The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Alle Tierverfahren in dieser Studie durchgeführt werden, von der Keio University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt (IACUC - Zulassungsnummer: 09221) und die Richtlinien des Instituts für Tierversuche an der Keio-Universität für den Einsatz von Tieren in der Forschung folgen. Menschliche Proben wurden von einem kadaver in der Abteilung für Anatomie, Keio University School of Medicine gespendet isoliert und wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Regelungen verwendet. 1. Isolierung von Auditory Bulla und Kapsel <ol><li> Euthanize Mäuse in einem Glas eine Plattform über Papiertücher getränkt in Isofluran oder Sevofluran bis respiratorischen Beatmung nicht mehr länger als eine Minute enthält, und dann Zervikaldislokation durchführen. Achten Sie darauf, den direkten Kontakt von Mäusen mit dem getränkten Papiertüchern zu vermeiden. </li><li> Machen Sie einen kleinen Quereinschnitt an der dorsalen Seite des Halses und ziehen die Haut auseinander in Richtung Kopf und Schwanz mit beiden Händen zugrunde liegenden Hals mu aussetzenscle Gewebe. </li><li> Enthaupten Mäuse im Halsbereich mit 14 cm scharf chirurgische Scheren. </li><li> Peel Haut vollständig gegen die Nase. Schneiden Sie alle Haut zusammen mit der Schnauze und Schneidezähne ab. </li><li> Legen einer Schere in den Mund und Kaumuskeln auf beiden Seiten geschnitten. </li><li> Öffnen Sie den Kiefer vorsichtig und entfernen Sie die Zunge und Unterkiefer zusammen. </li><li> Mit einer scharfen Schere, Split Schädel und Schädelbasis in zwei Hälften entlang der Midsagittalebene (1A, B). </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die zerebrale und zerebelläre Hemisphären und den Hirnstamm. Die auditorische Bulla und Kapsel befinden sich lateral des Kleinhirns und des Hirnstamms. Beachten Sie, dass der Gehör Bulla zum Gehörkapsel weiter lateral ist (1C, D). </li><li> Präparieren aus der Bulla und Kapsel mit dem umgebenden Schädelknochen (Abbildung 1E). </li><li> Die Probe wird auf eine Schale mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 7,4 bei RT. </li><li> Under ein Binokular Binokular, verwenden Pinzette die umliegenden Knochen und Schere auseinander zu ziehen , die gelockert Grenze um der Bulla und Kapsel (1F) zu schneiden. Die umliegenden Knochen entfernt sind die Basioccipitale (ventralen Rand), exoccipital (ventro-posteriore Grenze), Supraoccipitale (posterior Grenze), interparietal, parietalen (dorsalen Rand), Squamosum (dorso-anterioren Grenze), alisphenoid (vordere Grenze) und Basisphenoid (antero- ventralen Rand) Knochen. Beachten Sie, dass die styliform Prozess (Sp), die das Trommelfell Öffnung der Eustachischen Röhre unterstützt 41, von der Griffelfortsatz des Schläfenbeins unterscheidet. </li></ol> 2. Isolierung von Gehörknöchelchen: Malleus, Amboß und Steigbügel <ol><li> Hammer <ol><li> Verwendung von sowohl einer kleinen Schere und Pinzette, entfernen Sie den Teil des äußeren Gehörgangs lateral des Sulcus tympanicus so dass das Trommelfell sichtbar ist (2A, B). </li><li> Entfernen Sie Teil des Trommelfells und Pauken Knochen in der Nähe des malleal Processus brevis (orbicular apophysis, siehe Diskussion), die beide an der ventralen (gepunktet) und posterioren (#) Wände (2C). Der Malleus und Tensor tympani sollte nun ausgesetzt (2D, E) werden. </li><li> Heben Sie den Malleus (2F) und schneiden Sie den Tensor tympani mit der abgeschrägten Kante einer 27 G - Nadel (2G). Beachten Sie, dass die malleal Manubrium an das Trommelfell fest befestigt, wie es in anderen Säugetieren zu sehen ist. </li><li> Nehmen Sie das Trommelfell vorsichtig aus dem Manubrium, die zerbrechlich ist. Entfernen Sie das Trommelfell Knochen die drei Gehörknöchelchen zu offenbaren. </li><li> Verrücken die Malleus aus dem Ambos am Gehörknöchelchen Gelenk (Abbildung 2H). </li><li> Isolieren Sie die Hammers durch den vorderen Prozess am goniale Fracturing. </li></ol></li><li> Amboß und Steigbügel <ol><li> Isolieren ter incus durch den hinteren Ligamentum des Incus am kurzen crus (3A) abschneidet. </li><li> Isolieren Sie die Steigbügel durch die Steigbügel Arterie in der Nähe der Steigbügel mit der abgeschrägten Kante einer 27 G - Nadel (3B, C) abschneidet. Falls erforderlich, schneiden die Sehne des M. stapedius am Muskelprozess der Steigbügel mit der Nadel. </li><li> Legen Sie eine Nähnadel (oder einen Markierungsstift) in die Hüftbeinloch des Steigbügels und heben Sie die Steigbügel nach oben. Nach dem Steigbügel zu entfernen, sollte die ovalen Fensteröffnung deutlich sichtbar (Abbildung 3D) sein. </li></ol></li></ol> 3. Embedding von Auditory Bulla und Kapsel <ol><li> Vorbereitung für die in Paraffinblöcken Einbetten <ol><li> Isolieren Sie die Bulla und Kapsel, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Schneiden Sie das vordere Ende des Bulla (der styliform Prozess) aus mit einer Schere, tauchen Sie die Bulla und Kapsel in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei 4 °C und erlauben Fixiermittel in die Bulla einzugeben. Wenn die Luft in der Bulla eingeschlossen wird, entfernen Sie sie mit einer Nadel und Spritze. Lassen Sie das Bulla und Kapsel in dem Fixiermittel bei 4 ° CO / N an einem Rohr Rotator. Achtung: PFA ist giftig und sollte sorgfältig behandelt werden. </li><li> Wasche einmal mit PBS. </li><li> Entkalken Bulla und Kapsel für eine Woche bei 4 ° C in 10% Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-Base, pH 7,0, in einem 2-ml-Röhrchen. Ändern Sie den Puffer jeden zweiten Tag. </li><li> Wasche einmal mit PBS. Proben können in 70% Ethanol in Wasser bei 4 ° C gelagert werden. Wahlweise Übertragung auf 70% Ethanol durch eine abgestufte Alkoholserie (30%, 50%, 70% in Wasser). </li><li> Auf einem Gewebeprozessor, dehydrieren Proben in einer abgestuften Reihe von Ethanollösungen (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, jeweils 1 h), klar in Xylol (4x, jeweils 1 h bei 40 ° C) und infiltrieren Proben mit geschmolzene Paraffinwachs 42. Optional Ersatz Xylol mit kommerziellen Gewebe clearing Lösung (zB Histo-Clear). </li><li> Unload Proben aus dem Prozessor, und entfernen Sie sie aus ihren Kassetten. </li><li> Auf einem Konsolensystem Gewebeein, Ort Proben in Formen mit geschmolzenem Paraffinwachs gefüllt. Gehen Sie zur Einbettung (Abschnitt 4). </li></ol></li><li> Vorbereitung für die in gefrorenen Blöcken (Kawamoto Film - Methode) das Einbetten 43 <ol><li> Isolieren Sie die Bulla und Kapsel, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Schneiden Sie das vordere Ende des Bulla (der styliform Prozess) aus mit einer Schere, tauchen Sie die Bulla und Kapsel in Fixierungsmittel (2% bzw. 1% PFA und nicht 4% in PBS Antigenität zu erhalten) bei 4 ° C. Wenn Luft in Bulla gefangen ist, entfernen Sie sie mit einer Nadel und Spritze. Lassen Sie das Bulla und Kapsel in dem Fixiermittel bei 4 ° CO / N an einem Rohr Rotator. </li><li> Waschen Sie Bulla und Kapsel schnell in PBS und sofort in flüssigem Kryo-Einbettmasse bei 4 ° C tauchen. </li><li> Wichtig: Entfernen Sie Luftblasen, wenn eine in der Mitteund Außenohr durch Aspiration durch eine Nadel, und durch die Einbettung Verbindung mit einer Pinzette hinzufügen. Gehen Sie zur Einbettung (Abschnitt 4). </li></ol></li></ol> 4. Probenorientierung und Embedding HINWEIS: Die gesamte Bulla und Kapsel muss beim Einbetten in einer bestimmten Ausrichtung angeordnet werden, um gewünschte Abschnitte zu schneiden. Die unten beschriebenen Verfahren werden in Abschnitt verwendet, um die Malleus in verschiedenen Ausrichtungen. <ol><li> Längs (parasagittal) Schnitte des Hammers <ol><li> Setzen Sie die Querseite des Bulla oder äußeren Gehörgang nach unten in warmen Paraffin (oder Kryo-Einbettmasse). Passen Sie die Ausrichtung so , dass der Hals und Quer Lamina des Hammers auf den horizontalen Boden des Einbettungsschale parallel sind (4A - C). Man beachte , dass das Trommelfell in einem Winkel von etwa 30 ° zur Vertikalen in der Maus Kopf (4A geneigt ist, Figur 59 in Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Horizontale Schnitte des Hammers <ol><li> Platzieren Sie den Rückenkamm horizontal in warmem Paraffin (oder Kryo-Einbettmasse). Stellen Sie die Ausrichtung der Bulla und Kapsel , so dass der Hals und transversal Lamina des Hammers auf die Unterseite des Einbettungsschale senkrecht sind (4D - F). </li></ol></li><li> Frontal Schnitte (Querschnitte) von manubrium und Trommelfell 5 <ol><li> Legen Sie die malleal manubrium in warmem Paraffin (oder Kryo-Einbettmasse), so dass es senkrecht zum Boden des Einbettungsschale. </li></ol></li><li> Kühlen Sie den Block auf Temperaturen geeignet Paraffinwachs auf einem Gewebeeinkonsolensystem härten (alternativ verwenden Kryo-Einbettmasse in einem Trockeneis / Hexan-Bad). </li><li> Prozessgewebeblock und Zuschnitten unter Verwendung von Routineverfahren. Beispielsweise stain Paraffinschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; #38; E), Safranin O (für Knorpel) oder zur Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Aktivität (für Osteoklasten) 3, oder durch Immunhistochemie. Unentkalkte Kryoabschnitte eignen sich für die Kennzeichnung Knochen Fluorochrome 14, Alizarin - Rot - Färbung für Kalzium verwendet und Immunofluoreszenz 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir eine Methode nützlich, um die Gehör Bulla und Kapsel in der postnatalen Mäusen zu isolieren. Vor dem P12 sind Gewebe zerbrechlich und kann während der Isolierung beschädigt werden. Nach P12 kann der auditorischen Bulla und Kapsel leicht aus den umliegenden Gewebe isoliert werden. die Bulla vom Kopf Dissecting vor sectioning hat mehrere Vorteile. Als erstes postnatale Kavitation und das Wachstum des auditorischen Bulla treten am aktivsten von P6 ab und sind vollständig von P14 50. Die mesenchymalen Gewebe zwischen dem Trommelfell und Cochlea-Wand wird durch Luft, die durch die Kavitation ersetzt. Die sich ergebende Luft in der Paukenhöhle kann Kontakt zwischen Gewebe und Flüssigkeiten während der Fixierung, Entkalkung und Einbettung behindern. Es ist einfacher, Luft aus dem isolierten auditorischen Bulla zu entfernen, indem das vordere Ende (styliform Prozess) das Abschneiden anstatt zu versuchen, so in der unisolierten Bulla zu tun. Zweitens Ausrichtung des Hammers (und das Trommelfell) nicht vertikalim Kopf. Es ist daher leichter zu Abschnitt der Malleus in gewünschten Ebenen, die durch die isolierte auditorischen Bulla und Kapsel in einer bestimmten Orientierung Einbettung. Einmal isoliert, auditiv Bulla und Kapseln sind für zahlreiche Analysen nützlich. Zum Beispiel, hochauflösende Röntgen Mikro-CT kann Knochenmikrostruktur Morphologie wie osteogene Kapillaren in der Malleus 14 offenbaren. Die die Stereo Präpariermikroskop ist ein leistungsfähiges Werkzeug Strukturen zu visualisieren reporter Mäuse bei der Bewertung 33 fluoreszierende Proteine in der Mittel- oder Innenohr exprimiert. Darüber hinaus könnten verschiedene in vivo oder ex vivo Fluoreszenz - Markierungsverfahren und whole mount Immunfluoreszenz - Nachweis durchgeführt werden. Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie ist auch nützlich für die dreidimensionale Analyse 51. Obwohl hier nicht beschrieben, diverse anatomische Strukturen mit auditorischen Bulla und Kapsel verbunden sind, wie periphere Nerven, Blutgefäßen, unddas Trommelfell in das Mittelohr können auch unter Verwendung dieses Protokolls ausgewertet werden. Beachten Sie, dass Paraffin Schneide Entkalkung von Knochengewebe erfordert vor dem Einbetten und daher nicht Analyse der Mineralisierung nicht gestattet. Im Gegensatz dazu 43 der Kawamoto Filmverfahren verwendet , um Gefrierschnitten zubereiten können ohne Entkalkung durchgeführt werden und ist geeignet für Studien Mineralisierung in vivo Knochen-Markierungstechniken oder spezielle Färbung wie Alizarin - Färbung verwendet wird . Cryo-Schneidebedingungen sollten entsprechend auf Maus Alter optimiert basiert. Beispielsweise wird eine weniger kühle Temperatur im Inneren der Kryostatkammer für ältere Maus Proben empfohlen Beschädigung Abschnitte zu minimieren. In der Maus ist die korrekte Bezeichnung für den prominenten halbkugelförmigen Vorsprung des Hammers &quot;orbicular apophysis&quot;. Dennoch wurde der verwendete Begriff &quot;Processus brevis&quot; weit die orbicular apophysis für mehr th, um anzuzeigen,ein zwei Jahrzehnte, vor allem bei der Maus Entwicklungsbiologen 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; ursprünglich auf den seitlichen Prozess bezeichnet (Processus lateralis), die von der orbicular apophysis unterscheidet. Beim Menschen bildet eine seitliche Prozess der allgemeinen Linie der Bindung an das Trommelfell einen leichten konischen Vorsprung ähnelt, von der manubrium erstreckt (nicht in 6B, Ansicht von medial gesehen). In Mäusen ist die laterale Verfahren auch ein Vorsprung des Manubrium am entgegengesetzten Ende mit dem Umbo 48. Die Pars flaccida des Trommelfells über dem seitlichen Prozess des Hammers. Orbicular apophysis ist im menschlichen Malleus nicht ersichtlich.

Die drei Gehörknöchelchen des Mittelohrs, nämlich die Hammer, Amboß und Steigbügel, bilden eine Säugetierspezifischen auditorischen Kette , die Schall vom Trommelfell zum Innenohr überträgt, oder Cochlea 1,2. Gehörfunktion kann durch Messung Hirnstammaudiometrie (ABR) Schwellen 3-6, und die Schwingung des Hammers hinter dem Trommelfell in Mäusen bewertet werden kann unter Verwendung von Laser - Doppler - Vibrometer überwacht werden (LDV) 7. Durch die Kombination von ABR, LDV und Verzerrungsprodukt otoakustischer Emission (DPOAE) Messungen kann Leitungsschwerhörigkeit von sensorineuralen Beeinträchtigung 8 unterschieden werden. Tiermodelle von Ohr Bedingungen benötigt werden, angesichts der Bedeutung des Hörens und Ohr Gesundheit das Wohlbefinden von Patienten aller Altersgruppen. Zum Beispiel ist Otitis media eine extrem häufige Ohr-Infektion in menschlichen Säuglingen und Kindern gesehen, und schwere, akute Otitis media und ihre Komplikationen, wenn die Bedin auftreten kanntion nicht mit geeigneten antimikrobiellen Mitteln 9 behandelt. Mausmodelle von Otitis media konnte die Pathogenese beim Verständnis und bei der Entwicklung von Behandlungen 10,11 nützlich erweisen. Murine Gehörknöchelchen, die ( mit Ausnahme des goniale Teil des Malleus) durch endochondrale Ossifikation gebildet werden 12,13 sind von großer Bedeutung für die Untersuchung des Knochenstoffwechsels und Morphogenese. Erstens, ihre geringe Größe ermöglicht hochauflösende Analyse von Knochen mit einem intakten Periost 14 Röntgen- oder Fluoreszenzmikroskopie. Zweitens anomale Knochenmetabolismus, wie übermäßige oder mangelhafte Knochenresorption oder beeinträchtigter Wechselwirkungen zwischen Knochenzellen 15 kann als potenzieller Beitrag zum Hörverlust 3,4,7 analysiert werden. Drittens abnormal Gehörknöchelchen Morphogenese in mehreren Gen-defizienten Mäusen, wie Tiere berichtet Hoxa2 fehlt 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, Fgfr1 29, Schilddrüsenhormon - Rezeptoren (Thra, Thrb) 5, Bcl - 2 30 und andere 1,31 oder bei Mäusen überexprimiert , Hoxa2 32. Schließlich trotz ihrer geringen Größe mit Gehörknöchelchen verbunden sind Strukturen wie Muskeln 33 und Gelenke 34,35 sind zugänglich. Maus Gehörknöchelchen sind kleiner als menschliche Gehörknöchelchen, aber es ist bemerkenswert, dass die Maus Mittelohr ist nicht eine Miniaturversion der weibliche Körper. Zum Beispiel bei Mäusen, die Steigbügel Arterie, die durch den Ring der Steigbügel geht, bleibt während des gesamten Lebens 36, während bei Menschen, die embryonale Steigbügel Arterie während der Schwangerschaft verschwindet. Darüber hinaus unterscheidet sich die Morphologie der Maus malleus von der the menschlichen Knochen (siehe Abbildung 6). Bei Mäusen umschließt die auditorische (Pauken) Bulla die luftgefüllten Mittelohrhöhle, während beim Menschen, von trabekulären Knochen zusammengesetzt mastoid Luftzellen im Schläfenbein die Gehörknöchelchen und nicht als Bulla 37 untergebracht ist . Bei beiden Arten, die Gehörkapsel (Ohrkapsel, knöcherne Labyrinth) umschließt die Cochlea und Bogengänge des Innenohrs. Vergleichende und Evolutionsbiologie des Mittelohrs wurde 38-40 ausführlich überprüft. Das Protokoll unten zuerst bereitgestellt wird beschrieben, wie die auditorischen Bulla und Kapsel zu sezieren aus, die vor allem aus dem Mittelohr und Innenohr bestehen jeweils. Dieses Protokoll zeigt auch, wie die Hammer, Amboß und Steigbügel aus dem Gehör Bulla zu isolieren. Schließlich zeigt es, wie die auditorischen Bulla und Kapsel in der Vorbereitung für die Einbettung für die Gewebeschnittplan der Gehörknöchelchen zu orientieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Tools/Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paper towel</td>
			<td>DAIO PAPER CORPORATION</td>
			<td>703347</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Jar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">14cm surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>91400-14</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extra fine scissors-straight</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps Angled 45&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>for routine dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>for movies&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Injection needle 27G</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1ml)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marking Pin</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator RT-50</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000165-000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:259px;">http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC-65 Tungsten blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14021626379</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless containers</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryofilm type IIC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silane coated slide (New Silane II)</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>511617</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue processor</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">VIP-5</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">Tissue-Tek TEC 5&#160;</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sliding microtome for paraffin</td>
			<td>Yamato Kohki Industrial</td>
			<td>REM-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Path Blade+pro for hard tissue</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>PB3503C</td>
			<td>for paraffin section</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT</td>
			<td>RIGAKU</td>
			<td>R_mCT2</td>
			<td>http://www.rigaku.com/en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>285-14</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4 12H2O</td>
			<td>wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>wako</td>
			<td>287-21</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde(EM Grade)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA-2Na</td>
			<td>wako</td>
			<td>15111-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryoembedding Medium</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Ice</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hexane</td>
			<td>wako</td>
			<td>080-03423</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryomouting Medium type R2</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>781001A0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histo-Clear</td>
			<td>NDS</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>340-00433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin&#160;</td>
			<td>wako</td>
			<td>131-09665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>wako</td>
			<td>051-06515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

Bei den meisten Säugetieren, Gehörknöchelchen im Mittelohr, einschließlich der Hammer, Amboß und Steigbügel, sind die kleinsten Knochen. Bei Mäusen, die so genannte eine knöcherne Struktur der auditorischen Bulla die Gehörknöchelchen beherbergt, während die Gehörkapsel das Innenohr umschließt, nämlich die Cochlea und Bogengänge. Murine Gehörknöchelchen sind von wesentlicher Bedeutung für das Hören und somit von großem Interesse für Forscher auf dem Gebiet der HNO-Heilkunde, sondern ihren Stoffwechsel, Entwicklung und Evolution sind auf anderen Gebieten sehr relevant. Veränderte Knochenstoffwechsel kann zu Gehörfunktion in erwachsenen Mäusen beeinflussen und verschiedene Gen-defiziente Mäuse zeigen Veränderungen in der Morphogenese von Gehörknöchelchen in utero. Obwohl murine Gehörknöchelchen klein sind, ist ihre Handhabung möglich ist, wenn man ihre anatomischen Orientierung und 3D-Struktur versteht. Hier beschreiben wir, wie die auditorischen Bulla und Kapsel von postnatalen Mäusen zu sezieren und dann einzelne Gehörknöchelchen isolieren, indem ein Teil der Bulla zu entfernen. Wir diskutieren auch, wie emBett der Bulla und Kapsel in unterschiedlichen Ausrichtungen geeignet zur Herstellung von longitudinal, horizontal oder frontalen Abschnitte des Malleus Paraffin oder Gefrierschnitten zu erzeugen. Schließlich aufzuzählen wir anatomischen Unterschiede zwischen Maus und Mensch Gehörknöchelchen. Diese Verfahren wäre nützlich bei der Analyse von pathologischen, Entwicklungs- und evolutionäre Aspekte der Gehörknöchelchen und das Mittelohr bei Mäusen.

Dieses Protokoll stellt eine Methode Gehörknöchelchen aus der auditorische Bulla zu isolieren. Zuerst werden die Bulla und Kapsel herauspräpariert als ein einzelnes Stück aus dem Schädel (Abbildung 1). Die sezierten Bulla wird dann verwendet , um den Malleus (Abbildung 2) und dem Amboß und Steigbügel (Abbildung 3) herzustellen. Sehenswürdigkeiten des auditorischen Bulla und Kapsel sind die styliform Prozess am vorderen Ende des Bulla, der Rückenkamm, vorderen Bogengangs und der subarcuate Fossa (1F). Microcomputed - Tomographie (CT) Bildgebungs zeigt Gehörknöchelchen im auditorischen Bulla sowie die optimale Ausrichtung für Längs- und horizontale Schnitte dieser Gehörknöchelchen (Abbildung 4). Für Längs Paraffin Schneide des Hammers wurden die Bulla und Kapsel bei 4 ° C in EDTA entkalkt für eine Woche in einem pa eingebettetraffin Block bei der gezeigten Ausrichtung in Figur 4 A - C, bei 4 &amp; mgr; m, geschnitten und dann H &amp; E gefärbt werden. Der Malleus an das Trommelfell im auditorischen Bulla angebracht enthüllt laufenden endochondral Verknöcherung bei P14 (5A). Um neue Knochenbildung sichtbar zu machen, Calcein (30 ug / g Körpergewicht) wurde peritoneal in eine P20-Maus injiziert, und Bulla und Kapsel wurden 24 Stunden später bei P21 isoliert. Die Probe ohne Entkalkung wurde gefroren eingebettet und dann bei 6 um gefriergeschnitten einen Klebefilm unter Verwendung basierend auf dem Verfahren von Kawamoto 43. Nach Kernfärbung mit DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol), wurde der Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Calcein - Signale (grün) zeigte neue Knochenbildung in der Malleus (m), Bulla und Kapsel (5B). Für horizontale Schnitte des Hammers, die auditorischen Bulla von einem 5-Wochen alten Maus isoliert wurde ohne Entkalkung gefroren eingebettet (für denOrientierung siehe Abbildung 4D - F), gefriergeschnitten bei 6 um die Kawamoto - Methode und unter Verwendung von H &amp; E gefärbt. Horizontale Schnitte des malleal Processus brevis (mPB) zeigt auch die Cochlea (5C). Eine mediale Ansicht der rechten Gehörknöchelchen aus einer P31 - Maus isoliert zeigt typische Merkmale der Maus Malleus, nämlich die &quot;Gleit-Möwe-Flügel-like&quot; (oder persischer schwertartigen 45) manubrium, ein prominentes Processus brevis (orbicular apophysis siehe Diskussion), und die transversale Lamina (Abbildung 6). Beachten Sie, dass der vordere Prozess (Processus anterior) in der Dissektion Verfahren um die goniale gebrochen wurde und aus der Paukenring (ectotympanic) getrennt. Diese repräsentative Stichprobe zeigt eine intakte incudomalleolar Verbindung zwischen dem Hammer und Amboß, während die incudostapedial Gelenk verrenkt wird. Sehnenansätze in die malleal undSteigbügelmuskel Prozesse sind nachweisbar (6A, Sternchen). 6B vergleicht Maus und Mensch Gehörknöchelchen bei gleicher Vergrößerung. Speziesunterschiede, andere als Größe, sind die folgenden. Der malleal manubrium ist flügelartig in Mäusen, aber Club-beim Menschen. Der Winkel zwischen der anatomischen Achse (oder der Drehachse, die Linie, die durch den vorderen Prozess des Hammers und dem kurzen Fortsatz des Amboß) und dem Manubrium ist viel kleiner in Mäusen und die beiden sind fast parallel, hinsichtlich nahezu senkrecht Gegensatz beim Menschen 6,46-48. In der menschlichen Gehörknöchelchen, offenbaren vibrometric Studien , dass die incudo-malleolar Gelenk beweglich ist und nicht funktional 49 fixiert. Die Maus Malleus zeigt eine breite, dünne und flache transversale Lamina nicht offensichtlich beim Menschen 47. Bei Mäusen, Sicherungen der Processus anterior membranösen Knochen, nämlich die goniale und der tympanic Ring, während beim Menschen die processus anterior zu einem kleinen spicule Knochen 41 reduziert. Der Steigbügel von Mäusen und Menschen unterscheidet sich auch: bei Mäusen, die vordere Crus gekrümmt ist und der hintere Crus ist gerade während bei Menschen, die vordere Crus ist gerade als die hintere Crus. Es ist erwähnenswert, dass der Malleus Kopf relativ zur Körpergröße massiv in Arten wie der Goldmulle vergrößert wird, 48 erhebliche Variabilität in allometric Beziehungen von &quot;kleinsten&quot; Knochen zu demonstrieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection des Auditory Bulla und Kapsel. (A) Der Schädel eines P31 - Maus ist in rechte und linke Hälften geteilt. A, vordere; P, posterior; L, links; R, rechts. (B) Medial Oberfläche der rechten Hälfte des halbierten, gehäutet Kopf. Cx, Hirnrinde; Cb, Cerebellum; Bs, brainstem. D, dorsale; V, ventralen. (C) Entfernung des Gehirns mit einer Pinzette. (D) Medial Ansicht des auditorischen Kapsel im rechten Schädel. Der Rückenkamm (Pfeilspitzen) liegt zwischen der mittleren Schädelgrube (mcf) und hinteren Schädelgrube (PCF) und trennt dorso-anterioren und ventro- hinteren Oberflächen der Gehörkapsel. Maßstabsbalken, 2 mm. (E) Eine stärkere Vergrößerung der auditorischen Bulla und Kapsel (medial). Co, Cochlea; VII, Gesichtsnerven; VIII, N. vestibulocochlearis; AC, vordere (superior) Bogengang; Sf, subarcuate Fossa, die die Kleinhirns paraflocculus beherbergt. Maßstabsbalken, 1 mm. (F) Mikroskopische Aufnahme von isolierten auditorischen Bulla und Kapsel (medial). Sp, styliform Prozess. Maßstabsbalken, 1 mm. (A - E), P31 Maus. (F), P33 Maus. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dissektion der Malleus. (A) Ventrolateral Ansicht eines rechten Gehör Bulla und Kapsel. Der Sulcus tympanicus (ST, gestrichelte Pfeil) ist die Bindungsstelle des Trommelfells. Der Knochen lateral der ST ist ein Teil des äußeren Ohrs und der Knochen medial der ST bildet den Boden der Mittelohrhöhle. A, vordere; P, posterior; D, dorsale; V, ventralen. (B) Ansicht nach Entfernung des äußeren Gehörgangs zu offenbaren das Trommelfell (TM) einschließlich der Pars flaccida (Pf) und Pars tensa (Pt). (C) Entfernung von Teilen des Trommelfells Knochen (gestrichelte Linien und #) in der Nähe des malleal Processus brevis (mPB). m, Malleus; mM, malleal manubrium. Pfeil, Luftblase in der Paukenhöhle durch das Trommelfell gesehen. (D) Exposed Malleus. Malleus Kopf angezeigt. GepunkteteLinie zeigt die Gelenkfläche des Ambos. (E) Tendon des Tensor tympani (TT) mit dem Malleus befestigt. (F) Der Tensor tympani gezogen wird , wenn der Hammer angehoben wird. *, Muskel Prozess. (G) Tensor tympani geschnitten , um eine Nadel. (H) drei Gehörknöchelchen nach Entfernung des Trommelfells. Die incudo-malleolar Gelenk verrenkt. m, Malleus; i, Amboß; s, Steigbügel; Gehen, goniale (fusioniert mit dem Malleus und Paukenring, TR). Alle Maßstabsbalken, 0,5 mm. (A, H), P33 Maus. (B - G), P31 Maus. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dissektion der Amboß und Steigbügel. (A) Incus undSteigbügel nach Entfernung des Hammers. Die Steigbügel Arterie (SA) durch den Steigbügel (s). Die gestrichelte Linie zeigt die Gelenkfläche des Ambos. Beachten Sie, dass die kurze crus (ICB, crus breve) des Amboß (i) durch das hintere Band befestigt ist (nicht gezeigt). Asterisk, Muskel Prozess der Steigbügel. (B) Steigbügels nach Entfernen des Incus. Nadelspitze wird verwendet, um die Steigbügel Arterie zu schneiden (SA). Pfeil, Richtung des Blutflusses. Die gestrichelte Linie zeigt Gelenkfläche des Steigbügels. (C) Die Steigbügel Arterie aus dem Steigbügel entfernt. X zeigt die abgeschnittene Ende des Steigbügel Arterie (SA). (D) Das ovale Fenster (Ow, ovalen Fenster oder fenestra vestibuli) sichtbar ist nach dem Entfernen der Steigbügel. Rw, runde Fenster (runden Fensters oder fenestra Cochlea). Maßstabsbalken, 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen</a>Zahl. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ausrichten der Auditory Bulla und Kapsel während der Einbettung für Longitudinal (parasagittal, A - C) und horizontale (D - E) Sectioning des Malleus. (A - C) Der Hals und Quer Lamina des Hammers angeordnet sind parallel zum Boden des Tellers einzubetten. (A) Seitenansicht: Mikro-CT - Bild zu zeigen Einbettung des rechten Malleus in der Bulla (pseudocolored blau). Der Hammer und Amboß sind pseudocolored grün. Eine gestrichelte Linie, die gewünschte Schnittebene. Durchgezogene Linie, Schalenboden eingebettet ist. m, Malleus; Pfeilspitzen, Rückenkamm. M, medial; L, lateral; D, dorsale; V, ventralen. (B) Draufsicht: Micro-CT - Bild. Beachten Sie, dass das vordere Ende des Bulla (styliform Prozess) entfernt wurde. i, Amboß. (C) Draufsicht: Aufnahme (mit AAFarbfilter). AC, vordere (superior) Bogengang; Sf, subarcuate Fossa; Sp, styliform Prozess. A, vordere; P, posterior; D, dorsale; V, ventralen. (D - F) Der Processus brevis des Hammers senkrecht Schale der Einbettung auf den Boden gelegt. (D) Seitenansicht: Micro-CT - Bild Einbettung des rechten Malleus zu zeigen. Eine gestrichelte Linie, die gewünschte Schnittebene. Durchgezogene Linie, Schalenboden eingebettet ist. (E) Draufsicht: Micro-CT - Bild. mM, malleal manubrium. (F) Draufsicht: Aufnahme (mit einem Farbfilter aufgenommen). Maßstabsbalken, 1 mm. Micro-CT - Bilder wurden in einem Voxel Auflösung von 5 um, erhalten wie zuvor beschrieben 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Fild 5. Histologie. (A) H &amp; E - Färbung. Längs (parasagittal) Abschnitt der in Paraffin eingebetteten rechts Malleus (m) im auditorischen Bulla (gepunktete Linie) bei P14. TM, Trommelfell. (B) Calcein Knochen Kennzeichnung. Längsschnitt des gefrorenen, unentkalkte links Malleus (m) im auditorischen Bulla bei P21. Counterstain, DAPI. (C) H &amp; E - Färbung. Horizontalschnitt des gefrorenen, unentkalkte links malleal Processus brevis (mPB) im auditorischen Bulla und Kapsel (5 Wochen alten Maus). Co, Cochlea. Maßstabsbalken, 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Abbildung 6. Mediale Ansicht der Gehörknöchelchen. (A) rechts Gehörknöchelchen von P31 Maus. A, vordere; P, posterior; D, dorsale; V, ventralen. Maßstabsbalken, 1 mm. Malleus Kopf (Caput mallei, Capitulum mallei); Hals (Collum mallei); Lamina (transversal Lamina); mM (Manubrium mallei); schwarzer Stern (muskuläre Prozess des Hammers); MPa (Processus anterior Processus gracilis); mPB (Processus brevis); incus Körper (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kurz Crus, kurze Prozess); iCL (Crus longum, lange Crus, langer Prozess); IPL (Processus lenticularis, Lentikular-Prozess, Sylvian apophysis); Steigbügelkopf (Caput stapedis); weiß Sternchen (muskuläre Prozess des Steigbügels); sCA (Crus anterius, vordere Crus); scp (Crus posterius, posterior Crus); Basis (Basis stapedis, Fußplatte); SOF (Hüftbeinloch, intercrural Foramen). (B) Recht Gehörknöchelchen eines 76-jährigen weiblichen Menschen ( mit freundlicher Genehmigung von Institut für Anatomie, Keio University School of Medicine). Die Gehörknöchelchen der P31-Maus (unten rechts) in der gleichen Vergrößerung abgebildet wird, wie es für die menschliche Gehörknöchelchen verwendet. Curved Pfeile zeigen den Winkel zwischen der anatomischen Achse und dem Manubrium (gepunktete Linien). Maßstabsbalken, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.9K Aufrufe.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Serie: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Forschung

Biologie

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...