The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل جامعة كايو المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC - عدد موافقة: 09221) واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية في التجارب على الحيوانات في جامعة كيو لاستخدام الحيوانات في مجال البحوث. تم عزل العينات البشرية من جيفة التبرع بها لقسم التشريح، جامعة كيو كلية الطب، واستخدمت وفقا للوائح المؤسسية. 1. عزل السمعية بولا وكبسولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران في وعاء يحتوي على منصة فوق المناشف الورقية غارقة في الأيزوفلورين أو سيفوفلوران حتى تتوقف تهوية الجهاز التنفسي لأكثر من دقائق ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم. كن حذرا لتجنب الاتصال المباشر من الفئران مع مناشف ورقية مبللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق عرضي صغير في الجانب الظهري من الرقبة وسحب الجلد بعيدا نحو الرأس والذيل باستخدام كلتا اليدين لفضح الأساسي مو الرقبةالأنسجة scle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفئران في منطقة عنق الرحم باستخدام 14 سم مقص جراحي حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الجلد تماما نحو الأنف. قطع جميع الجلد جنبا إلى جنب مع خطم والقواطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مقص في الفم وقطع العضلات الماضغة في كلا الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الفك بعناية وإزالة اللسان والفك السفلي معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص حاد، الجمجمة تقسيم وقاعدة الجمجمة إلى نصفين على طول الطائرة السهمي النصفي (الشكل 1A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، إزالة نصفي الكرة المخية والمخيخ وجذع الدماغ. وتقع الفقاعة السمعية وكبسولة الأفقي إلى المخيخ وجذع الدماغ. لاحظ أن الفقاعة السمعية هي أبعد الجانبية للكبسولة السمعية (الشكل 1C، D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج الفقاعة وكبسولة مع المحيط عظم الجمجمة (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى صحن يحتوي مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uالتانجو تشريح المجهر مجهر، واستخدام الملقط لسحب بصرف النظر العظام ومقص المحيطة لقطع الحدود خففت حول الفقاعة وكبسولة (الشكل 1F). العظام المحيطة إزالتها هي قاعدي قذالي (الحدود بطني)، خارج القذالي (-ventro الخلفي الحدود)، فوق القذال (الحدود خلفي)، الجداري، الجدارية (الحدود ظهري)، صدفي (ظهراني الأمامي الحدود)، جناحي وتدي (الحدود الأمامي)، والعظم القاعدي الوتدي (الحدود انتيرو بطني) العظام. لاحظ أن عملية إبري الشكل (SP)، الذي يدعم افتتاح الطبلي من النفير 41، يختلف عن عملية الإبري من العظم الصدغي. </li></ol> 2. عزل السمعية عظيمات: المطرقة، السندان وعظمة الركاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المطرقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كل من مقص صغير وملقط، إزالة جزء من الخارجي الجانبي القناة السمعية إلى الطبلي تلم بحيث الغشاء الطبلي مرئيا (الشكل 2A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء من الغشاء الطبلي والعظم الطبلي بالقرب من malleal الناتئ القصير (نتوء الدويري، انظر مناقشة)، سواء على بطني (منقط) والخلفي (#) الجدران (الشكل 2C). وينبغي الآن يتعرض المطرقة والموترة للطبلة العضلات (الشكل 2D، E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع المطرقة (الشكل 2F) وقطع العضلة الموترة للطبلة مع حافة مشطوف من 27 إبرة G (الشكل 2G). لاحظ أن المقبض malleal تعلق بحزم لغشاء الطبل، كما هو الحال في غيرها من الثدييات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الغشاء الطبلي بعناية من المقبض، الذي لا يزال هشا. إزالة العظم الطبلي للكشف عن عظيمات السمع الثلاث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلخل في المطرقة من سندان في مفصل عظيمي (الشكل 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل المطرقة التي كتبها كسر عملية الأمامية في goniale. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سندان وعظمة الركاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل رانه سندان بقطع في الرباط الخلفي للسندان في الساق قصيرة (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الركابي بقطع الشريان الركابي قرب الركابي مع حافة مشطوف من 27 إبرة G (الشكل 3B، C). إذا لزم الأمر، وقطع في وتر العضلة ركابي في عملية العضلات من الركابي مع الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال ابرة الخياطة (أو دبوس بمناسبة) في الثقبة المسد من الركابي ويرفع الركابي. بعد إزالة الركابي، ينبغي أن يكون فتح نافذة بيضاوية واضحة للعيان (الشكل 3D). </li></ol></li></ol> 3. تضمين من السمعية بولا وكبسولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مبنية كتل البارافين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الفقاعة وكبسولة كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية الأمامي من الفقاعة (عملية إبري الشكل) قبالة مع مقص، وتزج الفقاعة وكبسولة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني في 4 درجاتC، والسماح تثبيتي للدخول في الفقاعة. إذا يصبح الهواء المحبوس في الفقاعة، إزالته مع الإبر والمحاقن. ترك الفقاعة وكبسولة في تثبيتي في 4 درجات CO / N على محور دوار أنبوب. تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل الكلس الفقاعة وكبسولة لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية 10٪ ethylenediaminetetraacetic حامض الصوديوم الملح ثنائي الهيدرات (EDTA-2NA)، و 100 قاعدة ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.0، في أنبوب مل 2. تغيير المخزن المؤقت كل يوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. العينات يمكن تخزينها في 70٪ من الإيثانول في الماء عند 4 درجات مئوية. اختياريا، ونقل إلى 70٪ من الإيثانول من خلال سلسلة الكحول متدرج (30٪، 50٪، 70٪ في الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على معالج الأنسجة، ويذوى العينات في سلسلة متدرجة من الحلول الإيثانول (70٪، 2X 95٪، 3X 100٪، كل ح 1)، واضحة في الزيلين (4X، كل ح 1 في 40 درجة مئوية)، والتسلل العينات مع المنصهر شمع البارافين 42. اختياريا، زيلين البديل مع clearin الأنسجة التجاريز حل (مثل HISTO-واضح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريغ عينات من المعالج، وإزالتها من الكاسيتات الخاصة بهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الأنسجة تضمين نظام وحدة التحكم، مكان. نماذج في قوالب مليئة شمع البارافين المنصهر. انتقل إلى تضمينها (القسم 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مبنية بنات المجمدة (طريقة فيلم كاواموتو في) 43 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الفقاعة وكبسولة كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية الأمامي من الفقاعة (عملية إبري الشكل) قبالة مع مقص، وتزج الفقاعة وكبسولة في تثبيتي (2٪ أو 1٪ PFA بدلا من 4٪ في برنامج تلفزيوني للحفاظ على استضداد) في 4 درجات مئوية. إذا تم المحاصرين الهواء في الفقاعة، إزالته باستخدام الإبر والمحاقن. ترك الفقاعة وكبسولة في تثبيتي في 4 درجات CO / N على محور دوار أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الفقاعة وكبسولة بسرعة في برنامج تلفزيوني وتزج فورا في السائل مركب تضمين البرد في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هام: إزالة فقاعات الهواء وجدت في منتصفوالأذن الخارجي من خلال التطلع بواسطة إبرة، وذلك بإضافة مجمع تضمين بالملقط. انتقل إلى تضمينها (القسم 4). </li></ol></li></ol> 4. توجيه العينة وتضمينها يجب أن يكون ترتيب الفقاعة كلها، وكبسولة في اتجاه معين خلال تضمين لخفض أقسام المرجوة: ملاحظة. وتستخدم الإجراءات المبينة أدناه لقسم المطرقة في مختلف التوجهات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطولي (مجاور للسهمي) باجتزاء من المطرقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجانب الوحشي من الفقاعة أو الصماخ السمعي الخارجي عليها في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد). ضبط اتجاه بحيث الرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة موازية لأسفل الأفقي للطبق التضمين (الشكل 4A - C). لاحظ أن الغشاء الطبلي يميل بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة إلى رأسي في الرأس الماوس (الشكل 4A، الشكل 59 في كامبن <suص&gt; 44). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باجتزاء الأفقي للالمطرقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قمة ظهري أفقيا في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد). ضبط اتجاه الفقاعة وكبسولة بحيث الرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة هي عمودي إلى أسفل الطبق التضمين (الشكل 4D - F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باجتزاء الأمامي (المقاطع العرضية) من قبضة القص والطبلي غشاء 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقبض malleal في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد) بحيث يكون عموديا إلى أسفل الطبق تضمين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهدئة كتلة لدرجات الحرارة المناسبة لتصلب شمع البارافين على الأنسجة تضمين نظام وحدة (بدلا من ذلك، استخدم مركب تضمين البرد في الجليد حمام جاف / الهكسان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الأنسجة عملية وقطع المقاطع باستخدام الإجراءات الروتينية. على سبيل المثال، أقسام صمة عار البارافين مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; #38؛ E)، سفرانين O (لغضروف)، أو مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز (TRAP) النشاط (لالآكلة) 3، أو عن طريق المناعية. cryosections Undecalcified هي مناسبة لوصفها العظام باستخدام fluorochromes 14، الأليزارين تلطيخ الأحمر للكالسيوم، والمناعي +42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، فإننا نقدم وسيلة مفيدة لعزل الفقاعة السمعية وكبسولة في الفئران بعد الولادة. قبل P12، أنسجة هشة ويمكن أن تصبح التالفة أثناء العزلة. بعد P12، الفقاعة السمعية وكبسولة يمكن عزلها عن الأنسجة المحيطة بها. تشريح الفقاعة من الرأس قبل باجتزاء ديها العديد من المزايا. أولا، التجويف ما بعد الولادة ونمو الفقاعة السمعية تحدث معظم بنشاط من P6 فصاعدا وهي كاملة من قبل P14 50. يتم استبدال الأنسجة الوسيطة بين الغشاء الطبلي وجدار القوقعة عن طريق الجو من خلال عملية التجويف. الهواء الناجم عن ذلك في تجويف الأذن الوسطى يمكن أن تعوق الاتصال بين الأنسجة والسوائل أثناء التثبيت، وزوال الكلس والتضمين. فمن الأسهل لإزالة الهواء من الفقاعة السمعية معزولة بقطع النهاية (عملية إبري الشكل) الأمامية بدلا من محاولة القيام بذلك في الفقاعة unisolated. ثانيا، توجه المطرقة (والغشاء الطبلي) ليس الرأسيفي الرأس. ولذلك فمن الأسهل إلى قسم المطرقة في الطائرات المطلوب عن طريق دمج الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة في اتجاه معين. مرة واحدة معزولة، الفقاعة السمعية وكبسولات مفيدة للعديد من التحليلات. على سبيل المثال، يمكن أن ارتفاع قرار الأشعة السينية الصغرى CT كشف العظام المجهرية التشكل مثل الشعيرات الدموية المكونة للعظم في المطرقة 14. وstereofluorescence تشريح المجهر هو أداة قوية لتصور الهياكل في تقييم الفئران مراسل معربا عن البروتينات الفلورية في الوسط أو الداخلية الأذن 33. بالإضافة إلى ذلك، مختلف في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي مضان طرق وضع العلامات وكله جبل كشف المناعي يمكن الاضطلاع بها. ضوء ورقة مضان المجهر مفيد أيضا لتحليل ثلاثي الأبعاد-51. وإن لم يكن هو موضح هنا، والهياكل التشريحية المختلفة المرتبطة الفقاعة السمعية وكبسولة مثل الأعصاب الطرفية، والأوعية الدموية، والغشاء الطبلي في الأذن الوسطى كما يمكن تقييمها باستخدام هذا البروتوكول. لاحظ أن باجتزاء البارافين يتطلب زوال الكلس للأنسجة العظام قبل التضمين، وبالتالي لا يسمح تحليل تمعدن. على النقيض من ذلك، فإن طريقة فيلم كاواموتو 43 المستخدمة في إعداد أقسام المجمدة يمكن أن يؤديها من دون زوال الكلس ومناسبة للدراسات تمعدن استخدام في تقنيات العظام وضع العلامات الجسم الحي أو تلطيخ خاص مثل الصبغ الأحمر تلطيخ. ينبغي أن يكون الأمثل ظروف البرد باجتزاء .. وفقا القائم على أساس السن الماوس. على سبيل المثال، ينصح درجة حرارة أقل باردة داخل الغرفة ناظم البرد لعينات الماوس القديمة للحد من الأضرار التي لحقت أقسام. وفي الماوس، المصطلح الصحيح للنتوء بارز شبه كروية من المطرقة هو &quot;نتوء الدويري&quot;. ومع ذلك، فإن مصطلح &quot;خنصر الناتئ&quot; وقد استخدم على نطاق واسع للإشارة إلى نتوء الدويري لمزيد من اللعقدين من الزمن، وخاصة بين الماوس علماء البيولوجيا التطورية 16،20،22-25. &quot;الناتئ القصير&quot; يشير أصلا إلى عملية الجانبية (الناتئ الوحشية)، والذي يختلف من نتوء الدويري. في البشر، وهي عملية تشبه الجانبية إسقاط مخروطي طفيف تشكل الخط العام للمرفق إلى غشاء الطبل، وتمتد من قبضة القص (لم أر في الشكل 6B، عرض وسطي). في الفئران، وعملية الجانبية هي أيضا إسقاط المقبض في الطرف المقابل لبجرة 48. في الجزء الرخو من الغشاء الطبلي فوق عملية الجانبية للالمطرقة. نتوء دائري ليست واضحة في المطرقة الإنسان.

وعظيمات السمع الثلاث في الأذن الوسطى، وهي المطرقة، السندان، والركابي، تشكل سلسلة السمعية الثدييات محددة التي تنقل الصوت من الغشاء الطبلي إلى الأذن الداخلية، أو القوقعة 1،2. السمع وظيفة يمكن تقييمها في الفئران عن طريق قياس سمعي جذع الاستجابة (ABR) عتبات 3-6، واهتزاز المطرقة وراء يمكن رصدها باستخدام الليزر دوبلر Vibrometry (LDV) 7 الغشاء الطبلي. من خلال الجمع بين ABR، LDV، والقياسات تشويه المنتج Otoacoustic الانبعاثات (DPOAE)، وفقدان السمع التوصيلي يمكن أن يكون هناك تمييز من ضعف الحسي 8. هناك حاجة إلى نماذج حيوانية من الظروف الأذن، نظرا لأهمية السمع وصحة الأذن إلى رفاه المرضى من جميع الأعمار. على سبيل المثال التهاب الأذن الوسطى هو التهاب الأذن شائعة جدا ينظر في الرضع والأطفال الإنسان، والحادة، التهاب الأذن الوسطى الحاد ويمكن أن يحدث مضاعفاته إذا كان كونديلم يتم علاجه نشوئها مع مضادات الجراثيم المناسبة 9. قد تكون نماذج الماوس من التهاب الأذن الوسطى مفيدا في فهم المرضية وفي تطوير علاجات 10،11. العظيمات الفئران، التي تتشكل (باستثناء الجزء goniale من المطرقة) التي تعظم غضروفي 12،13، هي ذات أهمية كبيرة لدراسة استقلاب العظام والتشكل. أولا، صغر حجمها يسمح تحليل عالية الدقة للعظام مع السمحاق سليمة باستخدام الأشعة السينية أو المجهري مضان 14. ثانيا، الشاذة استقلاب العظام، مثل المفرط أو نقص ارتشاف العظام، أو تفاعلات ضعاف بين الخلايا العظمية 15، يمكن تحليلها كمساهم محتمل لفقدان السمع 3،4،7. وذكر الثالث، غير طبيعي التشكل عظيمات في الفئران عدة جينات ناقصة، مثل الحيوانات التي تفتقر إلى Hoxa2 16-19، 20-22 الجينة Msx1، Prrx1 23، Goosecoid(GSC) 24،25، Bapx1 13، Tshz1 26، Dusp6 (Mkp3) 27، رأس (وتد) 28، Fgfr1 29، وهرمون الغدة الدرقية مستقبلات (Thra، Thrb) 5، Bcl2 30 وغيرها 1،31، أو في الفئران overexpressing Hoxa2 32. وأخيرا، على الرغم من صغر حجمها، والهياكل المرتبطة عظيمات مثل العضلات والمفاصل 33 34،35 يمكن الوصول إليها. العظيمات الماوس هي أصغر من عظيمات الإنسان، ولكن من الجدير بالذكر أن الأذن الوسطى الماوس ليست نسخة مصغرة من نظيرتها الإنسان. على سبيل المثال، في الفئران، الشريان الركابي، الذي يمر من خلال حلقة من الركابي، استمر طوال حياته 36، في حين أنه في البشر، يختفي الشريان الركابي الجنينية أثناء الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مورفولوجية المطرقة الماوس يختلف من عشرالبريد العظم البشري (أنظر الشكل 6). في الفئران، الفقاعة السمعية (طبلي) يرفق تجويف الأذن الوسطى مليئة بالهواء، في حين أنه في البشر، وخلايا الخشاء الهواء يتكون من العظام التربيقي في العظم الصدغي ويوجد في عظيمات بدلا من الفقاعة 37. في كلا النوعين، وكبسولة السمعية (الكبسولة، التي التيه العظمي) يرفق القوقعة والقنوات الهلالية في الأذن الداخلية. وقد استعرضت علم الأحياء التطوري المقارن والأذن الوسطى على نطاق واسع 38-40. بروتوكول الواردة أدناه أولا يصف كيفية تشريح خارج الفقاعة السمعية وكبسولة، والتي تتكون أساسا من الأذن الوسطى والأذن الداخلية، على التوالي. يوضح هذا البروتوكول أيضا كيفية عزل المطرقة، السندان والركابي من الفقاعة السمعية. وأخيرا، فإنه يظهر كيفية توجيه الفقاعة السمعية وكبسولة لتضمين استعدادا لباجتزاء الأنسجة من عظيمات السمع.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

في معظم الثدييات، عظيمات السمع في الأذن الوسطى، بما في ذلك المطرقة، السندان والركابي، هي أصغر العظام. في الفئران، وهو هيكل عظمي يسمى الفقاعة السمعية منازل للعظيمات، في حين أن كبسولة السمعية يرفق الأذن الداخلية، وهي القوقعة والقنوات الهلالية. العظيمات الفئران ضرورية لسماع وبالتالي من مصلحة كبيرة للباحثين في مجال طب الأذن والحنجرة، ولكن من عملية التمثيل الغذائي، والتنمية، وتطور وذات أهمية كبيرة لغيرها من المجالات. تغيير استقلاب العظام يمكن أن تؤثر على وظيفة السمع في فئران بالغة، ومختلف الفئران الجينات نقص تظهر التغيرات في التشكل من عظيمات السمع في الرحم. على الرغم من عظيمات السمع الفئران هي صغيرة، والتلاعب بهم ممكنا إذا كان أحد يفهم ميولهم التشريحية وهيكل 3D. هنا، نحن تصف كيفية تشريح الفقاعة السمعية وكبسولة من الفئران بعد الولادة ثم عزل عظيمات الفردية عن طريق إزالة جزء من الفقاعة. نحن أيضا مناقشة كيفية مالسرير الفقاعة وكبسولة في اتجاهات مختلفة لتوليد البارافين أو أقسام المجمدة مناسبة لإعداد المقاطع الطولية الأفقية أو الجبهي من المطرقة. وأخيرا، فإننا تعداد الاختلافات التشريحية بين الفأر والإنسان عظيمات السمع. أن هذه الأساليب يكون مفيدا في تحليل الجوانب المرضية والتنموية والتطورية للعظيمات السمع والأذن الوسطى في الفئران.

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لعزل عظيمات من الفقاعة الماوس السمعية. أولا، يتم تشريح الفقاعة وكبسولة من كقطعة واحدة من الجمجمة (الشكل 1). ثم يتم استخدام الفقاعة تشريح لإعداد المطرقة (الشكل 2) وسندان والركابي (الشكل 3). معالم الفقاعة السمعية وكبسولة هي عملية إبري الشكل في نهاية الأمامي من الفقاعة، وقمة ظهري، قناة الهلالية الأمامية، والحفرة قرب المقوس (الشكل 1F). Microcomputed التصوير المقطعي (CT) والتصوير يكشف عظيمات في الفقاعة السمعية فضلا عن التوجهات الأمثل لباجتزاء الطولي والأفقي تلك العظيمات (الشكل 4). لباجتزاء البارافين الطولي للالمطرقة، وdecalcified الفقاعة وكبسولة في EDTA عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد، جزءا لا يتجزأ من السلطة الفلسطينيةكتلة RAFFIN في التوجه هو مبين في الشكل (4) A - C، مقطوع في 4 ميكرون، ثم ملطخة باستخدام H &amp; E. والمطرقة تعلق على الغشاء الطبلي في الفقاعة السمعية وكشفت التحجر غضروفي المستمر في P14 (الشكل 5A). لتصور تشكيل العظام الجديدة، calcein (30 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) تم حقن peritoneally إلى الماوس P20، وعزلت الفقاعة وكبسولة بعد 24 ساعة عند P21. وكان جزءا لا يتجزأ من العينة دون زوال الكلس المجمدة ثم cryosectioned في 6 ميكرون باستخدام الفيلم لاصقة على أساس طريقة كاواموتو 43. بعد تلطيخ النووي مع دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، وقد لوحظ قسم تحت المجهر مضان. إشارات Calcein (الأخضر) كشفت تكوين عظام جديدة في المطرقة (م)، الفقاعة وكبسولة (الشكل 5B). لباجتزاء الأفقي للالمطرقة، وجزءا لا يتجزأ من الفقاعة السمعية معزولة عن ماوس البالغ من العمر 5 أسابيع المجمدة دون زوال الكلس (لالتوجه انظر الشكل 4D - F)، cryosectioned في 6 ميكرون باستخدام طريقة كاواموتو، وملطخة باستخدام H &amp; E. يظهر باجتزاء الأفقي للخنصر malleal الناتئ (ام. بي) أيضا القوقعة (الشكل 5C). وجهة نظر وسطي من عظيمات السمع الصحيحة معزولة عن ماوس P31 يظهر المظاهر التقليدية للالمطرقة الماوس، وهما &quot;مزلق-النورس يشبه الجناح&quot; (أو الفارسي 45 مثل السيف) المقبض، وهو الناتئ القصير بارز (نتوء الدويري انظر مناقشة)، والصفيحة مستعرضة (الشكل 6). لاحظ أن عملية الأمامي (الناتئ الأمامي) وقد اصيب بكسر في إجراء تشريح حول goniale وفصلت من الحلقة طبلي (ectotympanic). يسلك هذه عينة تمثيلية المفصل السنداني المطرقي سليمة بين المطرقة والسندان، في حين خلع المفصل السنداني الركابي. الإدراج الوترية في malleal والعمليات العضلات ركابي هي اكتشاف (الشكل 6A، العلامات النجمية). الشكل 6B يقارن الماوس وعظيمات السمع الإنسان في نفس التكبير. الاختلافات بين الأنواع، وغيرها من حجم، وتشمل ما يلي. المقبض malleal هي الجناح تشبه في الفئران ولكن مثل النادي في البشر. الزاوية بين محور التشريحية (أو محور الدوران، والخط من خلال عملية الأمامية من المطرقة وعملية قصيرة من سندان) والمقبض هو أصغر بكثير في الفئران وهما مواز تقريبا، في مقابل ما يقرب من عمودي في البشر 6،46-48. في عظيمات الإنسان، دراسات vibrometric تكشف أن المشترك-incudo الكعبية هو المحمول بدلا من الثابت وظيفيا 49. والمطرقة الماوس المعارض واسعة، ورقيقة، ومسطحة مستعرضة الصفيحة يست واضحة في البشر 47. في الفئران، الأمامي الناتئ الصمامات العظام غشائي، وهي goniale وطبلة الأذنج عصابة، بينما في البشر يتم تقليل الأمامي الناتئ إلى الشوكة صغيرة من العظام 41. والركابي من الفئران والبشر يختلف أيضا: في الفئران والساق الأمامية منحني والساق الخلفية هو أكثر مباشرة في حين أنه في البشر، والساق الأمامي هو أكثر مباشرة من الساق الخلفية. ومن الجدير بالذكر أن رئيس المطرقة بالنسبة لحجم الجسم وتوسيع نطاق واسع في أنواع مثل الخلد الذهبي، مما يدل على التباين الكبير في العلاقات المغايرة النسبية من &quot;أصغر&quot; عظام 48. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> الشكل 1. تشريح السمعية بولا وكبسولة. (أ) جمجمة الفأر P31 ينقسم إلى اليمين واليسار نصفين. A، الأمامي. P، الخلفي. L، غادر. R، أليس كذلك. (ب) سطح الإنسي من النصف الأيمن من رئيس البشرة شطر. CX، القشرة الدماغية. البنك التجاري، المخيخ. إفطار، المخnstem. D، الظهرية. V، بطني. (ج) إزالة الدماغ مع ملقط. (D) عرض الإنسي من الكبسولة السمعية في الجمجمة الصحيحة. قمة الظهرية (السهام) تقع بين الحفرة المتوسطة الجمجمة (ألف قدم مكعب) والخلفي الحفرة القحفية (الحزب الشيوعي الفرنسي) وتفصل ظهراني الأمامية والأسطح ventro الخلفي من الكبسولة السمعية. شريط الحجم، 2 مم. (E) التكبير العالي للالفقاعة السمعية وكبسولة (عرض وسطي). شارك، القوقعة. سابعا، العصب الوجهي. ثامنا، الدهليزي القوقعي العصبية. AC، الأمامي (متفوق) القناة الهلالية. SF، الحفرة تحت المقوسية، الذي يضم النديفة المخيخ. شريط الحجم، 1 مم. (F) صورة مجهرية من الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة (عرض وسطي). يرة سورية، وعملية إبري الشكل. شريط الحجم، 1 مم. (A - E)، P31 الماوس. (F)، P33 الماوس. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> الشكل 2. تشريح المطرقة. (أ) عرض بطناني من الفقاعة السمعية المناسبة وكبسولة. والطبلي تلم (ST، السهم متقطع) هو موقع الحجز على الغشاء الطبلي. الوحشي العظام إلى ST هو جزء من الأذن الخارجية، والإنسي العظام إلى ST يشكل أرضية تجويف الأذن الوسطى. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. (ب) عرض بعد إزالة القناة السمعية الخارجية للكشف عن غشاء الطبل (TM) بما فيها الجزء الرخو (الجبهة الوطنية) والجزء الموتر (حزب العمال). (ج) إزالة أجزاء من العظم الطبلي (الخطوط المنقطة و#) بالقرب من malleal الناتئ القصير (ام. بي). م، المطرقة، ملي، المقبض malleal. السهم، فقاعة الهواء في تجويف الأذن الوسطى ينظر من خلال الغشاء الطبلي. (D) المطرقة مكشوف. وأشار رئيس المطرقة. منقطخط يشير إلى السطح المفصلي للسندان. (E) وتر العضلة الموترة للطبلة (تي تي) تعلق على المطرقة. يتم سحبها (F) وموترة الطبلة عندما يتم رفع المطرقة. * عملية العضلات. يتم قطع (G) الموترة للطبلة باستخدام إبرة. (H) ثلاثة عظيمات السمع بعد إزالة الغشاء الطبلي. هو خلع مفصل-incudo الكعبية. م، المطرقة، أنا، سندان، الصورة، الركابي، الذهاب، goniale (تنصهر في المطرقة وطبلي حلقة، TR). جميع الحانات الحجم، 0.5 مم. (A، H)، P33 الماوس. (B - G)، P31 الماوس. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> الشكل 3. تشريح سندان وعظمة الركاب. (A) سندان والركابي بعد إزالة المطرقة. الشريان الركابي (SA) يمر عبر الركابي (ق). خط منقط يشير إلى السطح المفصلي للسندان. لاحظ أن الساق قصيرة (ICB، الساق القصيرة) لسندان (ط) هو ثابت من الرباط الخلفي (لا يظهر). النجمة، عملية العضلات من الركابي. (ب) الركابي بعد إزالة سندان. يستخدم طرف إبرة لقطع الشريان الركابي (SA). السهم، واتجاه تدفق الدم. خط منقط يشير سطح مفصلي للالركابي. إزالة (C) الشريان الركابي من الركابي. X يشير إلى نهاية قطع الشريان الركابي (SA). (D) نافذة بيضاوية (آه، النافذة البيضوية أو الدهليز fenestra) مرئيا بعد إزالة الركابي. RW، نافذة مستديرة (مستديرة fenestra أو قوقعة fenestra). أشرطة النطاق، 0.5 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا</a>الشكل. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> الشكل 4. توجيه السمعية بولا وكبسولة خلال تضمينها لالطولي (مجاور للسهمي، A - C) وأفقي (D - E) باجتزاء من المطرقة. (A - C) والرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة وضعت بالتوازي مع الجزء السفلي من تضمين الطبق. (أ) الجانب الشخصي: الصغرى CT الصورة لتظهر التضمين من المطرقة الحق في الفقاعة (pseudocolored الأزرق). وpseudocolored والمطرقة والسندان الأخضر. خط متقطع، المطلوب الطائرة القطع. خط الصلبة، أسفل تضمين الطبق. م، المطرقة، النصال، الظهرية قمة. M، سطي. L، الأفقي، D، الظهرية. V، بطني. (ب) أعلى عرض: مايكرو-CT الصورة. لاحظ أن نهاية الأمامي من (عملية إبري الشكل) الفقاعة تمت إزالة. ط، سندان. (C) أعلى عرض: صورة مجهرية (التي اتخذت معمرشح اللون). AC، الأمامي (متفوق) القناة الهلالية. سادس، الحفرة تحت المقوسية. يرة سورية، وعملية إبري الشكل. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. (D - F) وخنصر اليد الناتئ من المطرقة يتم وضع عمودي على الجزء السفلي من تضمين الطبق. (D) منظر جانبي: مايكرو-CT الصورة لتظهر التضمين من المطرقة الصحيحة. خط متقطع، المطلوب الطائرة القطع. خط الصلبة، أسفل تضمين الطبق. (E) أعلى عرض: مايكرو-CT الصورة. ملي، المقبض malleal. (F) أعلى عرض: صورة مجهرية (التي اتخذت مع مرشح اللون). الحانات الحجم، 1 مم. تم الحصول عليها صور مايكرو-CT في قرار فوكسل من 5 ميكرون، كما هو موضح سابقا 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figure 5. علم الأنسجة. (أ) H &amp; E تلطيخ. المقطع الطولي (مجاور للسهمي) من المطرقة جزءا لا يتجزأ من البارافين الصحيحة (م) في الفقاعة السمعية (الخط المنقط) في P14. TM، الغشاء الطبلي. (ب) Calcein العظام وصفها. المقطع الطولي للالمجمدة، المطرقة اليسرى undecalcified (م) في الفقاعة السمعية في P21. مباين، دابي. (C) H &amp; E تلطيخ. القسم الأفقي للخنصر اليد المجمدة، undecalcified ترك malleal الناتئ (ام. بي) في الفقاعة السمعية وكبسولة (الماوس البالغ من العمر 5 أسابيع). شارك، القوقعة. الحانات الحجم، 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> الشكل 6. الإنسي منظر السمعية العظيمات. (A) عظيمات السمع رايت P31 الماوس. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. شريط الحجم، 1 مم. المطرقة الرأس (كابوت للمطرقة، رؤيس المطرقة)؛ العنق (عنق المطرقة)؛ الصفيحة (الصفيحة مستعرضة)؛ ملي (المقبض المطرقة)؛ النجمة السوداء (عملية العضلات من المطرقة)؛ MPA (الناتئ الأمامي، الناتئ الناحلة)؛ MPB (الناتئ القصير)؛ هيئة سندان (كوربوس سندان)؛ ICB (الساق القصيرة، الساق قصيرة، عملية قصيرة)؛ ICL (الساق الطويلة، الساق الطويل، عملية طويلة)؛ IPL (الناتئ العدسي، عملية عدسي، سيلفيان نتوء)؛ رئيس الركابي (رأس الركاب)؛ النجمة البيضاء (عملية العضلات من الركابي)؛ هيئة السلع التموينية (الساق الأمامية، الساق الأمامية)؛ اللجنة الدائمة (الساق الخلفي، الخلفي الساق)؛ قاعدة (للركاب الأساس، الصفيحة القدمية)؛ قوات العمليات الخاصة (الثقبة المسد، الثقبة بين السويقات). (ب) عظيمات السمع حق أنثى الإنسان البالغ من العمر 76 عاما (بالإذن من قسم التشريح، كيو كلية الطب بجامعة). وعظيمات من الماوس P31 (أسفل اليمين) يتم تصوير في نفس التكبير الذي استعمل لعظيمات الإنسان. المنحنياتوتشير السهام إد الزاوية بين محور التشريحية والمقبض (الخطوط المنقطة). شريط الحجم، 2 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Research

JoVE Journal

Biology

29.9K Views.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Bioengineering

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscience

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

النهج ماوس جولة نافذة للالسامة وكيل التسليم: A السريع وتقنيات موثوقة لإحداث قوقعة تحلل الخلية

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicine

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

التقطيع بالتبريد والتلوين المناعي لأنسجة الأذن الداخلية للفأر: من المراحل الجنينية إلى مرحلة البلوغ

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Developmental Biology

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

جراحة زرع cochlear وتسجيلات استجابة جذع الدماغ السمعية أثارت كهربائياً في الفئران C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

دراسة مقارنة بين المخدرات طرق التسليم المستهدفة إلى الأذن ماوس الداخلية: Bullostomy<em&gt; مقابل</em&gt; بطريق غشاء الطبل حقن

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

النهج ماوس جولة نافذة للالسامة وكيل التسليم: A السريع وتقنيات موثوقة لإحداث قوقعة تحلل الخلية

تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

التقطيع بالتبريد والتلوين المناعي لأنسجة الأذن الداخلية للفأر: من المراحل الجنينية إلى مرحلة البلوغ

جراحة زرع cochlear وتسجيلات استجابة جذع الدماغ السمعية أثارت كهربائياً في الفئران C57BL/6

اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار

دراسة مقارنة بين المخدرات طرق التسليم المستهدفة إلى الأذن ماوس الداخلية: Bullostomy

تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران