We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti in conformità con gli animali del Regno Unito (Procedure Scientifiche) Act del 1986 e gli animali sono stati mantenuti in accordo con il Ministero dell&#39;Interno pubblicato Codice di condotta per l&#39;alloggiamento e la cura degli animali allevati, Fornito o utilizzati a fini scientifici. NOTA: Gli esperimenti effettuati utilizzando wild-type C57Bl / 6J topi sono ben stabiliti e descritti di seguito. Metatarsi embrionali provenienti da diversi ceppi di topi possono allo stesso modo essere coltivate in vitro, anche se i loro tassi di crescita e di mineralizzazione possono essere diverse a quelle descritte nel presente documento. 1. dissezione Condizioni e preparazione degli strumenti <ol><li> Eseguire tutta la preparazione dei media, tessuti dissezioni e il lavoro della cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità dei media e rudimenti embrionali. </li><li> Consentire terreni di coltura e dissezione per equilibrare per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima dell&#39;uso. </li><li> sterilizzare dissezioneforbici, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinzette accanto a un paio di Superfine Vännäs micro forbici (8 cm rette, 3 mm lame) in autoclave. Dopo la sterilizzazione in autoclave, immergere l&#39;apparecchiatura dissezione in etanolo al 70% prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di dissezione e di cultura dei media <ol><li> Preparare mezzo di dissezione <ol><li> Diluire media Essential α-minimo (senza nucleosidi, αMEM) in tampone fosfato (PBS) (1,13) e risospendere albumina sierica bovina (BSA) a 2 mg / m l prima filtro sterilizzante attraverso una siringa diametro di 0,22 micron, 33 millimetri filtro. NOTA: media dissezione può essere fatta, filtro sterilizzato e conservato in aliquote a -20 ° C a tempo indeterminato. </li></ol></li><li> Preparare terreno di coltura <ol><li> Cultura metatarsi embrionali in 300 ml di terreno di coltura (in ciascun pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti). Preparare il terreno di coltura con l&#39;aggiunta di 0,2% w / v BSA; 5 ug / ml di L-ascofosfato acido di rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opzionale - vedi sezione risultati); 0,05 mg / ml di gentamicina e 1,25 mg amfotericina B a αMEM e filtro sterilizzare attraverso un filtro di diametro siringa da 0,22 micron, 33 mm. </li></ol></li></ol> 3. murino embrionale metatarso Dissection e cultura <ol><li> Abbattere il mouse in stato di gravidanza, l&#39;ospitare 15 giorni di età embrioni, da dislocazione cervicale in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito </li><li> Posizionare la supina animale e disinfettare la pelle a spruzzo con il 70% di etanolo. Utilizzando forbici dissezione fare una grande incisione sulla linea mediana, penetrando sia la pelle e il peritoneo per esporre la cavità addominale. </li><li> Individuare le due corna uterine dell&#39;animale nella regione dorsale della cavità del corpo. Rimuovere le corna uterine da un lato liberando ogni uterino dal mesometrio da attenti incisioni con le forbici dissezione e infine il taglio delle corna uterine libera alla loro base. Place corna uterine in media dissezione. </li><li> Separare ogni embrione, tagliando tra i siti di impianto lungo il corno uterino e rimuovere gli embrioni dalle loro singole sacche con pinze. embrioni da riforma per decapitazione, in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito </li><li> Dopo la disinfezione della pelle a spruzzo con il 70% di etanolo, usare le forbici Vannas micro per rimuovere gli arti posteriori da embrioni incidendo intorno al femore prossimale. Questo assicura tanto degli arti posteriori possibile è rimosso. Posizionare gli arti posteriori in una capsula di Petri sommerso nel mezzo di dissezione prima metatarso dissezione. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, cominciare a rimuovere la pelle che circonda il piede embrionale, pizzicando e tirando fuori con il # 5 pinzette, mentre tenendo premuto il arto posteriore costante con il # 4 pinzette. Questo è più efficace eseguita afferrando la pelle a circa il livello della tibia e tirando verso le falangi. L&#39;uso di forbici in questa fase per tagliare ilpelle molto sottile non è necessaria. </li><li> tenere attentamente le tarso del piede embrionale con # 4 pinzette e rimuovere il primo e il quinto metatarso pizzicando fuori vicino alle tarso usando # 5 pinzette e scartare. </li><li> Con il piede tenuto nella stessa posizione, utilizzare il # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra i tre falangi rimanenti e metatarsi. Inserire la punta di # 5 pinzette in corrispondenza del giunto tra le falangi e metatarsi per rimuovere le falangi dei metatarsi. </li><li> Infine, usare # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra le tarso e metatarso. Anche in questo caso posizionare la punta del # 5 pinzette nello spazio articolare tra le tarso e metatarso e delicatamente liberi metatarsi dai tarso. </li><li> Delicatamente raccogliere i metatarsi ora liberi con # 4 pinzette e posto in media dissezione fresco. NOTA: la dissezione attenta dovrebbe fornire 6 metatarsi da ogni embrione. </li><li> Quando tutti i metatarsi richiesti sono stati sezionati, carefuLLY luogo metatarsi singolarmente nelle piastre da 24 pozzetti pre-riscaldato contenenti 300 ml di terreni di coltura. Metatarsi Culture a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per un massimo di 14 giorni. NOTA: Non modificare i mezzi di comunicazione di culture E15 fino ad almeno 5 giorni di cultura come questo influenza la loro capacità di mineralizzazione 26. Le ragioni di questo non sono chiari, ma la crescita lineare e matrice mineralizzazione possono dipendere stimolazione con fattori di crescita rilasciati dalle metatarsi. </li></ol> 4. analisi e la manipolazione delle Culture metatarso <ol><li> Il giorno della dissezione (giorno 0) eseguire misure longitudinali iniziali utilizzando un microscopio con un software videocamera collegata e analisi di immagine digitale. Misurare la lunghezza della zona centrale mineralizzazione quando appare dopo pochi giorni di coltura. </li><li> Periodicamente, come richiesto, effettuare ulteriori misurazioni (di solito ogni 2 ° giorno) fino all&#39;ultimo giorno della cultura a quel punto mossa etatarsal vengono elaborati dipende risultati richiesti (discusso in premessa). </li><li> Media Supplemento di culture metatarso d&#39;organo con vari fattori esogeni ad esempio fattori di crescita, ormoni e agenti farmacologici dal giorno 0 della cultura 22,24. In tutti gli studi di questo tipo, di controllo sono necessari metatarsi non trattati. NOTA: Anche se è consigliabile che le ossa di controllo sono il rudimento equivalenti dalla gamba controlaterale, non ce ne è stato eventuali differenze di crescita lineare o potenziale mineralizzazione delle colta E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso (vedi sotto, figura 2) . </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La cultura del metatarso embrionali murine fornisce un modello altamente fisiologico della crescita endochondral e mineralizzazione. I primi studi hanno confermato che E15 metatarsi del mouse subiscono un normale modello di crescita scheletrica e la differenziazione. La cartilagine (condrociti) e l&#39;osso (osteoblasti e osteoclasti), le cellule e le loro rispettive matrici di collagene sono indistinguibili da quelle osservate in vivo. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni riconosciute di questo modello. La velocità di differenziazione degli osteoclasti è compromessa così come la crescita delle ossa (ma non cartilagine differenziazione). La crescita ossea è circa il 50% inferiore a quella osservata in vivo e può essere causa di carenze in fattori sistemici che influenzano la produzione di fattori locali (ad esempio, IGF-1, BMP, ecc) 31. Inoltre, è ben noto che l&#39;osso è sensibile al suo ambiente meccanico e questo è anche il caso per metatarsi coltivate, che rispondono alla cHANGES a carico 32,33 meccanica. Pertanto, in situazioni non caricati, come descritto in questo protocollo, la mineralizzazione e il riassorbimento minerale potrebbe essere compromessa. Tuttavia, il modello metatarso offre la possibilità di misurare direttamente la crescita delle ossa lineare che non è possibile tramite 2D e 3D in sistemi di coltura in vitro. Abbiamo fornito una descrizione completa del protocollo coinvolti nella dissezione e la cultura della E15 metatarsi murini e in effetti, per la prima volta, confermare la validità di mettere in comune i 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per gli esperimenti. Metatarsi da E17 / E18 sono comunemente usati per studiare i meccanismi di crescita ossea a causa della loro straordinario potenziale per crescere ex vivo per lunghi periodi di tempo (cioè oltre i 14 giorni di cultura). Si tratta di un modello consolidato per indagare il ruolo dei fattori di crescita sulla crescita embrionale ossea longitudinale.Inoltre, la dissezione e la cultura di metatarsi postnatali è comunemente impiegato per delineare i meccanismi che circondano la crescita delle ossa post-natale, come si è capito che la crescita delle ossa post-natale e la crescita delle ossa del feto sono regolati in modo diverso 21. La crescita ossea osservata in metatarsi postnatali in coltura è comunque notevolmente inferiore a quello osservato nei rudimenti embrionali 25,34, limitando il loro potenziale in studi a lungo termine e mettendo in evidenza l&#39;influenza più sistemico sulla crescita delle ossa, in questa fase post-natale. Infatti, 3 giorni di età metatarsi postnatale di topi sono tipicamente l&#39;ultima fase che può essere utilizzato per ottenere misurabile 34 crescita. Qui si descrive il nostro protocollo per l&#39;isolamento delle ossa del metatarso embrionali a E15. L&#39;assenza di minerale hydroxyapaptite in E15 metatarsale significa che essi forniscono un modello ineguagliabile per indagare non solo i meccanismi circostanti crescita ossea longitudinale, ma anche l&#39;iniziazionedi mineralizzazione scheletrica. La matrice mineralizzata della zona di condrociti ipertrofica terminale fornisce un&#39;impalcatura per invadere osteoblasti stabilire un osso specifica matrice (osteoide), che viene successivamente mineralizzata, e come tale questo mineralizzazione iniziale è di vitale importanza per la formazione delle ossa di successo e funzionale 35. In effetti una serie di rapporti recenti che utilizzano metatarsi E15 hanno confermato la loro capacità unica per l&#39;indagine del 28,36,37 processo di mineralizzazione. Inoltre, i ricercatori hanno descritto l&#39;uso di metatarsi E15 come modello di angiogenesi 38, mettendo in evidenza il potenziale di metatarsi embrionali come modello di fuori del contesto della crescita ossea / mineralizzazione. Il protocollo che descriviamo richiede solo apparecchiature di laboratorio standard tra cui una cappa flusso laminare, un microscopio da dissezione per eseguire la dissezione, e un incubatore di CO 2 per la cultura dei primi rudimenti escisse. Inoltre, una strada molto essenzialeture terreno contenente αMEM, BSA, antibiotici, antimicotici e l&#39;acido L-ascorbico (un cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina, due amminoacidi essenziali per la produzione di collagene 39) evita l&#39;uso di additivi non definiti, come siero animale . Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mezzi utilizzati per la coltura metatarsi embrionali, ma come rivelato nei nostri risultati, l&#39;uso di una fonte di fosfato supplementare non è richiesto per la mineralizzazione successo in questo sistema di coltura. Questo è un dato importante nella nostra ricerca di comprensione dei meccanismi alla base ECM mineralizzazione. Metatarsi sono stati precedentemente infettati con adenovirus contenenti forme dominanti negativi di Smad2 per esplorare il ruolo di fattore di crescita trasformante β nella regolazione dello sviluppo delle ossa lunghe 40. Qui si rivelano anche la trasfezione di successo di wild-type ossa metatarsali E15 con particelle virali GFP, indicando ttecniche di cappello lentivirali potrebbero essere facilmente adottate per manipolare l&#39;espressione genica nelle culture del metatarso. Analogamente, il sistema di coltura organo metatarso è un modello eccellente in cui confrontare la crescita delle ossa da topi geneticamente modificati per comprendere meglio il ruolo di un particolare gene nel processo di crescita ossea. I nostri studi precedenti hanno utilizzato il sistema di coltura di organi metatarso per determinare il ruolo di soppressore di citochine segnalazione-2 (SOCS2) in crescita ossea endochondral. Utilizzando ossa del metatarso da topi deficienti in SOCS2, abbiamo dimostrato che l&#39;ormone della crescita è in grado di simulare il loro longitudinale crescita autonoma di insulina come fattore di crescita (IGF-1), a differenza di wild-type ossa metatarsali che non rispondono alla crescita trattamento ormonale 34, 41. Ciò evidenzia la misura in cui le culture metatarsali possono essere manipolati per esaminare gli effetti di diversi geni e / o fattori esogeni sulla crescita ossea endochondral. In sintesi, abbiamo detaicondotto un metodo per l&#39;estrazione di successo e cultura metatarsale embrionali che possono essere manipolate ed esaminati utilizzando una varietà di analisi. Questo modello ex vivo mantiene cellula-cellula e le interazioni cellula-matrice, così come contiene condrociti in diverse fasi di condrogenesi, fornendo quindi un modello più fisiologico di cellule in monostrato o coltura 3D. Metatarsali organo culture sono quindi un modello unico per lo studio dei meccanismi molecolari responsabili encondrale, e sono essenziali per migliorare la nostra comprensione sia la fisiologia dell&#39;osso e fisiopatologia

Lo scheletro è un organo altamente complessa, dinamica e complessa che ha una gamma di funzioni che vanno dalla locomozione, per l&#39;omeostasi di ioni. Composto da ossa e cartilagine, lo scheletro è costituito da popolazioni di cellule funzionalmente distinte che operano per mantenere la propria integrità strutturale, biochimico e meccanica 1. Una delle funzioni primarie dello scheletro è il suo ruolo nello sviluppo e crescita. Questi processi richiedono l&#39;orchestrazione di molteplici popolazioni cellulari che sono regolati attraverso endocrino stretto e controllo genetico. Con l&#39;eccezione della ossa piatte es scapola, cranio e dello sterno, lo scheletro dei mammiferi è formata attraverso il processo noto come encondrale. Questo processo, regolato sia molecolarmente e spazialmente, inizia con la condensazione di cellule mesenchimali derivate principalmente dal mesoderma 2. Sotto l&#39;influenza del fattore di trascrizione SOX9, cellule in the all&#39;interno degli condensazioni differenziarsi in condrociti, esprimere e secernere componenti cartilagine specifiche matrice extracellulare (ECM) come collagene di tipo II e aggrecano. Le cellule al margine della condensazione, esprimono collagene di tipo I e formo la pericondrio, delineando la prospettiva osso 3. Più tardi, i osteoprogenitors del pericondrio differenziano in osteoblasti, diretto da l&#39;espressione dei fattori di trascrizione, Runx2 e Osterix 4. Questo porta ad una predominanza di osteoblasti e questo strato viene rinominato periostio che forma un collare osseo mineralizzato intorno alla metà sezione dell&#39;osso. La penetrazione vascolare del periostio e l&#39;invasione del ponteggio cartilaginea avviene portando con sé, haematopoetically derivato cellule ossee riassorbimento, osteoclasti, che riassorbono i resti di condrociti e gran parte della matrice cartilaginea 5. Gli spazi formati sono riempiti da osteoprogenitors all&#39;origine della ossificazione primariacentro che occupa progressivamente il nucleo della diafisi e si fonde con il periostio. Altre cellule danno origine al midollo osseo. Intorno nascita, vasi sanguigni e osteoprogenitors penetrano la matrice cartilaginea ricca su entrambi i lati (epifisi) della diafisi sviluppo per formare il centro di ossificazione secondario. Situato tra l&#39;epifisi e diafisi alle due estremità delle ossa lunghe sono un gruppo di cartilagine - la cartilagine di accrescimento epifisaria - che è responsabile del coordinamento crescita lineare di tutte le ossa lunghe 6. I condrociti all&#39;interno della cartilagine di accrescimento inizialmente proliferano e successivamente progressi attraverso le zone morfologicamente distinte, coordinati da espressione sequenziale di fattori di trascrizione e di crescita. Il culmine di questa sequenza di eventi è l&#39;uscita dal ciclo cellulare e l&#39;ipertrofia dei condrociti al centro di questa cartilagine precursore. condrociti ipertrofici esprimono fortemente tipo X collagene e metalloproteinasi della matrice-13 (MMP13) e la loro notevole allargamento volume nella direzione della crescita longitudinale fornisce il maggior contributo alla crescita delle ossa nei mammiferi 7,8. Inoltre, condrociti ipertrofici mineralizzano loro ECM circostante attraverso il rilascio di vescicole matrice, strutture a membrana delimitata specializzati per la produzione di fosfato di calcio amorfo attraverso la loro inclusione di fosfatasi (tessuto non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e di calcio canalizzazione proteine ​​(annexins ) 9-11. Questa cartilagine calcificata è invasa da vasi sanguigni dal midollo sottostante con conseguente reclutamento degli osteoclasti e matrice di riassorbimento. Questa è seguita da migrazione degli osteoblasti e l&#39;allineamento alla superficie dei resti cartilagine calcificata dove stabiliscono uno strato di osteoide che è rapidamente mineralizzato. Il tessuto osseo del spugnoso è poi ristrutturato per osso lamellare della spongiosa secondario 12. risultati di fusione epifisari nelcessazione di encondrale 13. Encondrale è sotto stretta regolamentazione da molti ormoni endocrini e paracrini e fattori di crescita, in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e / o la crescita delle ossa longitudinale 14. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questi processi è quindi indispensabile nella nostra ricerca di progressi clinici verso beneficio umano. Precedenti ricerche sulle somiglianze e le differenze tra le cartilagini di accrescimento di differenti età, luoghi e specie hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione dei meccanismi fisiologici che circondano dinamiche cartilagine di accrescimento 15,16. Tuttavia, lo studio dei condrociti isolati è difficile, come la rimozione dei condrociti dal loro ambiente può portare a dedifferentiation, accompagnato da perdita di espressione di marcatori chiave come COL2A1 17. Il mouse metatarso espianto di organi, pioneered dal Prof. Elisabeth Burger ei suoi colleghi nei Paesi Bassi, è un ex vivo modello altamente fisiologico per lo studio encondrale e la crescita delle ossa, come il tasso di crescita delle ossa nella cultura imitano quello visto in vivo 18. Unicamente, la cultura organo metatarso consente l&#39;esame dei condrociti in diverse fasi di condrogenesi e mantiene cellula-cellula e cellula-matrice interazioni, fornendo quindi condizioni più prossime alla situazione in vivo di cellule in coltura 19-21. Inoltre, questo modello consente esame diretto della crescita ossea lineare che non è possibile in colture di condrociti primari. Esso permette anche la separazione dei fattori sistemici e locali permettendo quindi l&#39;analisi specifica degli effetti locali sulla piastra di crescita. La cultura del metatarsi permette lo studio di numerosi parametri. misurazioni giornaliere di lunghezza totale e delle regioni di mineralizzatii rudimenti possono essere eseguite con microscopio a contrasto di fase di serie e il software di analisi delle immagini. Istologica, ibridazione in situ e la colorazione immunoistochimica può essere facilmente eseguita su sezioni metatarsali, che permette la risoluzione spaziale di entrambe le entità cellulari e molecolari, un importante vantaggio rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare. L&#39;approccio immunoistochimica include il rilevamento e la quantificazione di 5-bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) assorbimento da proliferazione condrociti 22. Inoltre, ulteriore trattamento di tessuti metatarsali può essere effettuato per consentire un&#39;analisi valle di mRNA (RT-qPCR), proteine ​​e analisi segnale intracellulare (Western blotting) o la composizione lipidica (spettrometria di massa). La maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzano metatarsi embrionali in coltura piuttosto che metatarsi da animali post-natale. Mentre entrambi i modelli possono essere informativo, lo studio delle ossa embrionali ha diversi vantaggi: crescono più velocemente e può essere exploited per studiare l&#39;inizio e la progressione del 23-25 processo di mineralizzazione. Questo protocollo descrive in dettaglio la dissezione intricata di metatarsi embrionali dalla dell&#39;arto posteriore di giorno embrionale 15 (E15) embrioni murini. Inoltre, viene mostrato la crescita e la mineralizzazione dei metatarsi anatomicamente distinte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500342</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500339</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFine Vannas scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Dilute to 70% v/v in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM without nucleosides</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters (0.22&#956;m) 33mm diameter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0378</td>
			<td>Add directly to the media prior to experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

Lo scopo di questo metodo è per isolare metatarsi e li cultura embrionali per l&#39;esame della crescita ossea longitudinale ed ECM mineralizzazione. Utilizzando il nostro protocollo qui descritto, ossa del metatarso embrionali sono stati sezionati con successo, come visualizzato al microscopio ottico. Misure di ossa metatarsali, condotti come indicato nella figura 1, hanno mostrato la loro capacità di crescere in lunghezza longitudinale ed mineralizzare loro ECM (figure 2 e 3). Mineralizzazione della matrice viene prima osservato nella metà diafisi del rudiment dell&#39;osso ed è facilmente osservata al microscopio ottico. Nessuna colorazione è richiesto anche se l&#39;assorbimento di calceina può offrire una migliore visualizzazione del minerale di nuova formazione. Gli studi che utilizzano metatarsi embrionali per data 22,27,28 hanno messo in comune la sezionato 2 °, 3 ° e 4 ° (CENtrali tre) metatarsi, assumendo in crescita in vitro e la mineralizzazione per essere comparabili. In vivo dello sviluppo di metatarsi murini, tuttavia, rivela che i 3 ° e 4 ° cifre hanno evidenza di mineralizzazione prima di tutti gli altri metatarsi e falangi 29. Valutazione del potenziale di crescita e la mineralizzazione della singolarmente isolate e coltivate E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso ha rivelato differenze significative nella comparsa o alla portata di mineralizzazione dopo 7 giorni di coltura (Figura 2). Nessuna differenza nella percentuale di aumento dal basale è stata rilevata durante il periodo di coltura. Come è stato notato differenze nel potenziale di mineralizzazione il protocollo standard di mettere in comune i 2 ° 3 ° e 4 ° metatarso appare valida per gli studi futuri. Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mediautilizzato per cultura metatarsi embrionali per promuovere ECM mineralizzazione. Tuttavia, in studi di coltura cellulare, è stato dimostrato che se TNAP enzima viene aggiunto al supporto osteogeniche contenenti βGP, ectopica deposizione minerale idrossiapatite persiste anche in assenza di cellule 30. Per esaminare gli effetti dei vari substrati di mineralizzazione e agonisti sulla capacità metatarso mineralizzazione, abbiamo colto metatarsi E15 in terreni di coltura contenente una gamma di integratori, e le immagini e le misure di lunghezza sono stati registrati tutti i giorni. I risultati hanno indicato che la E15 ossa del metatarso ancora crescere e mineralizzano la ECM, in assenza di βGP. E15 metatarsale coltivate in acido ascorbico solo media hanno mostrato aumenti comparabili lunghezza e mineralizzazione come metatarsi coltivate in presenza di βGP (figura 3). Abbiamo anche dimostrato che lentivirus può essere utilizzato per trasfettare DNA esogeno in Metata coltarsals. Qui abbiamo trasfettato con successo ossa del metatarso del giorno 0 della cultura (cioè giorno di dissezione) con 2 x 10 6 verdi particelle virali proteina fluorescente (GFP) per metatarso. Per abilitare la trasduzione del virus, polibrene è stato contemporaneamente aggiunta alle culture a 1: 500. Le colture sono state lasciate per 7 giorni, senza modifiche di supporto come richiesto per E15 metatarso mineralizzazione a verificarsi, prima di essere incubate con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia per 5 minuti e poi direttamente visualizzati utilizzando un microscopio confocale ( Figura 4). La nostra prova di esperimenti concettuali mostrano chiaramente trasduzione efficace. Tuttavia sarebbe opportuno esaminare sezioni durante l&#39;interezza del metatarso per valutarne la trasfezione ed efficace manipolazione genetica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Figura 1: metodologia standard usato per misurare tegli lunghezza e la mineralizzazione zona di embrionali Metatarso. (A) Misure totali di lunghezza di metatarsi E15 il giorno 0 della cultura (giorno di dissezione) presa attraverso il centro del metatarso. (B) Le misure di lunghezza longitudinale totale di un metatarso dopo sette giorni in coltura. Si noti la leggera curvatura del metatarso. (C) Misurazione della lunghezza della zona di mineralizzazione dopo sette giorni di coltura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> Figura 2: crescita e mineralizzazione capacità di anatomicamente distinto E15 Metatarso Imaging e misura del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso dalla dell&#39;arto posteriore di topi E15 w.interpretato. (A) le immagini seriali del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per tutto il periodo di coltura. (B) Aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 ad ogni giorno di coltura. (C) Lunghezza minerale del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarsi nel periodo di coltura espresso come percentuale della lunghezza totale metatarso. Dati in sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). (D) C57Bl / 6J metatarsali lunghezze in ogni giorno della cultura. Dati in sono rappresentati come media ± deviazione standard (n = 6). Nero bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Figura 3: la crescita e la mineralizzazione capacità di Wild-typeE15 Metatarsi coltivate in vari media Osteogenic. (A) le immagini seriali di metatarsi coltivate in acido ascorbico solo 1 mm βGP 3 mm phosphocholine, cloruro di calcio 1,5 mm o cloruro di calcio 3 mM contenente supporti. (B) aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 del metatarso coltivate con i vari supplementi. (C) Lunghezza minerale di metatarsi coltivate in vari media espressa come percentuale della lunghezza totale metatarso. I dati sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). Nero bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Figura 4: Transfection di E15 Metatarso con GFP virus Particoli. ossa del metatarso (A) E15 sono state trasfettate con particelle virali GFP per proof of concept. (B) Le ossa sono state colorate con DAPI per la visualizzazione del DNA. (C) Due immagini indicate trasfezione successo del virus GFP tutta la totalità delle ossa del metatarso. Barre bianche = 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.0K Views.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

Video: Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

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Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...