We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

Los procedimientos que implican sujetos animales se llevaron a cabo en cumplimiento de los Animales (Procedimientos Científicos del Reino Unido) Act 1986 y los animales fueron mantenidos de acuerdo con el Ministerio del Interior publicó Código de prácticas para el alojamiento y cuidado de los animales criados, suministrados o utilizados para fines científicos. NOTA: Los experimentos llevados a cabo utilizando de tipo salvaje C57BL / 6J están bien establecidos y se describen a continuación. Metatarsianos embrionarias a partir de diferentes cepas de ratón pueden ser similarmente cultivadas in vitro, aunque sus tasas de crecimiento y la mineralización pueden ser diferentes a las que se detallan en este documento. 1. Disección Condiciones y preparación de los instrumentos <ol><li> Realizar toda la preparación de los medios de comunicación, tejidos disecciones y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad de los medios de comunicación y los rudimentos embrionarias. </li><li> Permitir a los medios de cultivo y de disección que se equilibre durante al menos 1 hora en un 37 ° C, 5% de CO2 antes de su uso. </li><li> esterilizar la diseccióntijeras, Dumont # 5 y # 4 pinzas Dumont junto a un par de tijeras micro Vannas superfino (8 cm rectos, hojas de 3 mm) por tratamiento en autoclave. Después del autoclave, sumergir el equipo de disección en 70% de etanol antes de su uso. </li></ol> 2. Preparación de la disección y Medios de Cultivo <ol><li> Para preparar el medio de disección <ol><li> Diluir medio esencial α-mínimo (sin nucleósidos, aMEM) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (01:13) y resuspender albúmina de suero bovino (BSA) en 2 mg / m l antes de filtro esterilizante a través de una jeringa de 0,22 m, 33 mm de diámetro filtrar. NOTA: La disección medio se puede hacer, se esteriliza por filtración y se almacenó en alícuotas a -20 ° C indefinidamente. </li></ol></li><li> Preparar medio de cultivo <ol><li> Cultura metatarsianos embrionarias en 300 l de medio de cultivo (en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos). Preparar el medio de cultivo mediante la adición de 0,2% w / v BSA; 5 mg / ml de L-ASCOfosfato ácido de RBIC; 1 mM de β-glicerofosfato (βGP; opcional - ver sección de resultados); 0,05 mg / ml de gentamicina y 1,25 mg de anfotericina B a aMEM y el filtro de esterilización a través de un filtro de jeringa de diámetro 0,22 m, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. murino embrionarias metatarsiano disección y la Cultura <ol><li> Sacrificar el ratón embarazadas, la acogida embriones de 15 días de edad, por dislocación cervical, de conformidad con las directrices de Ministerio del Interior del Reino Unido </li><li> Coloque la supina animal y desinfectar la piel por pulverización con 70% de etanol. Usando tijeras de disección hacer una gran incisión en la línea media, que penetra la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Busque los dos cuernos uterinos del animal en la región dorsal de la cavidad corporal. Retire los cuernos uterinos al liberar en primer lugar, cada uterino desde el mesometrio por incisiones cuidadosas con tijeras de disección y, finalmente, el corte de los cuernos uterinos libre en su base. Placcuernos uterinos E en medio de disección. </li><li> Separar cada embrión mediante el corte entre los sitios de implantación a lo largo del cuerno uterino y la toma de embriones de sus sacos individuales usando unas pinzas. embriones de desecho por la decapitación de acuerdo con las directrices de Ministerio del Interior del Reino Unido </li><li> Después de la desinfección de la piel por pulverización con 70% de etanol, utilizar Vannas micro tijeras para quitar las extremidades traseras de los embriones mediante la incisión alrededor del fémur proximal. Esto garantiza tanto de la extremidad posterior como sea posible es eliminado. Colocar las extremidades traseras en una placa Petri sumergido en un medio de disección antes de la disección metatarsiano. </li><li> Bajo un microscopio de disección, empezar a quitar la piel que rodea el pie embrionario, pellizcando y tirando de él con el # 5 pinzas mientras se mantiene constante la extremidad posterior usando el # 4 pinzas. Esto se realiza más eficazmente agarrando la piel en torno al nivel de la tibia y tirando hacia las falanges. El uso de tijeras en esta etapa para cortar elNo se requiere una piel muy fina. </li><li> sujetándola con cuidado los tarsos del pie embrionaria con # 4 pinzas y quitar el primer y quinto metatarsianos pellizcando rozando los tarsos usando # 5 pinzas y desechar. </li><li> Con el pie que tuvo lugar en la misma posición, utilice el # 5 pinzas para romper el tejido conectivo entre las tres falanges y metatarsos restantes. Inserte la punta de las pinzas # 5 en la unión entre las falanges y metatarsos para eliminar las falanges de los metatarsianos. </li><li> Por último, utilice # 5 pinzas para romper el tejido conectivo entre los tarsos y metatarsos. Una vez más colocar la punta de las pinzas # 5 en el espacio de la articulación entre los tarsos y metatarsos y con cuidado libres los metatarsos de los tarsos. </li><li> recoger suavemente hacia arriba los metatarsianos ahora libres con # 4 pinzas y lugar en medio de la disección fresco. NOTA: la disección cuidadosa debe proporcionar metatarsianos 6 de cada embrión. </li><li> Cuando todos los metatarsianos requeridos han sido disecados, carefully lugar metatarsianos de forma individual en las placas de 24 pocillos que contienen pre-calentado a 300 l de medio de cultivo. Metatarsianos cultivo a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante hasta 14 días. NOTA: No cambie los medios de cultivos E15 al menos hasta el día 5 de la cultura ya que esto afecta a su capacidad de mineralización 26. Las razones de esto no están claras pero el crecimiento lineal y mineralización de la matriz pueden depender de la estimulación por factores de crecimiento liberados de los metatarsianos. </li></ol> 4. Análisis y Manipulación de los metatarsianos culturas <ol><li> En el día de la disección (día 0) efectuar mediciones longitudinales iniciales usando un microscopio con una cámara adjunta y análisis de imágenes de software digital. Medir la longitud de la zona central de la mineralización cuando aparece después de unos días de cultivo. </li><li> Periódicamente, según sea necesario, realizar más mediciones (por lo general todos los días 2º) hasta el último día de la cultura y en ese momento metatarsal huesos se procesan depende de los resultados requeridos (discutido en la introducción). </li><li> Suplemento medio de cultivos de órganos metatarsiano con varios factores exógenos, por ejemplo, factores de crecimiento, hormonas y agentes farmacológicos desde el día 0 de la cultura 22,24. En todos los estudios de este tipo, se requiere el control no tratados metatarsianos. NOTA: Si bien es aconsejable que los huesos de control son el rudimento equivalente de la pierna contralateral, no ha habido ninguna diferencia en el crecimiento lineal o potencial de mineralización de la culta E15 2 °, 3 ° y 4 metatarsianos th (véase más abajo, Figura 2) . </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La cultura de los metatarsos de embriones murinos proporciona un modelo altamente fisiológica del crecimiento endocondral y la mineralización. Los primeros estudios han validado que E15 metatarsianos ratón se someten a un patrón normal de crecimiento del esqueleto y la diferenciación. El cartílago (condrocitos) y hueso (osteoblastos y osteoclastos) y las células de sus respectivas matrices de colágeno son indistinguibles de los observados in vivo. Sin embargo, hay algunas limitaciones reconocidas de este modelo. La velocidad de diferenciación de los osteoclastos se deteriora como es el crecimiento del hueso (pero no cartílago diferenciación). El crecimiento óseo es aproximadamente 50% más lento que el observado in vivo y puede ser debido a las deficiencias en los factores sistémicos que influyen en la producción de factores locales (por ejemplo, IGF-1, BMP, etc.) 31. Además, es bien reconocido que el hueso es sensible a su entorno mecánico y esto es también el caso de los metatarsianos cultivadas, que responden a cambios en 32,33 carga mecánica. Por lo tanto, en situaciones sin carga, tal como se describe en este protocolo, la mineralización y la resorción de minerales puede verse comprometida. Sin embargo, el modelo metatarsiano ofrece la posibilidad de medir directamente el crecimiento óseo lineal que no es posible a través de 2D y 3D en los sistemas de cultivo in vitro. Hemos proporcionado una descripción completa del protocolo involucrado en la disección y la cultura de E15 metatarsianos murinos y, de hecho, por primera vez, confirmar la validez de la combinación de los 2 °, 3 ° y 4 ° metatarsianos para los experimentos. Metatarsianos de E17 / E18 se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos de crecimiento de los huesos debido a su extraordinario potencial para crecer ex vivo durante largos períodos de tiempo (es decir, más allá de 14 días en cultivo). Ellos son un modelo bien establecido para investigar el papel de los factores de crecimiento en el crecimiento longitudinal del hueso embrionario.Además, la disección y la cultura de los metatarsianos postnatales se emplea comúnmente para delinear los mecanismos que rodean el crecimiento óseo postnatal como se entiende que el crecimiento óseo y el crecimiento óseo postnatal fetal se regulan de manera diferente 21. Sin embargo, el crecimiento de los huesos metatarsianos observado en postnatales cultivadas es significativamente menor que la observada en rudimentos embrionarias 25,34, lo que limita su potencial en estudios a largo plazo y resaltando la influencia más sistémico sobre el crecimiento óseo en esta etapa postnatal. De hecho, 3 días de edad postnatal de ratones metatarsianos son típicamente la etapa más reciente que se puede utilizar para obtener 34 crecimiento medible. Aquí describimos nuestro protocolo para el aislamiento de huesos metatarsianos embrionarias en E15. La ausencia de mineral hydroxyapaptite en huesos metatarsianos E15 significa que proporcionan un modelo sin igual a investigar no sólo los mecanismos que rodean crecimiento longitudinal del hueso, sino también el iniciode la mineralización esquelética. La matriz mineralizada de la zona de condrocitos hipertrófica terminal proporciona un andamiaje para la invasión de los osteoblastos para establecer un hueso matriz específica (osteoide), que es posteriormente mineralizada, y como tal esta mineralización inicial es de vital importancia para la formación ósea exitoso y funcional 35. De hecho, un número de informes recientes que utilizan metatarsianos E15 han confirmado su capacidad única para la investigación del proceso de mineralización 28,36,37. Además, los investigadores han descrito el uso de los metatarsianos E15 como modelo de angiogénesis 38, destacando el potencial de los metatarsianos embrionarias como modelo fuera del entorno de crecimiento óseo / mineralización. El protocolo se describe sólo requiere equipos de laboratorio estándar, incluyendo una campana de flujo laminar, un microscopio de disección para realizar la disección y una incubadora de CO 2 para el cultivo de rudimentos extirpados. Por otra parte, una calle muy básicotura que contiene medio aMEM, BSA, antibióticos, antimicóticos y ácido L-ascórbico (un cofactor en la síntesis de hidroxiprolina e hidroxilisina, dos aminoácidos esenciales para la producción de colágeno 39) evita el uso de aditivos no definidos, tales como sueros animales . Tradicionalmente, los investigadores han añadido βGP a los medios empleados para el cultivo de embriones metatarsianos, pero como se revela en nuestros resultados, no se requiere el uso de una fuente de fosfato adicional para la mineralización éxito en este sistema de cultivo. Este es un hallazgo importante en nuestra búsqueda de la comprensión de los mecanismos que sustentan la mineralización ECM. Metatarsianos previamente han sido infectados con adenovirus que contienen formas dominantes negativos de Smad2 para explorar el papel del factor de crecimiento transformante β en la regulación del desarrollo de los huesos largos 40. Aquí también revelamos la transfección exitosa de tipo salvaje huesos metatarsianos E15 con partículas de virus GFP, lo que indica ttécnicas de sombrero de lentivirus podían fácilmente ser adaptada para manipular la expresión génica en las culturas de los metatarsianos. Del mismo modo, el sistema de cultivo de órganos metatarsiano es un excelente modelo en el que comparar el crecimiento de los huesos de ratones genéticamente alterados para entender mejor el papel de un gen particular en el proceso de crecimiento del hueso. Nuestros estudios previos han utilizado el sistema de cultivo de órganos metatarsiano para determinar el papel de supresor de la señalización de citoquinas-2 (Socs2) en el crecimiento de hueso endocondral. El uso de los huesos metatarsianos de los ratones deficientes en Socs2, hemos demostrado que la hormona de crecimiento es capaz de simular su longitudinal crecimiento independiente de la insulina como factor de crecimiento (IGF-1), a diferencia de los huesos metatarsianos de tipo salvaje que no responden al crecimiento tratamiento hormonal 34, 41. Esto pone de relieve la medida en que los cultivos de los metatarsianos pueden ser manipulados para examinar los efectos de diferentes genes y / o factores exógenos en el crecimiento de hueso endocondral. En resumen, tenemos detaiconducido un método para la extracción exitosa y la cultura de huesos metatarsianos embrionarias que se pueden manipular y se examinaron usando una variedad de análisis. Este modelo ex vivo mantiene célula-célula y las interacciones célula-matriz, así como contiene condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis, por lo tanto, proporcionar un modelo más fisiológica de células en monocapa o un cultivo 3D. cultivos de órganos metatarsianos son, por tanto, un modelo único para la investigación de los mecanismos moleculares responsables de la osificación endocondral, y son esenciales para mejorar nuestra comprensión de la fisiología y la fisiopatología ósea

El esqueleto es un órgano muy complejo, dinámico y complejo que tiene una serie de funciones que van desde la locomoción, a la homeostasis de iones. Compuesto de hueso y cartílago, el esqueleto consta de las poblaciones de células funcionalmente distintas que funcionan para mantener su integridad estructural, bioquímica y mecánica 1. Una de las funciones primarias del esqueleto es su papel en el desarrollo y el crecimiento. Estos procesos requieren la orquestación de múltiples poblaciones celulares que son reguladas a través endocrina apretado y control genético. Con la excepción de los huesos planos por ejemplo, escápula, cráneo y el esternón, el esqueleto de los mamíferos se forma a través del proceso conocido como osificación endocondral. Este proceso, regulado tanto molecularmente y espacialmente, comienza con la condensación de células mesenquimáticas derivadas principalmente del mesodermo 2. Bajo la influencia del factor de transcripción SOX9, las células en THe interior de las condensaciones se diferencian en condrocitos, expresar y secretar componentes específicos de cartílago de la matriz extracelular (ECM) tales como colágeno de tipo II y agrecano. Las células en el margen de la condensación, expresan colágeno tipo I y la forma del pericondrio, delineando el hueso prospectivo 3. Más tarde, los osteoprogenitors del pericondrio se diferencian en osteoblastos, dirigida por la expresión de los factores de transcripción, y Runx2 osterix 4. Esto conduce a un predominio de los osteoblastos y esta capa se cambia el nombre del periostio que forma un collar óseo mineralizado alrededor de la mitad de la sección del hueso. Penetración vascular del periostio y la invasión del andamio cartilaginosa se produce trayendo consigo, haematopoetically derivado células óseas resorción, osteoclastos, que reabsorben los restos de condrocitos y gran parte de la matriz cartilaginosa 5. Los espacios formados son ocupados por osteoprogenitors que dan lugar a la osificación primariacentro que ocupa progresivamente el núcleo de la diáfisis y se fusiona con el periostio. Otras células dan lugar a la médula ósea. Alrededor del nacimiento, los vasos sanguíneos y osteoprogenitors penetran en la matriz rica en cartílago en cada lado (epífisis) de la diáfisis en desarrollo para formar el centro de osificación secundario. Situado entre la epífisis y la diáfisis en los extremos de los huesos largos es una banda de cartílago - la placa de crecimiento epifisaria - que es la responsable de coordinar el crecimiento lineal de todos los huesos largos 6. Los condrocitos en el cartílago de crecimiento inicialmente proliferan y posteriormente progresan a través de zonas morfológicamente distintas, coordinados por la expresión secuencial de transcripción y factores de crecimiento. La culminación de esta secuencia de eventos es la salida del ciclo celular y la hipertrofia de los condrocitos en el centro de este precursor cartílago. condrocitos hipertróficos expresan fuertemente colágeno tipo X y metaloproteinasas de la matriz-13 (MMP13) y su considerable volumen de la ampliación en la dirección del crecimiento longitudinal proporciona la mayor contribución al crecimiento óseo en mamíferos 7,8. Además, los condrocitos hipertróficos mineralizan su ECM circundante a través de la liberación de vesículas de matriz, estructuras de membrana delimitada especializados para la producción de fosfato de calcio amorfo a través de su inclusión de fosfatasas (tejido no específica de la fosfatasa alcalina (TNAP) y PHOSPHO1) y calcio canalización de proteínas (anexinas ) 9-11. Este cartílago calcificado es invadido por vasos sanguíneos de la médula ósea subyacente que resulta en el reclutamiento de los osteoclastos y la resorción de la matriz. Esto es seguido por la migración de osteoblastos y la alineación a la superficie de los restos de cartílago calcificadas en la que establecen una capa de osteoide, que es rápidamente mineralizado. El hueso reticular de la sustancia esponjosa primaria es posteriormente remodelado para hueso laminar de la esponjosa secundaria 12. resultados de fusión epifisarias en elcese de la osificación endocondral 13. Osificación endocondral está bajo una regulación estricta por muchas hormonas endocrinas y paracrinas y factores de crecimiento con el fin de prevenir el desarrollo perturbado y / o el crecimiento del hueso longitudinal 14. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y celulares que sustentan estos procesos tanto, es imperativo en nuestra búsqueda de avances clínicos hacia el beneficio humano. Las investigaciones previas sobre las similitudes y diferencias entre las placas de crecimiento de diferentes edades, lugares y especies han mejorado en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos fisiológicos que rodean la dinámica de la placa de crecimiento 15,16. Sin embargo, el estudio de los condrocitos aislados es difícil, ya que la eliminación de los condrocitos de su medio ambiente puede conducir a la desdiferenciación, acompañado de pérdida de la expresión de marcadores clave como Col2a1 17. El metatarsiano ratón cultivo de explantes de órganos, pioneered por el Prof. Elisabeth hamburguesa y sus colegas en los Países Bajos, es un modelo muy fisiológica ex vivo para el estudio de la osificación endocondral y el crecimiento óseo como la tasa de crecimiento de los huesos en la cultura imitan a la observada in vivo 18. Excepcionalmente, el cultivo de órganos metatarsiano permite el examen de los condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis y mantiene célula-célula y las interacciones célula-matriz, por lo tanto, proporcionar condiciones más cerca de la situación in vivo que las células en cultivo de 19-21. Además, este modelo permite el examen directo del crecimiento óseo lineal que no es posible en cultivos de condrocitos primarios. También permite la separación de los factores sistémicos y locales, por tanto, que permiten el análisis específico de los efectos locales en la placa de crecimiento. La cultura de los metatarsianos permite la investigación de numerosos parámetros. Las mediciones diarias de longitud total y de las regiones mineralizadas delos rudimentos se pueden realizar con microscopía de contraste de fase estándar y software de análisis de imágenes. Histológico, hibridación in situ y tinción inmunohistoquímico se puede realizar fácilmente en las secciones de los metatarsianos, lo que permite la resolución espacial de las dos entidades moleculares y celulares, una importante ventaja sobre los métodos tradicionales de cultivo de células. El enfoque inmunohistoquímica incluye la detección y cuantificación de 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina captación (BrdU) por la proliferación de condrocitos 22. Además, el tratamiento posterior de los tejidos de los metatarsianos se puede realizar para permitir el análisis aguas abajo de la expresión de ARNm (RT-qPCR), proteína y análisis intracelular de señalización (transferencia Western) o la composición de lípidos (espectrometría de masas). La mayoría de los estudios hasta la fecha utilizan metatarsianos embrionarias cultivadas en lugar de los metatarsos de animales después de nacer. Mientras que ambos modelos pueden ser de carácter informativo, el estudio de los huesos embrionarios tiene varias ventajas: crecen más rápido y puede ser ExploITED para estudiar el inicio y la progresión de la 23 a 25 proceso de mineralización. Este protocolo describe en detalle la intrincada disección de metatarsianos embrionarias a partir de la extremidad posterior de día embrionario 15 (E15) embriones murinos. Además, se muestra el crecimiento y la mineralización de los huesos metatarsianos anatómicamente distintos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500342</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500339</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFine Vannas scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Dilute to 70% v/v in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM without nucleosides</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters (0.22&#956;m) 33mm diameter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0378</td>
			<td>Add directly to the media prior to experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

El objetivo de este método fue aislar metatarsianos y cultura los embriones para el examen de crecimiento longitudinal del hueso y mineralización ECM. Utilizando el protocolo descrito en el presente documento, huesos metatarsianos embrionarias se diseccionaron con éxito, como se visualizó por microscopía de luz. Las mediciones de huesos metatarsianos, llevados a cabo como se indica en la figura 1, mostraron su capacidad de crecer en la longitud longitudinal y mineralizar su ECM (Figuras 2 y 3). La mineralización de la matriz se observó por primera vez en la media de la diáfisis del hueso y el rudimento es fácil de observar con el microscopio óptico. No se requiere tinción aunque la absorción de calceína puede ofrecer una visualización mejorada del mineral recién formado. Los estudios que utilizan metatarsianos embrionarias hasta la fecha 22,27,28 han puesto en común la diseccionado 2º, 3º y 4º (CENtral tres metatarsianos), asumiendo que el crecimiento in vitro y la mineralización sean comparables. In vivo del desarrollo de los metatarsianos murinos, sin embargo, revela que los dígitos 3 ° y 4 ° tienen indicios de mineralización antes de todos los otros metatarsianos y falanges 29. Evaluación del potencial de crecimiento y la mineralización de forma individual aislaron y cultivaron E15 2º, 3º y 4º metatarsianos no reveló diferencias significativas en la aparición o la extensión de la mineralización después de 7 días de cultivo (Figura 2). No hay diferencia en el porcentaje de incremento respecto al valor basal fue encontrado durante el período de cultivo. Como se observó ninguna diferencia en el potencial de mineralización del protocolo estándar del agrupamiento de los metatarsianos 2º 3 ° y 4 ° parece válida para futuros estudios. Tradicionalmente, los investigadores han añadido a los medios βGPempleados para el cultivo metatarsianos embrionarias para promover la mineralización ECM. Sin embargo, en estudios de cultivo celular, se ha demostrado que si se añade enzima TNAP a los medios que contienen osteogénicas βGP, ectópico deposición mineral hidroxiapatita todavía se produce incluso en ausencia de células 30. Para examinar los efectos de diversos sustratos de mineralización y agonistas sobre la capacidad de mineralización metatarsiano, cultivamos metatarsianos E15 en medios de cultivo que contiene una serie de suplementos, y las imágenes y las mediciones de longitud se registraron diariamente. Los resultados indicaron que E15 huesos metatarsianos todavía crecen y mineralizan su ECM en ausencia de βGP. E15 huesos metatarsianos cultivadas en ácido ascórbico único medio de comunicación mostraron aumentos comparables en la longitud y la mineralización como metatarsianos cultivaron en presencia de βGP (Figura 3). También hemos demostrado que los lentivirus se puede usar para transfectar ADN exógeno en metata cultivaronrsals. Aquí transfectadas con éxito huesos metatarsianos en día 0 de cultivo (es decir, día de la disección) con 2 x 10 6 partículas de virus proteína fluorescente verde (GFP) por metatarsiano. Para activar la transducción de virus, se añadió polibreno simultáneamente a los cultivos a 1: 500. Los cultivos se dejaron durante 7 días, sin cambios de medio como se requiere para E15 mineralización metatarsiano que ocurra, antes de ser incubadas con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mancha durante 5 min y después se visualizaron directamente usando un microscopio confocal ( la Figura 4). Nuestra prueba de concepto experimentos muestran claramente la transducción eficaz. Sin embargo, sería prudente examinar secciones a lo largo de la totalidad del hueso metatarsiano para evaluar su manipulación genética transfección y eficaz. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: Metodología estándar utilizado para medir tLongitud él y Zona de mineralización embrionarias metatarsianos. (A) medidas totales de longitud de los metatarsianos E15 en el día 0 de la cultura (día de la disección) a través del centro del metatarsiano. (B) Las mediciones de la longitud longitudinal total de un metatarso después de siete días de cultivo. Tenga en cuenta la ligera curvatura en el metatarsiano. (C) La medición de la longitud de la zona de mineralización después de siete días de cultivo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: Crecimiento y mineralización de la capacidad de anatómicamente distintos E15 Metatarsianos de imágenes y medición de la 2ª, 3ª y 4ª metatarsos de la extremidad posterior de ratones E15 w.como se realizó. (A) Imágenes seriadas de la 2ª, 3ª y 4ª metatarsianos durante todo el período de cultivo. (B) Porcentaje de aumento en la longitud desde el día 0 en cada día de cultivo. (C) Longitud de Mineral de la segunda, tercera y 4º metatarsianos sobre el período de cultivo, expresado como porcentaje de la longitud total metatarsiano. Los datos de se representan como media ± error estándar de la media (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J longitudes de los metatarsianos en cada día de cultivo. Los datos de se representan como media ± desviación estándar (n = 6). Barra de negro = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: Crecimiento y mineralización Capacidad de tipo silvestreE15 Metatarsianos cultivadas en diferentes medios osteogénico. (A) Imágenes seriadas de los metatarsianos cultivadas en ácido ascórbico solamente, 1 mM βGP, fosfocolina 3 mM, cloruro de calcio 1,5 mM o cloruro de calcio 3 mM que contenía medios de comunicación. (B) Porcentaje de aumento en la longitud desde el día 0 de metatarsianos cultivó con los diversos suplementos. (C) Longitud de Mineral de metatarsianos cultivadas en diversos medios de comunicación, expresado como porcentaje de la longitud total metatarsiano. Los datos se representan como media ± error estándar de la media (SEM), (n = 6). Barra de negro = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: La transfección de E15 Metatarsianos con el Virus de GFP Partículos. huesos metatarsianos (A) E15 fueron transfectadas con GFP partículas de virus de prueba de concepto. (B) Los huesos fueron teñidas con DAPI para la visualización del ADN. (C) Las imágenes duales indican la transfección exitosa de virus GFP largo de la totalidad de los huesos metatarsianos. Las barras blancas = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Cultura de murinos embrionarias Metatarsianos: Un modelo fisiológico de osificación endocondral

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.0K vistas.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma de perfiles de<em&gt; In-Vivo</em&gt; Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...