signaling+regulates+osterix+expression+and+cartilage+matrix+mineralization+during+endochondral+ossification.">Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification.</a> Bone. 83, 48-57 (2016).</li><li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+co-operativity+of+tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+(TNAP)+and+PHOSPHO1+during+initiation+of+skeletal+mineralization.">The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+Growth+Defect+and+Deployment+of+Transient+Chondrocyte+Behaviors+Underlie+Osteoarthritis+Onset+in+a+Natural+Murine+Model.">Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 68, 880-891 (2016).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fetal+mouse+metatarsal+bone+explant+as+a+model+of+angiogenesis.">The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis.</a> Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).</li><li>Libby, P., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C,+collagen,+and+cracks+in+the+plaque.">Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque.</a> Circulation. 105, 1396-1398 (2002).</li><li>Alvarez, J., Serra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+redundant+roles+of+Smad3+in+TGF-beta-mediated+regulation+of+long+bone+development+in+organ+culture.">Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture.</a> Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).</li><li>Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOCS2+is+the+critical+regulator+of+GH+action+in+murine+growth+plate+chondrogenesis.">SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ثقافة الأمشاط الجنينية في الفئران يقدم نموذجا الفسيولوجية للغاية من النمو غضروفي وتمعدن. والتحقق من صحة الدراسات المبكرة التي E15 الأمشاط الماوس الخضوع لالنمط العادي للنمو الهيكل العظمي والتمايز. الغضروف (غضروفية) والعظام (بانيات والآكلة) الخلايا والمصفوفات الكولاجينية كل منهما لا يمكن تمييزها عن تلك التي لوحظت في الجسم الحي. ومع ذلك، هناك بعض القيود المعترف بها من هذا النموذج. هو ضعف سرعة التمايز ناقضة العظم كما هو نمو العظام (ولكن ليس الغضروف التمايز). نمو العظام أبطأ ما يقرب من 50٪ من تلك التي لوحظت في الجسم الحي، وربما يرجع ذلك إلى قصور في العوامل النظامية التي تؤثر على إنتاج عوامل محلية (على سبيل المثال، IGF-1، أفضل الممارسات الإدارية، وما إلى ذلك) (31). أيضا، فمن المسلم به أيضا أن العظام هي حساسة لبيئتها الميكانيكية وهذا هو الحال بالنسبة لالأمشاط مثقف، التي تستجيب لج أيضاhanges في 32،33 تحميل الميكانيكية. لذلك، في حالات المفرغة، كما هو موضح في هذا البروتوكول، تمعدن وارتشاف المعدنية يجوز المساس بها. ومع ذلك، فإن نموذج مشط القدم يوفر القدرة على قياس مباشرة نمو العظام الطولية والتي لم يكن ممكنا عبر 2D و 3D في نظم الاستزراع المختبر. قدمنا وصفا شاملا لبروتوكول المشاركة في تشريح وثقافة E15 الأمشاط الفئران وبالفعل، للمرة الأولى، تأكد من صحة تجميع الثانية 2، 3 و 4 تشرين الأمشاط لإجراء التجارب. يتم استخدام الأمشاط من E17 / E18 عادة للتحقيق في آليات نمو العظام نظرا لإمكاناتها غير عادية لتنمو خارج الجسم لفترات طويلة من الزمن (أي بعد 14 أيام في الثقافة). إنها نمط راسخة للتحقيق في دور عوامل النمو على نمو العظام الطولية الجنينية.بالإضافة إلى ذلك، تشريح وثقافة الأمشاط بعد الولادة ويعملون عادة لتحديد آليات المحيطة نمو العظام بعد الولادة كما أنه من المفهوم أن نمو العظام بعد الولادة ونمو العظام الجنين وينظم بشكل مختلف 21. نمو العظام التي لوحظت في الأمشاط بعد الولادة مثقف هو إلا أقل بكثير من تلك التي لوحظت في أساسيات جنينية 25،34، مما يحد من قدرتها في دراسات على المدى الطويل وتسليط الضوء على تأثير أكثر النظامية على نمو العظام في هذه المرحلة ما بعد الولادة. في الواقع، لمدة 3 أيام بعد الولادة الأمشاط القديمة من الفئران عادة ما تكون المرحلة الأخيرة التي يمكن استخدامها للحصول على 34 نمو قابلة للقياس. نحن هنا وصف بروتوكول لدينا لعزل عظام مشط القدم الجنينية في E15. غياب المعدنية hydroxyapaptite في عظام مشط القدم E15 يعني أنها توفر نموذجا لا مثيل لها للتحقيق ليس فقط على آليات المحيطة نمو العظام الطولية، ولكن أيضا على بدءتمعدن الهيكل العظمي. المصفوفة المعدنية في المنطقة خلية غضروفية الضخامي المحطة توفر سقالة لغزو بانيات لوضع العظام مصفوفة محددة (عظمية) وهو المتمعدنة في وقت لاحق، وعلى هذا النحو هذا تمعدن أولي أمر حيوي لتكوين ناجح وظيفية العظام 35. في الواقع لقد أكدت عدد من التقارير الأخيرة استخدام الأمشاط E15 قدرتها الفريدة للتحقيق في 28،36،37 عملية تمعدن. وبالإضافة إلى ذلك، ووصف الباحثون استخدام الأمشاط E15 كنموذج للتكوين الأوعية الدموية 38، وتسليط الضوء على إمكانات الأمشاط الجنينية كنموذج خارج وضع العظام النمو / تمعدن. البروتوكول وصفنا يتطلب سوى معدات المختبرات القياسية بما في ذلك غطاء الصفحي التدفق، ومجهر تشريح لأداء التشريح، وحاضنة CO 2 لثقافة اساسيات رفعه. وعلاوة على ذلك، طريق مسدود أساسية جداتلح تحتوي على المتوسط αMEM، BSA، والمضادات الحيوية، antimycotics وحمض L-الاسكوربيك (لكونه عامل مساعد في تركيب هيدروكسي وهيدروكسي ليزين، اثنين من الأحماض الأمينية الأساسية لإنتاج الكولاجين 39) الابتعاد عن استخدام المواد المضافة غير محددة، مثل الأمصال الحيوانية . تقليديا، واضاف المحققين βGP إلى وسائل الإعلام المستخدمة لثقافة الأمشاط الجنينية ولكن كما كشفت في نتائجنا، لا يلزم استخدام مصدر الفوسفات إضافية لتمعدن ناجحة في هذا النظام الثقافة. هذا اكتشاف مهم في سعينا لفهم الآليات التي تقوم عليها ECM تمعدن. سبق إصابة الأمشاط مع الفيروسات الغدية التي تحتوي على الأشكال السائدة سلبية من Smad2 لاستكشاف دور عامل النمو المحول β في تنظيم نمو العظام الطويلة 40. هنا نحن تكشف أيضا عن ترنسفكأيشن ناجحة من النوع البري عظام مشط القدم E15 مع جزيئات الفيروس GFP، مشيرا ريمكن بسهولة اعتمدت تقنيات قبعة lentiviral للتلاعب التعبير الجيني في الثقافات مشط القدم. وبالمثل، فإن نظام الثقافة الجهاز مشط القدم هو نموذج ممتاز في لمقارنة نمو العظام من الفئران المعدلة وراثيا إلى فهم أفضل لدور جين معين في عملية نمو العظام. وقد استخدمت دراساتنا السابقة للنظام الثقافة الجهاز مشط القدم لتحديد دور القامع خلوى يشير 2 (SOCS2) في نمو العظام غضروفي. استخدام عظام المشط من الفئران من نقص في SOCS2، ونحن قد أظهرت أن هرمون النمو قادرة على محاكاة مستقلة نموها الطولي للأنسولين مثل عامل النمو (IGF-1)، على عكس النوع البري عظام مشط القدم التي لا تستجيب للهرمون النمو علاج 34، 41. هذا يسلط الضوء على مدى الثقافات مشط القدم يمكن التلاعب بها لدراسة آثار جينات مختلفة و / أو عوامل خارجية على نمو العظام غضروفي. باختصار، لدينا التفصيلقاد طريقة لاستخراج ناجحة وثقافة عظام مشط القدم الجنينية التي يمكن التلاعب بها وفحصها باستخدام مجموعة متنوعة من التحليلات. يحافظ هذا فيفو السابقين نموذج خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة، وكذلك يحتوي على غضروفية في مراحل مختلفة من الغضروف، وبالتالي توفير نموذج أكثر الفسيولوجية من الخلايا في أحادي الطبقة أو الثقافة 3D. لذا مشط القدم الثقافات الجهاز هي نموذج فريد للتحقيق في الآليات الجزيئية المسؤولة عن التحجر غضروفي، وضرورية لزيادة فهمنا للعلم وظائف الأعضاء على حد سواء العظام والفيزيولوجيا المرضية

الهيكل العظمي هو جهاز معقد للغاية، ودينامية ومعقد يحتوي على مجموعة من الوظائف التي تمتد من الحركة، إلى التوازن الأيوني. تتألف من العظام والغضاريف، والهيكل العظمي يتكون من السكان خلية متميزة وظيفيا والتي تعمل للحفاظ على انها الهيكلية، والكيمياء الحيوية والميكانيكية النزاهة 1. واحدة من المهام الرئيسية للهيكل عظمي هو دورها في التنمية والنمو. تتطلب هذه العمليات تزامن السكان الخلوية المتعددة التي يتم تنظيمها من خلال الغدد الصماء ضيق والتحكم الجيني. باستثناء عظام مسطحة مثل لوح الكتف، الجمجمة والقص، ويتكون الهيكل العظمي الثدييات من خلال عملية تعرف باسم التعظم غضروفي. هذه العملية، تنظم كل من جزيئيا ومكانيا، ويبدأ مع التكثيف من خلايا اللحمة المتوسطة المستمدة أساسا من الأديم المتوسط 2. تحت تأثير عامل SOX9 النسخ، والخلايا في الالبريد الداخلية من تكثفات تفرق في غضروفية، معربا عن وإفراز الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) مكونات محددة مثل النوع الثاني من الكولاجين وaggrecan. خلايا على هامش التكثيف، تعبر عن النوع الأول من الكولاجين وتشكيل سمحاق الغضروف، ترسيم العظام المحتملين 3. وفي وقت لاحق، وosteoprogenitors من سمحاق الغضروف تفرق في الخلايا بانية العظم، من إخراج التعبير عن عوامل النسخ، Runx2 وosterix 4. وهذا يؤدي إلى غلبة بانيات وتتم إعادة تسمية هذه الطبقة السمحاق الذي يشكل طوق عظمي المعادن في جميع أنحاء منتصف القسم من العظام. اختراق الأوعية الدموية في غشاء العظم وغزو السقالة الغضروفية يحدث تجلب معها، تستمد haematopoetically العظام resorbing الخلايا الآكلة، الذي يرتشف بقايا خلية غضروفية والكثير من مصفوفة الغضروفية 5. ملء الفراغات التي شكلتها osteoprogenitors مما أدى إلى التحجر الأساسيالمركز الذي يحتل تدريجيا جوهر diaphysis ويدمج مع السمحاق. خلايا أخرى تؤدي إلى نخاع العظام. حول الولادة، والأوعية الدموية وosteoprogenitors اختراق الغضروف مصفوفة الغنية في أي من الجانبين (الكردوس) من diaphysis النامية لتشكيل مركز التعظم الثانوي. تقع بين الكردوس وdiaphysis إما في نهاية العظام الطويلة هي الفرقة الغضروف - لوحة epiphyseal النمو - والتي هي المسؤولة عن تنسيق النمو الخطي من جميع العظام الطويلة (6). غضروفية داخل لوحة النمو في البداية تتكاثر وتتطور في وقت لاحق من خلال مناطق متميزة شكليا، بتنسيق من التعبير متتابعة من عوامل النسخ والنمو. وتتويجا لهذه السلسلة من الأحداث هو الخروج من دورة الخلية وتضخم في غضروفية في وسط هذه السلائف الغضروف. غضروفية الضخامي تعبر بقوة نوع X الكولاجين والفلزي مصفوفة-13 (MMP13) والتي كبيرا توسيع حجم في اتجاه النمو الطولي تقدم أكبر مساهمة في نمو العظام في الثدييات 7،8. وعلاوة على ذلك، غضروفية الضخامي يتمعدن ECM المحيط بهم من خلال الافراج عن حويصلات مصفوفة، متخصصة غشاء يحدها هياكل لإنتاج فوسفات الكالسيوم غير المتبلور من خلال إدراجها من فوسفاتاز (الأنسجة غير محددة الفوسفاتيز القلوية (TNAP) وPHOSPHO1) والكالسيوم توجيه البروتينات (annexins ) 9-11. وغزت هذه الغضاريف متكلسة بواسطة الأوعية الدموية من نخاع الأساسي مما أدى إلى تجنيد ناقضة العظم وارتشاف المصفوفة. ويعقب ذلك الهجرة بناء العظم والمواءمة إلى السطح من بقايا الغضروف متكلسة حيث وضع طبقة من عظماني وهو المتمعدنة بسرعة. وتشكيلها العظام المنسوجة من الإسفنجي الأولية في وقت لاحق إلى العظام رقائقي من الإسفنجي الثانوية 12. النتائج الانصهار المشاشية فيوقف التحجر غضروفي 13. التعظم داخل الغضروف تحت تنظيم محكم من قبل العديد من الغدد الصماء ونظير الصماوي الهرمونات وعوامل النمو وذلك لمنع تطوير بالانزعاج و / أو نمو العظام الطولية 14. فهم أفضل للآليات الجزيئية والخلوية التي تقوم عليها هذه العمليات وبالتالي من الضروري في سعينا لتحقيق التقدم السريرية نحو مصلحة الإنسان. وكانت دراسات سابقة إلى أوجه الشبه والاختلاف بين لوحات النمو من مختلف الأعمار والمواقع والأنواع قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للآليات الفيزيولوجية المحيطة ديناميات النمو لوحة 15،16. ومع ذلك، فإن دراسة غضروفية المعزولة صعبة، وإزالة غضروفية من بيئتهم يمكن أن يؤدي إلى فقد التمايز، يرافقه فقدان التعبير عن علامات رئيسية مثل Col2a1 17. الماوس مشط القدم الجهاز ثقافة يزدرع، بيoneered البروفيسور إليزابيث برغر والزملاء في هولندا، هو خارج الجسم الحي نموذج الفسيولوجية للغاية لدراسة التحجر غضروفي ونمو العظام ومعدل نمو العظام في الثقافة تحاكي تلك التي شوهدت في الجسم الحي 18. فريد والثقافة الجهاز المشط يسمح للفحص غضروفية في مراحل مختلفة من الغضروف ويحافظ على خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة، وبالتالي توفير ظروف أقرب إلى الوضع في الجسم الحي من الخلايا في الثقافة 19-21. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج يسمح للفحص المباشر لنمو العظام الطولية والتي لم يكن ممكنا في الثقافات خلية غضروفية الأولية. كما يسمح لفصل العوامل النظامية والمحلية وبالتالي السماح لتحليل محدد للآثار المحلية على لوحة النمو. ثقافة الأمشاط تتيح للتحقيق في العديد من المعلمات. القياسات اليومية من الطول الكلي والمناطق المعدنية لللا يمكن أن يؤديها اساسيات مع معيار المجهر مرحلة التباين وبرمجيات تحليل الصور. النسيجي، في التهجين وتلطيخ immunohistological يمكن أداؤها بسهولة على أقسام مشط القدم، والذي يسمح للقرار المكاني لكلا الكيانين الخلوية والجزيئية، وهي ميزة كبيرة على طرق زراعة الخلايا التقليدية. ويشمل النهج المناعى للكشف والقياس من 5 برومو-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) امتصاص المتكاثرة غضروفية 22. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم تنفيذ مزيد من المعالجة من الأنسجة مشط القدم للسماح لتحليل المصب التعبير مرنا (RT-QPCR) والبروتين وتحليل الخلايا الإشارات (النشاف الغربي) أو تكوين الدهون (مطياف الكتلة). معظم الدراسات حتى الآن استخدام الأمشاط الجنينية مثقف بدلا من الأمشاط من الحيوانات بعد الولادة. بينما كلا النموذجين يمكن أن يكون بالمعلومات، ودراسة العظام الجنينية لديها العديد من المزايا: أنها تنمو بشكل أسرع ويمكن أن تكون EXPLOited لدراسة بدء وتطور من 23-25 عملية تمعدن. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل تشريح المعقد لالأمشاط الجنينية من أطرافهم هند من اليوم الجنينية 15 (E15) أجنة الفئران. وعلاوة على ذلك، يظهر النمو وتمعدن الأمشاط مميزة تشريحيا.

<table><tbody><tr><td>Dissection scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #4 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Dilute to 70% v/v in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM without nucleosides</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters (0.22 &amp;mu;m) 33 mm diameter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Add directly to the media prior to experimentation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

وكان الهدف من هذا الأسلوب لعزل الأمشاط والثقافة لهم الجنينية لفحص نمو العظام الطولية وECM تمعدن. باستخدام بروتوكول لدينا الموصوفة هنا، تم تشريح العظام مشط القدم الجنينية بنجاح، كما تصور بواسطة المجهر الضوئي. قياسات عظام مشط القدم، أجرى كما هو مبين في الشكل رقم 1، وأظهرت قدرتها على النمو في طول طولي ويتمعدن ECM الخاصة بهم (أرقام 2 و 3). وأشارت تمعدن مصفوفة لأول مرة في منتصف diaphysis من رديم العظام ويلاحظ بسهولة بواسطة المجهر الضوئي. لا يلزم تلطيخ على الرغم من أن الإقبال على calcein قد تقدم التصور تعزيز المعدنية التي شكلت حديثا. دراسات استخدام الأمشاط الجنينية حتى الآن 22،27،28 وتجميع تشريح الثانية 2، 3 و 4 تشرين (CENترال ثلاثة) الأمشاط، على افتراض نمو المختبر وتمعدن لتكون قابلة للمقارنة. المجراة التنموية من الأمشاط الفئران، ومع ذلك، يكشف عن أن 3 و 4 تشرين الأرقام لديها أدلة تمعدن قبل جميع الأمشاط والسلاميات 29 أخرى. تقييم إمكانات النمو وتمعدن معزولة بشكل فردي ومثقف E15 2 الثانية، كشفت 3 و الأمشاط ال 4 عدم وجود فروق كبيرة في المظهر أو مدى تمعدن بعد 7 أيام من ثقافة (الشكل 2). لم يوجد فرق في النسبة المئوية للزيادة من خط الأساس خلال الفترة الثقافة. كما لوحظ عدم وجود فروق في إمكانية تمعدن بروتوكول قياسي من تجميع 2 الثانية 3 و 4 تشرين الأمشاط يبدو صالحا للدراسات المستقبلية. تقليديا، واضاف المحققين βGP إلى وسائل الإعلامتستخدم لثقافة الأمشاط الجنينية لتعزيز ECM تمعدن. ومع ذلك، في دراسات ثقافة الخلية، وقد تبين أنه إذا تم إضافة TNAP الإنزيم إلى وسائل الإعلام المكونة للعظم التي تحتوي على βGP، خارج الرحم ترسب المعادن هيدروكسيباتيت لا يزال يحدث حتى في حالة عدم وجود خلايا 30. لدراسة الآثار المترتبة على مختلف ركائز تمعدن ومنبهات على قدرة مشط القدم تمعدن، ونحن مثقف الأمشاط E15 في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على مجموعة من المكملات الغذائية، وسجلت الصور وقياسات طول يوميا. وأشارت النتائج إلى أن E15 عظام المشط لا تزال تنمو ويتمعدن ECM في غياب βGP. E15 عظام المشط مثقف في حامض الاسكوربيك فقط اظهرت وسائل اعلام زيادات مماثلة في طول وتمعدن كما مثقف الأمشاط بحضور βGP (الشكل 3). لقد أظهرنا أيضا أن الفيروسة البطيئة يمكن أن تستخدم ل transfect الحمض النووي الخارجية في metata مثقفrsals. نحن هنا transfected بنجاح عظام مشط القدم يوم 0 الثقافة (أي يوم من تشريح) مع 2 × 10 6 الخضراء بروتين فلوري (GFP) جزيئات الفيروس في مشط القدم. لتمكين التنبيغ الفيروس، وأضيف polybrene في وقت واحد على الثقافات في 1: 500. تركت الثقافات لمدة 7 أيام، مع عدم وجود تغييرات وسائل الإعلام على النحو المطلوب لE15 مشط القدم تمعدن أن يحدث، قبل أن يتم تحضين مع 4 &quot;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) وصمة عار لمدة 5 دقائق ثم تصور مباشرة باستخدام المجهر متحد البؤر ( الشكل 4). لدينا دليل على التجارب مفهوم تظهر بوضوح تنبيغ فعال. ومع ذلك فإنه سيكون من الحكمة لدراسة الفروع في جميع أنحاء مجمل عظم مشط القدم لتقييم ترنسفكأيشن وفعال التلاعب الجيني على. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> الشكل 1: المنهجية المعيارية المستخدمة لقياس ركان طول ومنطقة التعدين من الجنينية الأمشاط. (A) مجموع قياسات طول الأمشاط E15 يوم 0 الثقافة (يوم تشريح) التي اتخذت من خلال مركز مشط القدم. (ب) قياسات الطول الكلي الطولي في مشط القدم بعد سبعة أيام في الثقافة. لاحظ انحناء طفيف في مشط القدم. (ج) قياس طول منطقة التمعدن بعد سبعة أيام في الثقافة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> الشكل 2: النمو والتعدين قدرات تشريحيا متميزة E15 الأمشاط التصوير وقياس 2، 3 والأمشاط 4TH من أطرافهم هند من E15 الفئران ث.كما يؤديها. (A) وصور المسلسل من 2، 3 والأمشاط 4TH طوال الفترة الثقافة. (ب) النسبة المئوية للزيادة في طول من يوم 0 في كل يوم من أيام الثقافة. (ج) طول المعدنية من 2، 3 والأمشاط 4TH خلال الفترة الثقافة كنسبة مئوية من إجمالي طول مشط القدم. يتم تمثيل البيانات في كما يعني خطأ ± المعياري للمتوسط ​​(SEM)، (ن = 6). (D) C57BL / 6J أطوال مشط القدم في كل يوم من أيام الثقافة. يتم تمثيل البيانات في كما يعني ± الانحراف المعياري (ن = 6). أسود شريط = 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> الشكل (3): النمو والتعدين قدرات البرية من نوعE15 الأمشاط مثقف في مختلف وسائل الإعلام المكونة للعظم. (A) وصور المسلسل من الأمشاط مثقف في حامض الاسكوربيك فقط، 1 ملم βGP، phosphocholine 3 ملم، 1.5 ملم كلوريد الكالسيوم أو 3 مم كلوريد الكالسيوم التي تحتوي على وسائل الاعلام. (ب) النسبة المئوية للزيادة في طول من يوم 0 من الأمشاط مثقف مع مختلف الملاحق. (ج) طول المعدنية من الأمشاط مثقف في وسائل الإعلام المختلفة كنسبة مئوية من إجمالي طول مشط القدم. تمثل البيانات يعني كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM)، (ن = 6). أسود شريط = 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> الشكل 4: ترنسفكأيشن من E15 الأمشاط مع GFP الفيروسات Pو transfected المواد. (A) E15 عظام المشط مع جزيئات الفيروس GFP لإثبات المفهوم. كانت ملطخة (ب) العظام مع دابي لتصور الحمض النووي. (C) وصور مزدوجة أشارت ترنسفكأيشن الناجح لفيروس GFP طوال مجمل عظام مشط القدم. أشرطة بيضاء = 0.5 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification at JoVE.com

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

Video: Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

بسيطة الحرجة الحجم فخذي عيب النموذجي في الفئران

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Medicine

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

نموذج مينيملي لتحليل الكسر Endochondral الشفاء في الفئران تحت ظروف النشاط الحيوي موحدة

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

جيل كسور الفخذ مغلقة في الفئران: نموذج لدراسة شفاء العظام

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

دراسة دقيقة لإصابة صفيحة النمو باستخدام الفئران الفلورية ثلاثية النسب

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones are overloaded.&#160;Better treatments for severely fractured growth plates are needed because the response to injury is a bony bridge that prematurely fuses the growth plate, leading to stunted and/or crooked limbs. Murine models of growth plate injury are advantageous for mechanistic studies, but&#160;are challenging because it is difficult to visualize and precisely injure the small growth plates in young mice.&#160;We describe here an improved growth plate injury model using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X.
These mice show native fluorescence associated with the three primary substrata of the growth plate. A growth plate injury similar to a Salter-Harris Type II injury is created reproducibly with a bur using the hypertrophic section of the growth plate as a reference during live imaging under fluorescence stereo microscopy guidance. Frozen histology analysis of the native fluorescence simplifies assessing the cellular response to injury. This methodology represents a substantial leap in growth plate injury research, providing a detailed and reproducible method for investigating pathology and evaluating new therapeutic strategies.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير نموذج إصابة صفيحة النمو باستخدام مراسلي الفلورسنت ثلاثي النسب في الفئران

This protocol describes an improved mouse model for adolescent bone growth plate injuries. Using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X, the primary matrices associated with three different substrata of the growth plate, injury placement is guided by native fluorescence under the microscope.

نموذج الفئران المعدلة وراثيا ثلاثي الألوان لدراسة إصابة صفيحة النمو

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

إنشاء نموذج كسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine

الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous

بسيطة الحرجة الحجم فخذي عيب النموذجي في الفئران

نموذج مينيملي لتحليل الكسر Endochondral الشفاء في الفئران تحت ظروف النشاط الحيوي موحدة

جيل كسور الفخذ مغلقة في الفئران: نموذج لدراسة شفاء العظام

نموذج الفئران المعدلة وراثيا ثلاثي الألوان لدراسة إصابة صفيحة النمو

نموذج الفئران المعدلة وراثيا ثلاثي الألوان لدراسة إصابة صفيحة النمو

نموذج الفئران المعدلة وراثيا ثلاثي الألوان لدراسة إصابة صفيحة النمو

إنشاء نموذج كسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران