We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

동물 주제와 관련된 절차 공급 또는 과학적인 목적에 사용 사육 동물의 주거 및 관리에 대한 실천의 코드를 출판 영국 동물 (과학적 절차) 법 1986과 동물이 홈 오피스에 따라 유지 하였다 준수 실시 하였다. 주 : 야생형 C57BL / 6J 마우스를 사용하여 수행 실험은 잘 확립하고 설명한다. 자신의 성장과 광물 가격은 여기에 설명 된 것과 다를 수 있지만 다른 마우스 변종에서 배아 중족골 마찬가지로, 체외에서 배양 할 수있다. 1. 해부 조건 및 악기의 제조 <ol><li> 미디어 및 배아 초보의 불임을 보장하기 위해 층류 후드에있는 모든 미디어 준비, 조직의 해부와 문화 작업을 수행합니다. </li><li> 문화와 해부 미디어를 사용하기 전에 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 적어도 1 시간 동안 평형을 허용합니다. </li><li> 해부를 소독가위, 뒤몽 # 5 뒤몽 # 고압 증기 멸균에 의한 극상 Vannas 마이크로 가위와 함께 4 핀셋 (8cm 직선, 3mm 블레이드). 오토 클레이브 후, 70 % 에탄올에 사용하기 전에 절개 장치 젖어. </li></ol> 해부 문화 미디어 2. 준비 <ol><li> 해부 매체를 준비 <ol><li> 인산 완충 식염수 (PBS) (1시 13분)에서 α-최소 필수 미디어 (뉴 클레오 시드없이 αMEM)을 희석하고, 필터는 0.22 μm의 33 mm 직경의 주사기를 통해 멸균 전에 2 밀리그램 / m의 L에 소 혈청 알부민 (BSA)을 재현 탁 필터. 주 : 해부 매체가 될 수 있고, 필터 멸균 무기한 -20 ℃에서 분취 량으로 저장. </li></ol></li><li> 문화 매체를 준비 <ol><li> (각 웰의 24 웰 배양 판) 배지 300 ㎕의 문화 배아 중족골. / V 승 BSA 0.2 %를 첨가하여 배지를 준비; / ㎖의 L-ASCO 5 μg의rbic 산 포스페이트; 1 mM의 β-글리세 (βGP, 옵션 - 결과 섹션 참조) 0.05 ㎎ / ㎖의 겐타 마이신 및 1.25 μg의 αMEM에 암포 테리 신 B 및 필터 0.22 μm의, 33mm 직경의 주사기 필터를 통해 살균. </li></ol></li></ol> 3. 쥐 배아 에릭손 해부와 문화 <ol><li> 영국에 본사 지침에 따라 자궁 전위에 의해, 15 일 된 배아를 품고, 임신 마우스를 추려 </li><li> 동물 부정사를 놓고 70 % 에탄올로 분사하여 피부를 소독. 사용 해부 가위는 피부와 복강을 노출 복막을 모두 관통, 중간 선에 큰 절개를합니다. </li><li> 체강의 등 지역에서 동물의 두 자궁 뿔을 찾습니다. 먼저 해부 가위로 조심 절개하여 mesometrium에서 각각의 자궁을 확보 한 다음 마지막으로 자신의 기지에서 무료로 자궁 뿔을 절단하여 자궁 뿔을 제거합니다. PLAC해부 매체로 전자 자궁 뿔. </li><li> 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 절단하여 각각의 배아를 분리하고 집게를 사용하여 자신의 개인 주머니에서 배아를 제거합니다. 영국에 본사 지침에 따라 잘린에 의해 도태 배아 </li><li> 70 % 에탄올로 분사하여 피부의 소독 후, 근위 대퇴골 주위를 절개하여 태아의 뒷다리를 제거하기 위해 Vannas에게 마이크로 가위를 사용합니다. 제거 가능한이 뒷다리만큼 보장한다. 에릭손 해부하기 전에 해부 매체에 잠긴 배양 접시에 두 다리를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경에서 곤란과 안정 뒷다리를 들고 # 4 핀셋을 사용하는 동안 # 5 핀셋을 사용하여 전원을 당겨, 배아 발을 둘러싸고있는 피부를 제거하기 시작합니다. 이것은 가장 효과적으로 경골의 주위에 피부를 잡고 지골 향해 당겨 행해진 다. 이 단계에서 위의 사용은 잘라매우 얇은 피부가 필요하지 않습니다. </li><li> 조심스럽게 # 4 핀셋으로 배아 다리의 tarsals을 잡고 # 5 핀셋을 사용하여 버립니다 tarsals 근처에 떨어져 곤란하여 첫 번째와 다섯 번째 중족골를 제거합니다. </li><li> 같은 위치에서 개최 된 다리로, 나머지 세 지골과 중족골 사이의 결합 조직을 방해하기 위해 # 5 핀셋을 사용합니다. 중족골에서 지골을 제거 할 지골과 중족골 사이의 관절에 # 5 핀셋의 끝을 삽입합니다. </li><li> 마지막으로, tarsals과 중족골 사이의 결합 조직을 방해하는 5 핀셋 #을 사용합니다. 다시 tarsals에서 tarsals 및 중족골 부드럽게 무료 중족골 사이의 공동 공간에 # 5 핀셋의 끝을 배치합니다. </li><li> 부드럽게 신선한 해부 매체에서 # 4 핀셋과 장소 지금 무료 중족골을 선택합니다. 참고 : 조심 해부 각 배아에서 6 중족골을 제공해야한다. </li><li> 필요한 모든 중족골이 해부되었을 때, carefu개별적으로 배양 배지 300 μl를 함유하는 미리 가온 된 24 웰 플레이트로 에서야 장소 중족골. 최대 14 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 문화 중족골. 참고 :이 자신의 광물 기능 (26)에 영향을 미치는으로 문화의 적어도 5 일까지 E15 문화의 미디어를 변경하지 마십시오. 이에 대한 이유는 불분명하지만, 선형 성장 매트릭스 광물은 중족골 해제 성장 인자에 의한 자극에 의존 할 수있다. </li></ol> 4. 분석 및 중족골 문화의 조작 <ol><li> 해부 (0 일)의 날 디지털 카메라 부착 및 이미지 분석 소프트웨어와 함께 현미경을 사용하여 초기 길이 측정을합니다. 그것은 문화의 몇 일 후에 나타날 때 중앙 광물 영역의 길이를 측정합니다. </li><li> 필요에 따라 주기적으로, 어떤 점 m에서 문화의 마지막 날까지 (보통 매일 2 회 일) 추가로 측정을etatarsal 뼈 (소개에서 설명)가 필요합니다 결과에 의존 처리됩니다. </li><li> 다양한 외생 적 요인 중족골 기관 배양의 보충 매체는 성장 인자, 호르몬과 문화 (22, 24)의 일 0에서 약리 에이전트를 예. 이러한 종류의 모든 연구에서 치료 중족골이 필요합니다 제어 할 수 있습니다. 참고 :이 제어 뼈가 반대쪽 다리에서 해당 퇴화 것을 권장하지만, 선형 성장 또는 배양 E15 2 차의 광물 잠재력에 어떤 차이가 없었다, 3 번째와 4 번째 중족골 (아래 참조, 그림 2) . </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

쥐의 배아 중족골의 문화는 연골의 성장과 광물의 높은 생리 학적 모델을 제공합니다. 초기 연구는 E15 마우스 중족골이 골격의 성장과 분화의 정상적인 패턴을 겪는 것을 확인했다. 연골 (연골) 및 뼈 (조골 세포와 파골 세포) 세포 및 해당 콜라겐 매트릭스는 생체 내에서 관찰 된 것과 구별된다. 그러나,이 모델의 어떤 인식 된 제한이있다. 파골 세포 분화의 속도는 (그러나 연골 분화를 생략)이다 뼈 성장을 손상한다. 뼈 성장을 생체 내에서 관찰되는 것보다 약 50 % 느린와 로컬 요인 (예를 들어, IGF-1, BMP 형식 등) (31)의 생산에 영향을 미치는 요인으로 전신 결핍에 기인 할 수있다. 또한, 잘 뼈 기계적 환경에 민감한 것으로 인식되고, 이는 또한 C 응답 배양 중족골에 대한 경우이다기계적로드 (32, 33)에 hanges. 따라서, 언로드 상황으로서이 프로토콜 광물에 기재된 미네랄 흡수가 손상 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중족골 모델 직접 관내 배양 시스템에서 2D와 3D로 불가능 선형 뼈의 성장을 측정하는 능력을 제공한다. 우리는 처음 참 E15 쥐 중족골과의 박리 및 배양에 관련된 프로토콜의 포괄적 인 설명을 제공하고, 실험 2 차, 3 차 및 4 차 중족골 풀링의 유효성을 확인한다. E17 / E18에서 중족골은 일반적으로 (문화 십사일 이상, 즉) 오랜 기간 동안 생체 성장을 자신의 특별한 잠재력으로 인해 뼈 성장의 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 이들은 배아 종 뼈 성장에 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 확립 된 모델이다.또한, 생후 중족골의 절개 및 배양 일반적으로는 산후 뼈의 성장 및 태아의 뼈 성장 21 다르게 조절되는 것을 알 수있는 바와 같이 산후 뼈 성장을 둘러싼 메커니즘을 묘사하는데 사용된다. 배양 출생 중족골에서 관찰 된 뼈의 성장은 장기간의 연구에서 자신의 잠재력을 제한하고이 출생 후의 단계에서 뼈의 성장에 더 체계적인 영향을 강조하지만 배아 초보 25,34에서 관찰 된 것보다 훨씬 작다. 실제로, 마우스 3 일된 생후 중족골는 일반적으로 측정 성장 34를 얻는데 사용될 수있는 최신 단계이다. 여기에서 우리는 E15에서 배아 중족골 뼈의 분리에 대한 우리의 프로토콜을 설명합니다. E15의 중족골에 hydroxyapaptite 미네랄의 부재는 또한 길이 비교할 뼈 성장을 둘러싸뿐만 메커니즘을 조사하는 모델이지만 개시를 제공하는 것을 의미골격 광물. 터미널 비대 연골 세포 영역의 광물 행렬은 이후 광물 인 뼈 특정 매트릭스 (유골)을 누워 골아 세포 침입을위한 발판을 제공하고, 이러한 초기 광물로 성공적이고 기능적인 골 형성 (35)에 매우 중요합니다. 실제로 E15의 중족골을 이용하여 최근 보고서 수는 광물 처리 28,36,37의 조사를 위해 자신의 독특한 능력을 확인했다. 또한, 연구진은 뼈 성장 / 광물 설정 외부 모델로서 배아 중족골의 전위를 강조 혈관 (38)의 모델로 E15의 중족골의 사용을 설명했다. 우리가 설명하는 프로토콜은 층류 후드, 절개를 수행하기위한 해부 현미경 및 적출 초보의 문화에 대한 CO 2 배양기를 포함한 만 표준 실험실 장비를 필요로한다. 또한, 아주 기본적인 막 다른매체 αMEM, BSA, 항생제, 항진균제 및 L- 아스 코르 빈산 함유 진짜야 (하이드 록시 프롤린 및 히드 록시 리신의 합성 공동 인자, 콜라겐 (39)의 생산을위한 두 가지 필수 아미노산) 등의 동물 혈청로서 정의 첨가제의 사용을 피 . 전통적으로, 연구자들은 문화 배아 중족골에 사용되는 미디어에 βGP을 추가 한하지만 우리의 결과에 계시, 추가로 인산 소스의 사용이 문화 시스템의 성공적인 광물 필요하지 않습니다. 이 ECM 광물을 뒷받침하는 메커니즘을 이해하는 우리의 추구에서 중요한 발견이다. 중족골 이전 긴 뼈 (40)의 발달 조절에 성장 인자 β를 변화시키는 역할을 탐색 된 Smad2의 우성 음성 형태를 포함하는 아데노 바이러스로 감염되었다. 여기에서 우리는 t을 나타내는 GFP 바이러스 입자 야생형 E15의 중족골 뼈의 성공적인 형질 공개모자 렌티 기술 용이 중족골 배양에서 유전자 발현을 조작하기 위해 채택 될 수있다. 마찬가지로, 중족골 기관 배양 물 시스템은 더 골 성장 과정에서 특정 유전자의 역할을 이해하기 위해 유전자 변형 마우스의 뼈의 성장을 비교하기에 우수한 모델이다. 이전의 연구는 연골 내 골 성장 사이토 카인 시그널링 억제 -2- (SOCS2)의 역할을 결정하기 위해 중족골 기관 배양 시스템을 사용하고있다. SOCS2의 결핍 마우스에서 중족골 뼈를 사용하여, 그 성장 호르몬은 성장 인자와 같은 인슐린 그들의 길이 성장 독립적를 시뮬레이션 할 수있다 나타났다 (IGF-1), 성장 호르몬 치료 (34)에 반응하지 않는 야생형 중족골 달리 41. 이것은 중족골 배양 상이한 유전자 및 / 또는 연골 내 골 성장 외인성 요인의 영향을 조사하기 위해 조작 될 수있는 정도를 강조한다. 요약하면, 우리는 detai이조작 할 수있다 배아 중족골 뼈의 성공적인 추출 및 배양하는 방법을지도하고 다양한 분석을 이용하여 조사 하였다. 이 생체 모델은 따라서 단일 층 또는 3 차원 배양 세포보다 더 생리 학적 모델을 제공 할뿐만 아니라 연골의 다른 단계에서 연골 세포가 들어 있으므로, 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 에릭손 기관 배양 따라서 연골 골화을 담당하는 분자 메커니즘을 조사에 대해 고유 한 모델이며, 뼈 생리학 및 병태 생리 양에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 필수적이다

골격 이온 항상성에 걸쳐 운동에서 다양한 기능을 갖는 고도로 복잡 동적 복잡한 기관이다. 뼈와 연골의 구성, 골격은, 구조 생화학 적 및 기계적 무결성 1의 유지 운영 기능적으로 서로 다른 세포 집단으로 구성되어 있습니다. 골격의 주요 기능 중 하나는 발전 및 성장의 역할이다. 이러한 프로세스는 꽉 내분비 및 유전 적 제어를 통해 규제하는 여러 세포 인구의 오케스트레이션을 필요로한다. 평탄 뼈 예 견갑골, 두개골 및 흉골 제외한 포유류 골격 연골 내 골화으로 알려진 과정을 통해 형성된다. 조절 분자 둘 공간적이 프로세스는, 중배엽이 주로 유래 중간 엽 세포의 축합으로 시작한다. 전사 인자의 SOX9의 영향으로, 세포 일에응축의 전자 내부 표현 및 유형 II 콜라겐과 aggrecan과 같은 연골 특정 세포 외 기질 (ECM) 성분을 분비, 연골 세포로 분화. 응축의 마진에서 세포는 미래의 뼈 3 서술, I 콜라겐과 연골막을 형성 유형을 표현한다. 나중에, 연골막의 osteoprogenitors는 전사 인자, Runx2와 osterix 4의 발현 감독, 조골 세포로 분화. 이 조골 세포의 우위로 연결이 층은 뼈의 중간 부분 주변의 광물 뼈 고리를 형성하는 골막을 이름이 변경됩니다. 연골 지지체의 골막과 침략의 혈관 침투, 그것으로 데려 haematopoetically 연골 세포 잔해와 연골 매트릭스 (5)의 많은 부분을 재 흡수 뼈 재 흡수 세포, 파골 세포를 유도 발생합니다. 형성된 공간은 일차 골화에 야기한 osteoprogenitors 의해 채워진다점진적으로 골간의 핵심을 차지하고 골막와 합병 센터. 기타 세포는 골수 일으킨다. 출생 주변 혈관 osteoprogenitors 이차 골화 중심을 형성하는 현상 골간의 양측 (골단)에서 다양한 연골 매트릭스를 관통. 골단 성장판 - - 모든 긴 뼈 (6)의 선형 성장을 조정하는 책임이있는 긴 뼈의 양쪽 끝에서 골단과 골간 사이에 위치한 연골의 밴드이다. 성장판에서 연골 세포는 처음 증식 및 이후 전사 및 성장 인자의 연속 식으로 조정 형태 학적으로 서로 다른 영역을 통해 진행. 이러한 일련의 이벤트의 절정이 연골 전구체의 중심 연골 세포의 세포주기 및 비대에서 출구이다. 비대 연골 세포 강력 X 형 콜라겐 매트릭스 메탈로 표현-13 (MMP13)와 종 방향 성장의 방향으로 자신의 상당한 볼륨 확대는 포유 동물 7,8에서 뼈의 성장에 가장 큰 기여를 제공합니다. 또한, 비후성 연골 매트릭스 소체의 방출을 통해 주변 ECM을 무기화 멤브레인 경계 구조는 포스파타제의 포함 (조직 비특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP) 및 PHOSPHO1) 칼슘 채널링 단백질 (annexins 통해 비정질 인산 칼슘의 제조에 전문 ) 9-11. 이 석회화 연골은 파골 세포의 모집 및 매트릭스 흡수의 결과로 기본 골수에서 혈관에 의해 침략된다. 이것은 그들이 빠르게 광물이다 유골의 층을 아래로 누워 석회화 연골 잔재의 표면에 조골 세포의 이동 및 정렬옵니다. 기본 spongiosa의 짠 뼈는 나중에 보조 spongiosa (12)의 층상 뼈 리모델링된다. 에 골단 융합 결과연골 골화 (13)의 중단. 교란 현상 및 / 또는 뼈의 성장 길이 14을 방지하도록 연골 내 골화 많은 호르몬 분비 호르몬 및 성장 인자에 의해 엄격한 규제 받고있다. 이러한 프로세스를 뒷받침 분자 및 세포 메커니즘의 이해는 인간의 이익으로 임상 발전의 추구에 따라서 필수적이다. 유사점과 다른 나이, 위치와 종의 성장 판 사이의 차이에 대한 이전의 연구는 크게 성장판 역학 (15, 16)을 둘러싼 생리 학적 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 자신의 환경에서 연골 세포의 제거는 Col2a1 (17)와 같은 주요 마커의 발현 감소와 함께, 탈분화로 이어질 수 그러나 고립 된 연골 세포의 연구는 어렵다. 마우스 에릭손 기관 체외 이식편 문화, 파이네덜란드의 교수 엘리자베스 버거와 동료에 의해 oneered, 문화 생체 (18)에서 본 것을 모방 뼈의 성장 속도로 연골 골화와 뼈의 성장을 연구하기위한 고도의 생리적 생체 모델입니다. 유니 클리, 중족골 기관 배양 따라서 문화 19 ~ 21 세포에 비해 생체 내 상황에 가까운 조건을 제공 연골의 다른 단계에서 연골 세포의 시험을 허용하고 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 또한,이 모델은 기본 연골 세포 배양에서 수 없습니다 선형 뼈의 성장을 직접 검사 수 있습니다. 또한 따라서 성장판 로컬 효과의 구체적인 분석을 허용 조직 및 지방 요소의 분리를 허용한다. 중족골의 문화는 다양한 매개 변수의 조사를 할 수 있습니다. 전체 길이와의 광물 지역의 일일 측정초보 표준 위상차 현미경과 화상 해석 소프트웨어로 수행 될 수있다. 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 염색의 조직학은 용이 셀룰러 분자 실체, 기존의 세포 배양 방법에 비해 큰 장점의 공간 해상도를 허용 중족골 부에서 수행 될 수있다. 면역 조직 화학적 방법은 연골 세포 (22) 증식에 의한 탐지 및 5- 브로 모 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 정량화를 포함한다. 또한 중족골 조직의 추가적인 처리는 mRNA 발현 (RT-qPCR에), 단백질 및 세포 내 신호 분석 (웨스턴 블롯) 또는 지질 조성물 (질량 분석법) 하류의 분석을 허용하도록하여 수행 될 수있다. 현재까지 대부분의 연구는 산후 동물에서 배양 된 배아 중족골이 아닌 중족골을 사용합니다. 그들은 빠르게 성장하고 EXPLO 수 있습니다 : 두 모델은 정보가 될 수하는 동안, 배아 뼈의 연구는 몇 가지 장점이 있습니다제한없는이 광물 처리 23-25의 개시 및 진행을 공부합니다. 이 프로토콜은 구체적으로 배아 일 15 (E15) 쥐의 배아의 뒷다리에서 배아 중족골의 복잡한 해부에 대해 설명합니다. 또한, 해부학 적으로 별개의 중족골의 성장과 광물이 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>Dissection scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>Dumont #4 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoclave sterilise before use</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Dilute to 70% v/v in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM without nucleosides</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters (0.22 &amp;mu;m) 33 mm diameter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Add directly to the media prior to experimentation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

이 방법의 목적은 길이 방향의 뼈의 성장과 ECM 광물의 검사를 위해 배아 중족골과 문화를 분리하는 것이 었습니다. 광학 현미경에 의해 가시화로 본원에 기술 된 프로토콜을 사용하여 배아 중족골 성공적 해부 하였다. 그림 1에 나타낸 바와 같이 실시 중족골 뼈의 측정은, 자신의 ECM 세로 길이 성장하고 무기화 할 능력 나타났다 (그림 2, 3). 행렬의 광물 먼저 뼈 퇴화의 중간 골간에 언급되어 쉽게 광학 현미경으로 관찰된다. 칼 세인의 흡수가 새로 형성된 광물의 향상된 시각화를 제공 할 수 있지만, 어떤 염색이 필요하지 않습니다. 날짜 22,27,28에 배아 중족골을 이용한 연구가 해부 2 차를 풀링 한 3 번째와 4 번째 (CENTRAL 세) 중족골은 체외 성장과 광물에서 가정하는 것은 비교할 수 있습니다. 쥐 중족골의 생체 발달은, 그러나, 3 번째와 4 번째 자리가 이전에 다른 모든 중족골과 지골 (29)에 광물의 증거를 가지고 있음을 알 수있다. 개별적으로 분리 및 배양 E15 2 차의 성장과 광물 잠재력의 평가, 3 번째와 4 번째 중족골 문화 7 일 (그림 2) 후 광물의 모양이나 정도에 유의 한 차이를 보이지 않았다. 베이스 라인에서 백분율 증가의 차이는 배양 기간 동안 발견되지 않았다. 광물 전위의 차이가 관찰되지되었을 때 2 차 3 차 4 번째 중족골 풀링의 표준 프로토콜 미래 연구를위한 유효 나타납니다. 전통적으로, 연구자들은 미디어에 βGP 추가ECM 광물을 촉진하기 위해 문화 배아 중족골에 사용됩니다. 그러나, 세포 배양 실험에서, TNAP βGP 효소를 함유하는 골 형성 배지에 첨가하면, 히드 록시 아파타이트 이소성 무기물 증착에도 여전히 셀 (30)의 부재에서 발생하는 것으로 나타났다. 에릭손 광물 기능에 다양한 광물 기판 및 작용제의 효과를 조사하기 위해, 우리는 보충의 범위를 포함하는 배양 배지에서 E15의 중족골을 배양, 이미지 및 길이 측정은 매일 기록 하였다. 결과 E15 중족골 뼈가 계속 성장 βGP의 부재들은 ECM을 무기화 것으로 나타났다. 중족골이 βGP (그림 3)의 존재하에 배양로 아스 코르 빈산에서 배양 E15 중족골 뼈는 미디어 길이와 광물에 필적하는 증가를 보였다. 또한 렌티 바이러스를 배양 metata로 외래 DNA를 형질 사용될 수 있음을 보여 주었다rsals. 여기에서 우리는 성공적으로 중족골 당 2 × 10 6 녹색 형광 단백질 (GFP) 바이러스 입자와 문화 (해부의 예 일)의 일 0에 중족골 뼈를 형질 전환. 바이러스 전달을 사용하려면, 폴리 브렌 동시에 1 문화에 추가되었습니다 : 500. 문화는 공 초점 현미경 (사용 4로 배양되기 전에 발생하는 E15의 에릭손 광물에 필요한 5 분 동안 6 diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 얼룩, &#39;더 미디어 변화에 7 일 동안 방치 한 후 직접 시각화 하였다 그림 4). 개념 실험의 우리의 증거가 명확 효과적인 전달을 보여줍니다. 그러나 그들의 형질 효과적인 유전자 조작을 평가 중족골의 전체에 걸쳐 부분을 검사 신중하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> 그림 1 : 표준 방법론 t를 측정하는 데 사용그 길이와 배아 중족골의 무기화 영역. (A) 문화의 날 0에 E15의 중족골의 총 길이 측정 (해부의 날) 중족골의 중심을 촬영. 문화 칠일 후 중족골의 총 길이 방향의 길이 (B) 측정. 중족골에서 약간의 곡률을합니다. (C) 문화 7 일 후에 광물 영역 길이의 측정. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> E15 마우스의 뒷다리 w에서 성장과 해부학 고유 E15 중족골 이미징의 광물 용량 및 제 2의 측정, 3, 4 중족골 : 그림 2.수행으로. (A) 배양 기간 동안 2, 3, 4 중족골의 직렬 이미지. 문화의 매일의 일 0에서 길이 (B) 비율 증가. 배양 기간 동안 제 2, 3, 4 중족골의 (C) 미네랄 길이 중족골 총 길이의 비율로 나타냈다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 표시된다 (N = 6). (D) 문화의 매일의 C57BL / 6J 중족골의 길이. 데이터는 표시되는 평균 ± 표준 편차 (N = 6). 블랙 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> 그림 3 : 야생 형 성장 광물 화 용량각종 골 형성 매질에서 E15 중족골 배양 하였다. (A) 만 아스코르브 산, 1mM의 βGP 3 밀리미터 포스 포 콜린, 1.5 mM의 염화칼슘 또는 매체를 포함하는 3 mM의 염화칼슘 배양 중족골의 일련의 이미지. 중족골의 일 0 길이 (B)의 백분율 증가는 다양한 보조제 배양 하였다. 다양한 매체에서 배양 중족골의 (C) 미네랄 길이 중족골 총 길이의 비율로 나타냈다. 데이터는 평균 ± 등을 평균의 표준 오차 (SEM)에 표시된다 (N = 6). 블랙 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> 그림 4 : GFP 바이러스 P와 E15 중족골의 형질기사. (A) E15 중족골 뼈는 개념의 증거에 대한 GFP 바이러스 입자로 형질 감염시켰다. (B) 뼈는 DNA의 시각화를위한 DAPI로 염색 하였다. (C) 이중 이미지는 중족골의 전체에 걸쳐 GFP 바이러스의 성공적인 형질 감염을 나타내었다. 화이트 바 = 0.5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.5K 조회수.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

태아와 신생아 뮤 린 긴 뼈를 배양 하 고 측정

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

의학

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Endochondral 골절 표준화 된 Biomechanical 조건 하에서 쥐에서 치유를 분석 하는 최소 침 습 모델

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Trilineage Fluorescent Mice를 사용한 정확한 성장판 손상 연구

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones are overloaded.&#160;Better treatments for severely fractured growth plates are needed because the response to injury is a bony bridge that prematurely fuses the growth plate, leading to stunted and/or crooked limbs. Murine models of growth plate injury are advantageous for mechanistic studies, but&#160;are challenging because it is difficult to visualize and precisely injure the small growth plates in young mice.&#160;We describe here an improved growth plate injury model using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X.
These mice show native fluorescence associated with the three primary substrata of the growth plate. A growth plate injury similar to a Salter-Harris Type II injury is created reproducibly with a bur using the hypertrophic section of the growth plate as a reference during live imaging under fluorescence stereo microscopy guidance. Frozen histology analysis of the native fluorescence simplifies assessing the cellular response to injury. This methodology represents a substantial leap in growth plate injury research, providing a detailed and reproducible method for investigating pathology and evaluating new therapeutic strategies.

저자 스포트라이트: Advancing Growth Plate Injury Model Using Trilineage Fluorescent Reporter in Mice (생쥐에서 Trilineage 형광 리포터를 사용한 성장판 손상 모델 발전)

This protocol describes an improved mouse model for adolescent bone growth plate injuries. Using transgenic mice with tri-lineage fluorescent reporters for collagen types I, II, and X, the primary matrices associated with three different substrata of the growth plate, injury placement is guided by native fluorescence under the microscope.

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

마우스에서 Diaphyseal 대퇴골 골절 모델 확립

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

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Endochondral 골절 표준화 된 Biomechanical 조건 하에서 쥐에서 치유를 분석 하는 최소 침 습 모델

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

마우스에서 Diaphyseal 대퇴골 골절 모델 확립