The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo são aprovados pela Universidade Keio Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC - número de aprovação: 09.221) e siga as orientações institucionais em Experimentação Animal da Universidade Keio para o uso de animais em pesquisa. amostras humanas foram isoladas de um cadáver doado ao Departamento de Anatomia da Faculdade de Medicina da Universidade de Keio, e foram utilizados de acordo com os regulamentos institucionais. 1. Isolamento de Auditivo Bulla e Capsule <ol><li> Euthanize camundongos em um frasco contendo uma plataforma acima toalhas de papel embebido em isoflurano ou sevoflurano até ventilação respiratória cessa por mais de um minuto e, em seguida, executar deslocamento cervical. Tenha cuidado para evitar o contato direto de camundongos com as toalhas de papel embebido. </li><li> Faça uma pequena incisão transversal no lado dorsal do pescoço e puxar a pele para além em direção a cabeça ea cauda usando as duas mãos para expor mu pescoço subjacentetecido LECS. </li><li> Decapitar os ratos na região cervical 14 cm usando tesouras cirúrgicas afiadas. </li><li> pele casca completamente em direção ao nariz. Cortar toda a pele, juntamente com o focinho e incisivos. </li><li> Insira tesouras na boca e cortar músculos masseter em ambos os lados. </li><li> Abrir a garra com cuidado e retire a língua e mandíbula inferior juntos. </li><li> Usando uma tesoura afiada, crânio da separação e da base do crânio em duas metades ao longo do plano sagital médio (Figura 1A, B). </li><li> Utilizando uma pinça, retire os hemisférios cerebrais e cerebelo e tronco encefálico. A bula auditiva e da cápsula estão localizados lateralmente ao cerebelo e tronco cerebral. Note-se que a bolha auditivo é ainda mais lateralmente à cápsula auditiva (figura 1C, D). </li><li> Dissecar a bula e da cápsula com o osso do crânio circundante (Figura 1E). </li><li> Transfira a amostra para um prato contendo fosfato-salino tamponado (PBS) pH 7,4, à TA. </li><li> vocênder uma dissecação microscópio binocular, utilize uma pinça para separar os ossos e tesouras circundantes para cortar o limite solta ao redor da bolha e da cápsula (Figura 1F). Os ossos ao redor removidos são o basioccipital (fronteira ventral), exoccipital (fronteira ventro-posterior), supraoccipital (borda posterior), parietal (fronteira dorsal) interparietal, esquamosal (fronteira dorso-anterior), alisphenoid (borda anterior) e basiesfenóide (beira antero-ventral) ossos. Note-se que o processo styliform (SP), que apoia a abertura timpânica da trompa de Eustáquio 41, é distinto do processo estilóide do osso temporal. </li></ol> 2. Isolamento de Auditivo Ossículos: martelo, bigorna e estribo <ol><li> Martelo <ol><li> Utilizando as duas pequenas tesouras e pinças, remover a parte da lateral do canal auditivo externo para o sulco timpânico de modo que a membrana timpânica é visível (Figura 2A, B). </li><li> Remover parte da membrana timpânica e osso timpânico perto do malleal processus brevis (apófise orbicular, ver Discussão), tanto no ventral (pontilhada) e posterior (#) paredes (Figura 2C). O músculo do tímpano martelo e tensor deve agora ser exposto (Figura 2D, E). </li><li> Levantar o martelo (Figura 2F) e cortar o músculo tensor do tímpano com a borda chanfrada de uma agulha G 27 (Figura 2G). Note-se que o manubrium malleal fixado firmemente à membrana timpânica, como é visto em outros mamíferos. </li><li> Retire a membrana timpânica cuidadosamente do manubrium, que é frágil. Retirar o osso timpânica para revelar os três ossículos auditivos. </li><li> Deslocar o martelo da bigorna na articulação ossicular (Figura 2H). </li><li> Isolar o martelo pela fratura do processo anterior, no goniale. </li></ol></li><li> Bigorna e estribo <ol><li> isolar tele bigorna, cortando o ligamento posterior da bigorna no curto crus (Figura 3A). </li><li> Isolar o estribo, cortando a artéria estapediano perto do estribo com a borda chanfrada de uma agulha G 27 (Figura 3B, C). Se necessário, cortar o tendão do músculo estapédico no processo muscular do estribo com a agulha. </li><li> Inserir uma agulha de costura (ou um pino de marcação) no forame obturador do estribo e levante o estribo. Depois de remover o estribo, a abertura da janela oval deve ser claramente visível (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 3. Incorporação de Auditivo Bulla e Capsule <ol><li> Preparação para a incorporação em blocos de parafina <ol><li> Isolar a bula e da cápsula como descrito na Seção 1. </li><li> Cortar a extremidade anterior da bolha (o processo styliform) para fora com uma tesoura, e mergulhar a bula cápsula em 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS a 4 °C, e permitir que o fixador para entrar na bula. Se o ar fica preso na bula, removê-lo com uma agulha e seringa. Deixar a bula e cápsula no fixador a 4 ° CO / N num rotor tubo. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> Lavar uma vez com PBS. </li><li> Descalcificação bula e da cápsula por uma semana a 4 ° C em 10% de di-hidrato de sal de dissódio do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-2Na), 100 mM de base Tris, pH 7,0, num tubo de 2 mL. Alterar o buffer a cada dois dias. </li><li> Lavar uma vez com PBS. As amostras podem ser armazenadas em 70% de etanol em água a 4 ° C. Opcionalmente, a transferência para 70% de etanol através de uma série de álcoois graduados (30%, 50%, 70% em água). </li><li> Num processador de tecido, desidratar as amostras numa série graduada de soluções de etanol (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, cada um 1H), claras em xileno (4x, cada 1 h a 40 ° C), e infiltrar-se amostras com a cera de parafina fundida 42. Opcionalmente, xileno substituto com clearin tecido comercialg de solução (por exemplo, histo-claro). </li><li> Descarregar amostras do processador, e removê-los de suas fitas cassetes. </li><li> Em um sistema de console de tecido a incorporação, lugar espécimes em moldes cheios de cera de parafina derretida. Prossiga para a incorporação (Seção 4). </li></ol></li><li> Preparação para inclusão em blocos congelados (método de filme de Kawamoto) 43 <ol><li> Isolar a bula e da cápsula como descrito na Seção 1. </li><li> Cortar a extremidade anterior da bolha (o processo styliform) para fora com uma tesoura, e mergulhar a bula cápsula em fixador (2% ou 1% de PFA em vez de 4% em PBS para preservar a antigeni cidade) a 4 ° C. Se houver ar preso em bula, removê-lo usando uma agulha e seringa. Deixar a bula e cápsula no fixador a 4 ° CO / N num rotor tubo. </li><li> Lavar bula e cápsula rapidamente em PBS e mergulhar imediatamente no composto de crio-incorporação líquido a 4 ° C. </li><li> Importante: Remova as bolhas de ar se houver no meioe ouvido externo através de aspiração por uma agulha, e por adição do composto com a incorporação de uma pinça. Prossiga para a incorporação (Seção 4). </li></ol></li></ol> 4. Orientação Sample and Embedding NOTA: O conjunto bula e cápsula deve ser providenciado com uma orientação particular, durante a incorporação de cortar secções desejadas. Os procedimentos descritos abaixo são utilizados para secção o martelo em várias orientações. <ol><li> Longitudinal (parasagittal) de corte do martelo <ol><li> Coloque o lado lateral da bula ou conduto auditivo externo para baixo em parafina quente (ou composto-incorporação crio). Ajustar a orientação de modo que o pescoço e transversal lâmina do martelo são paralelas ao fundo horizontal do prato de encastre (Figura 4A - C). Note-se que a membrana timpânica é inclinado segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° em relação à vertical na cabeça de rato (Figura 4A; Figura 59 em Kampen <suP&gt; 44). </li></ol></li><li> Corte horizontal do martelo <ol><li> Coloque a crista dorsal horizontal em parafina quente (ou composto-incorporação crio). Ajustar a orientação da bolha e da cápsula de modo que o pescoço e transversal lâmina do martelo são perpendiculares ao fundo do prato de encastre (Figura 4D - F). </li></ol></li><li> Seccionamento Frontal (secções transversais) do manúbrio e da membrana timpânica 5 <ol><li> Coloque a manubrium malleal em parafina quente (ou compostos à incorporação de crio) de tal modo que é perpendicular ao fundo do prato de incorporação. </li></ol></li><li> Arrefecer o bloco a temperaturas adequadas para endurecer a cera de parafina em um sistema de console tecido incorporação (em alternativa, usar composto incorporação crio em um banho de gelo seco / hexano). </li><li> bloco de tecido processo e seções de corte utilizando procedimentos de rotina. Por exemplo, seções mancha de parafina com hematoxilina e eosina (H &amp; #38; E), safranina O (para a cartilagem), ou para a actividade de fosfatase ácida (TRAP) resistente a tartarato (por osteoclastos) 3, ou por imuno-histoquímica. Criosecções descalcificadas são adequados para rotulagem óssea usando fluorocromos 14, alizarina para o cálcio, e imunofluorescência 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui, apresentamos um método útil para isolar a bula auditiva e cápsula em ratos pós-natais. Antes da P12, os tecidos são frágeis e podem ser danificados durante o isolamento. Após P12, o bula auditiva e da cápsula pode ser facilmente isolado a partir de tecidos circundantes. Dissecando a bula da cabeça antes do corte tem várias vantagens. Em primeiro lugar, cavitação pós-natal e do crescimento da bula auditiva ocorrer mais ativamente da P6 em diante e são completos por P14 50. O tecido mesenquimal entre a membrana timpânica e parede coclear é substituído por ar através do processo de cavitação. O ar resultante na cavidade do ouvido médio pode impedir o contato entre os tecidos e líquidos durante a fixação, descalcificação e incorporação. É mais fácil para remover o ar da bula auditiva isolada, cortando o final (processo styliform) anterior ao invés de tentar fazê-lo na bula não isolado. Em segundo lugar, a orientação do martelo (e a membrana timpânica) não é verticalna cabeça. É, portanto, mais fácil de secção do martelo em planos desejados pela incorporação da bula auditiva isolada e cápsula em uma determinada orientação. Uma vez isolado, bula auditiva e cápsulas são úteis para numerosas análises. Por exemplo, de alta resolução de raios-X micro-CT pode revelar morfologia microestrutura do osso, tais como capilares osteogênicos no martelo 14. O microscópio de dissecação stereofluorescence é uma ferramenta poderosa para avaliar visualização das estruturas em ratinhos que expressam proteínas fluorescentes do repórter no ouvido médio ou interno 33. Além disso, pode ser realizada uma variedade in vivo ou ex vivo de fluorescência métodos de marcação e detecção de imunofluorescência de montagem inteira. A microscopia de fluorescência folha de luz também é útil para a análise tridimensional 51. Embora não seja descrito aqui, diversas estruturas anatômicas associado com a bula auditiva e da cápsula, como os nervos periféricos, vasos sanguíneos, emembrana timpânica no ouvido médio também pode ser avaliada usando esse protocolo. Note-se que o seccionamento de parafina requer descalcificação do tecido ósseo antes de incorporação e, portanto, não permite a análise de mineralização. Em contraste, o método de Kawamoto filme 43 usado para preparar secções congeladas pode ser realizada sem descalcificação e é adequado para estudos de mineralização utilizando técnicas de rotulagem de osso in vivo ou coloração especial, tais como coloração Alizarina. condições Cryo-seccionamento deve ser otimizada de acordo com base na idade mouse. Por exemplo, uma temperatura inferior fresco no interior da câmara criostato é recomendado para amostras mais velhas do rato para minimizar os danos para as secções. No rato, o termo correto para a protuberância semi-esférica de destaque do martelo é &quot;apófise orbicular&quot;. No entanto, o termo &quot;processus brevis&quot; tem sido amplamente utilizada para indicar a apófise orbicular para mais thum duas décadas, especialmente entre rato biólogos do desenvolvimento 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; originalmente se referia ao processo lateral (processus lateral), que difere da apófise orbicular. Em seres humanos, um processo lateral semelhante a uma ligeira projecção cónica forma geral a linha de ligação à membrana timpânica, que se estende a partir da fúrcula (não visto na Figura 6B, vista medial). Em ratinhos, o processo lateral é também uma projecção do manubrium na extremidade oposta ao umbo 48. Os pars flácida da membrana timpânica está acima do processo lateral do martelo. apófise orbicular não é aparente no martelo humano.

Os três ossículos auditivos do ouvido médio, ou seja, martelo, bigorna e estribo, formam uma cadeia auditiva específica de mamíferos que transmite som a partir da membrana timpânica ao ouvido interno, ou cóclea 1,2. Função auditiva pode ser avaliada em ratos medindo Auditivo de Tronco Encefálico (ABR) limiares 3-6, e vibração do martelo atrás da membrana timpânica pode ser monitorado usando Laser Doppler vibrometria (LDV) 7. Ao combinar ABR, LDV e medidas Produto de Distorção de Emissões Otoacústicas (EOAPD), perda auditiva condutiva pode ser discriminado de deficiência neurossensorial 8. são necessários modelos animais de condições de orelha, dada a importância da audição e a saúde do ouvido para o bem-estar dos pacientes de todas as idades. Por exemplo, otite média é uma infecção no ouvido extremamente comum visto em lactentes e crianças humanas, e, otite média aguda grave e suas complicações podem ocorrer se a condição não for tratada com antimicrobianos apropriados 9. Modelos de rato de otite média pode ser útil na compreensão da patogênese e no desenvolvimento de tratamentos 10,11. Ossículos murino, que (com excepção da parte goniale do martelo) são formados por ossificação endocondral 12,13, são altamente relevantes para o estudo do metabolismo ósseo e morfogênese. Em primeiro lugar, seu pequeno tamanho permite a análise de alta resolução de ossos com um periósteo intacto usando raios-X ou microscopia de fluorescência 14. Em segundo lugar, o metabolismo ósseo anormal, como a reabsorção óssea excessiva ou deficiente, ou interações deficientes entre as células ósseas 15, pode ser analisado como um contribuinte potencial de perda auditiva 3,4,7. Em terceiro lugar, a morfogénese ossículo anormal é relatada em vários ratinhos deficientes em genes, tais como animais que faltam Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, os receptores da hormona da tiróide (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 e outros 1,31, ou em camundongos com superexpressão Hoxa2 32. Finalmente, apesar de seu pequeno tamanho, estruturas associado com ossículos, como músculos e articulações 33 34,35 são acessíveis. ossículos do rato são menores do que ossículos humanos, mas é digno de nota que a orelha média do rato não é uma versão em miniatura de sua contraparte humana. Por exemplo, em ratos, a artéria estapediano, que passa através do anel do estribo, persistir ao longo da vida 36, enquanto que em seres humanos, a artéria estapediano embrionária desaparece durante a gestação. Além disso, a morfologia do martelo do rato difere da do the osso humano (ver Figura 6). Em camundongos, a bula auditiva (timpânica) encerra a cavidade do ouvido médio cheio de ar, enquanto que em seres humanos, as células aéreas da mastóide compostas de osso trabecular no osso temporal abriga os ossículos, em vez de uma bolha 37. Em ambas as espécies, a cápsula auditiva (cápsula ótica, labirinto ósseo) encerra a cóclea e canais semicirculares do ouvido interno. Biologia comparada e evolutiva do ouvido médio tem sido extensivamente revisado 38-40. O protocolo fornecido abaixo primeira descreve como dissecar a bula auditiva e cápsula, que consistem principalmente de orelha média e orelha interna, respectivamente. Este protocolo também demonstra como isolar o martelo, bigorna e estribo da bula auditiva. Finalmente, ele mostra como orientar a bula auditiva e da cápsula para embutir em preparação para o seccionamento de tecidos de ossículos auditivos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Tools/Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paper towel</td>
			<td>DAIO PAPER CORPORATION</td>
			<td>703347</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Jar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">14cm surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>91400-14</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extra fine scissors-straight</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps Angled 45&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>for routine dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>for movies&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Injection needle 27G</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1ml)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marking Pin</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator RT-50</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000165-000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:259px;">http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC-65 Tungsten blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14021626379</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless containers</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryofilm type IIC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silane coated slide (New Silane II)</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>511617</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue processor</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">VIP-5</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">Tissue-Tek TEC 5&#160;</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sliding microtome for paraffin</td>
			<td>Yamato Kohki Industrial</td>
			<td>REM-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Path Blade+pro for hard tissue</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>PB3503C</td>
			<td>for paraffin section</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT</td>
			<td>RIGAKU</td>
			<td>R_mCT2</td>
			<td>http://www.rigaku.com/en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>285-14</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4 12H2O</td>
			<td>wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>wako</td>
			<td>287-21</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde(EM Grade)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA-2Na</td>
			<td>wako</td>
			<td>15111-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryoembedding Medium</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Ice</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hexane</td>
			<td>wako</td>
			<td>080-03423</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryomouting Medium type R2</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>781001A0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histo-Clear</td>
			<td>NDS</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>340-00433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin&#160;</td>
			<td>wako</td>
			<td>131-09665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>wako</td>
			<td>051-06515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

Na maioria dos mamíferos, ossículos auditivos no ouvido médio, incluindo o martelo, bigorna e estribo, são os menores ossos. Nos ratos, uma estrutura óssea chamada a bula auditiva abriga os ossículos, enquanto a cápsula auditiva envolve o ouvido interno, ou seja, a cóclea e canais semicirculares. ossículos murino são essenciais para a audição e, portanto, de grande interesse para os pesquisadores da área de otorrinolaringologia, mas seu metabolismo, desenvolvimento e evolução são altamente relevantes para outros campos. Metabolismo ósseo alterada pode afetar a função auditiva em ratos adultos, e vários ratos gene deficiente mostram mudanças na morfogênese dos ossículos auditivos no útero. Embora ossículos auditivos murino são minúsculos, sua manipulação é viável se se compreende a sua orientação anatômica e estrutura 3D. Aqui, descrevemos como dissecar a bula auditiva e cápsula de ratos pós-natais e em seguida isolar ossículos individuais através da remoção de parte da bula. Nós também discutir como emcama da bolha e da cápsula em orientações diferentes para gerar parafina ou secções congeladas adequados para a preparação de secções longitudinais, horizontais, ou frontais do cabo do martelo. Finalmente, enumerar as diferenças anatômicas entre mouse e ossículos auditivos humanos. Estes métodos seriam úteis na análise dos aspectos patológicos, de desenvolvimento e evolutivas de ossículos auditivos e da orelha média em camundongos.

Este protocolo apresenta um método para isolar ossículos do rato bula auditivo. Em primeiro lugar, a bolha e cápsula são dissecados como uma peça única a partir do crânio (Figura 1). A bula dissecado é então utilizado para preparar o martelo (Figura 2) e a bigorna e estribo (Figura 3). Marcos da bula auditivo e cápsula são o processo styliform na extremidade anterior da bolha, a crista dorsal, do canal semicircular anterior, e a fossa subaquata (Figura 1F). Tomografia (TC) Microcomputed revela ossículos na bula auditiva, bem como as orientações óptimas para seccionamento longitudinal e horizontal desses ossículos (Figura 4). Para realizar o corte de parafina longitudinal do martelo, a bula e cápsula foram descalcificadas em EDTA a 4 ° C durante uma semana, incorporado em um pabloco raffin na orientação mostrada na Figura 4 A - C, seccionados a 4 mm, e em seguida corados com H &amp; E. O martelo ligado à membrana timpânica na bula auditiva revelou ossificação endocondral em curso no P14 (Figura 5A). Para visualizar a nova formação óssea, calceína (30 mg / g de peso corporal) foi peritoneal injetado em um rato P20 e bula e da cápsula foram isolados 24 h mais tarde, no P21. A amostra sem descalcificação foi incorporado congelada e, em seguida, criosseccionada a 6 uM, utilizando uma película adesiva com base no método de Kawamoto 43. Depois de coloração nuclear com DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole), a secção foi observado sob um microscópio de fluorescência. Sinais calceína (verde) revelou neoformação óssea no martelo (m), bula e na cápsula (Figura 5B). Para realizar o corte horizontal do martelo, a bula auditivo isolado a partir de um ratinho com 5 semanas de idade, foi incorporado congelado sem descalcificação (para oOrientação veja a Figura 4D - F), criosseccionada a 6 mm utilizando o método de Kawamoto, e corados com H &amp; E. Corte horizontal da brevis malleal processus (MPB) também mostra a cóclea (Figura 5C). Uma visão medial dos ossículos auditivos certos isolados de um rato P31 mostra características típicas do martelo mouse (ou persa 45 espada-like) manubrium, um processus brevis proeminente (apófise orbicular ou seja, o &quot;delta-gaivota-asa-como&quot; , ver discussão), e a lâmina transversal (Figura 6). Note-se que o processo anterior (processus anterior) foi fracturada no procedimento de dissecção em torno do goniale e foi separada a partir do anel timpânica (ectotimpánico). Esta amostra representativa exibe uma joint incudomalleolar intacta entre o martelo ea bigorna, enquanto a joint incudostapedial é deslocado. inserções tendinosas e na mallealprocessos musculares estapedianos são detectáveis (Figura 6A, asteriscos). Figura 6B compara mouse e ossículos auditivos humanos com a mesma ampliação. diferenças entre as espécies, com excepção de tamanho, incluem o seguinte. O manubrium malleal é ala-como em ratos, mas semelhante a um clube em seres humanos. O ângulo entre o eixo anatómico (ou o eixo de rotação, a linha através do processo anterior do martelo e a curta da bigorna) e a fúrcula é muito menor em ratinhos e os dois são quase paralelas, em oposição a aproximadamente perpendicular em seres humanos 6,46-48. Em ossículos humanos, estudos vibrometric revelam que a joint incudo-maleolar é móvel ao invés de funcionalmente fixo 49. O martelo do mouse exibe uma ampla, fina e plana da lâmina transversal não aparente em humanos 47. Em ratinhos, o anterior processus funde a ossos membranosos, ou seja, a goniale e o tímpanoC anel, enquanto que em humanos a anterior processus é reduzida a um pequeno espícula de osso 41. O estribo de ratos e seres humanos também é diferente: em ratos, o crus anterior é curvo e crus posterior é mais direto ao passo que nos seres humanos, o crus anterior é mais direto do que o crus posterior. Vale a pena notar que a cabeça do martelo em relação ao tamanho do corpo é maciçamente ampliado em espécies como a toupeira de ouro, o que demonstra variabilidade significativa nas relações alométricas de &quot;os mais pequenos&quot; ossos 48. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção da Auditivo Bulla e Capsule. (A) O crânio de um rato P31 é dividido em direito e metades esquerda. Um, anterior; P, posterior; G, para a esquerda; R, direita. (B) face medial da metade direita do, cabeça pele cortada. Cx, córtex cerebral; Cb, cerebelo; Bs, brainstem. D, dorsal; V, ventral. (C) Remoção de cérebro com uma pinça. (D) Vista medial da cápsula auditiva no crânio direita. A crista dorsal (setas) fica entre a fossa média craniana (mcf) e da fossa posterior do crânio (PCF) e separa dorso-superfícies anterior e ventro-posterior da cápsula auditiva. barra de escala, 2 mm. (E) Maior ampliação da bolha auditiva e da cápsula (vista medial). Co, cóclea; VII, do nervo facial; VIII, vestibulocochlear nervo; AC, anterior (superior) canal semicircular; Sf, fossa subaquata, que abriga o paraflóculo cerebelar. barra de escala, 1 mm. (F) Micrografia da bula auditiva isolada e cápsula (vista medial). Sp, processo styliform. barra de escala, 1 mm. (A - E), rato P31. (F), rato P33. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figura 2. Dissecção do Malleus. (A) vista ventrolateral de uma bolha auditiva direita e cápsula. O sulco timpânico (ST, a seta a tracejado) é o local de ligação da membrana timpânica. O lateral do osso para o ST é parte do ouvido externo, e medial óssea para o ST forma o fundo da cavidade do ouvido médio. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista após a remoção do canal auditivo externo para revelar a membrana timpânica (TM), incluindo os pars flácida (PF) e pars tensa (PT). (C) A remoção de partes do osso timpânico (linhas pontilhadas e #) perto do malleal processus brevis (MPB). m, martelo; mM, manubrium malleal. A seta, bolha de ar na cavidade do ouvido médio pode ser visto através da membrana timpânica. (D) do martelo exposto. cabeça do martelo é indicado. Pontilhadolinha indica a superfície articular da bigorna. (E) tendão do músculo tensor do tímpano (TT) ligado ao cabo do martelo. (F) O tensor do tímpano é puxado quando o martelo é levantado. *, Processo muscular. (L) tensor do tímpano é cortada usando uma agulha. (H) três ossículos auditivos após a remoção da membrana timpânica. A joint incudo-maleolar é deslocado. m, martelo; i, bigorna; s, estribo; Vá, goniale (fundido com o anel martelo e timpânica, TR). Todas as barras de escala, de 0,5 mm. (A, H), rato P33. (B - G), rato P31. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figura 3. Dissecção da bigorna e estribo. (A) Incus eestribo após a remoção do martelo. A artéria estapediano (SA) passa através do estribo (s). A linha pontilhada indica a superfície articular da bigorna. Note-se que o curto crus (ICB, crus breve) da bigorna (I) é fixado pelo ligamento cruzado posterior (não mostrado). Asterisk, o processo muscular do estribo. (B) do estribo após a remoção da bigorna. ponta da agulha é usada para cortar a artéria estapediana (SA). Seta, direção do fluxo sanguíneo. A linha pontilhada indica a superfície articular do estribo. (C) A artéria estapediana é removido a partir do estribo. X indica a extremidade cortada da artéria estapédico (SA). (D) A janela oval (Ow, fenestra ovalis ou vestibuli fenestra) é visível após a remoção do estribo. RW, janela redonda (rotunda fenestra ou cochleae fenestra). Barras de escala, de 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figura 4. Orientação do Auditivo Bulla e Capsule durante Incorporação para Longitudinal (parasagittal, A - C) e horizontal (D - E) Seccionamento do Malleus. (A - C) O pescoço e transversal lâmina do martelo está colocada paralelamente ao fundo do prato de incorporação. (A) Vista lateral: Imagem micro-CT para mostrar a incorporação do martelo direita na bula (pseudocolored azul). O martelo e bigorna são pseudocolored verde. A linha a tracejado, o plano de corte desejado. linha sólida, parte inferior da incorporação de prato. m, martelo; pontas de seta, dorsal da crista. M, medial; G, lateral; D, dorsal; V, ventral. (B) Vista de cima: imagem Micro-CT. Note-se que a extremidade anterior da (processo styliform) bolha foi removida. i, bigorna. (C) Vista de cima: micrografia (tomado com umafiltro de cor). AC, anterior (superior) canal semicircular; Sf, fossa subaquata; Sp, processo styliform. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (D - F) O brevis processus do martelo é colocado perpendicular ao fundo do prato de incorporação. (D) Vista lateral: Imagem Micro-CT para mostrar a incorporação do martelo direita. A linha a tracejado, o plano de corte desejado. linha sólida, parte inferior da incorporação de prato. (E) Vista de cima: imagem Micro-CT. mM, manubrium malleal. (F) acima Ver: micrografia (tomado com um filtro de cor). Barras de escala, de 1 mm. Imagens micro-TC foram obtidos a uma resolução do voxel de 5 um, tal como descrito anteriormente 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figura 5. Histologia. (A) coloração de H &amp; E. Longitudinal (parasagittal) seção do martelo parafinado direita (m) na bula auditiva (linha pontilhada) no P14. TM, membrana timpânica. Rotulagem óssea (B) calceína. corte longitudinal do, martelo congelada descalcificada esquerda (m) na bula auditiva no P21. Contracorante, DAPI. (C) coloração de H &amp; E. secção horizontal do brevis congelado, descalcificadas deixou malleal processus (MPB) na bula auditiva e da cápsula (mouse com 5 semanas de idade). Co, cóclea. Barras de escala, de 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figura 6. Medial Vista do Auditivo ossículos. (A) ossículos auditivos direito de P31 mouse. Um, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. barra de escala, 1 mm. malleus cabeça (Caput mallei, Capitulum mallei); pescoço (Collum mallei); lâmina (lâmina transversal); mM (Manúbrio mallei); asterisco preto (processo muscular do martelo); MPa (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); corpo da bigorna (Corpus incudis); ICB (breve Crus, short crus, processo curto); ICL (longum Crus, muito crus, processo longo); IPL (lenticularis Processus, processo lenticular, Sylvian apófise); cabeça do estribo (Caput stapedis); asterisco branco (processo muscular do estribo); SCA (anterius Crus, crus anterior); SCP (Crus posterius, crus posterior); base (stapedis Base, platina); SOF (forame obturador, forame intercrural). (B) ossículos auditivos direito de um 76-year-old fêmea humana (cortesia do Departamento de Anatomia da Faculdade Universidade Keio de Medicina). Os ossículos do rato P31 (inferior direito) são gravadas com a mesma ampliação que o utilizado para ossículos humanos. Curvsetas ed indicar o ângulo entre o eixo anatômico eo manubrium (linhas pontilhadas). barra de escala, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.9K visualizações.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Vídeo: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biologia

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissecção do saco endolinfático de camundongos

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissecção do saco endolinfático de camundongos

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...