We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

1. استراتيجية تصميم Morpholino إنتاجية عالية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الجين (ق) من الفائدة (على سبيل المثال نهج الجين مرشح، تحليل رابطة الدول المستقلة التنظيمية، RNAseq و / أو شاشات التفاضلية البروتين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الجيني، transcriptomic، وبيانات التعبير الجيني متاح في المواقع التي يتم تحديثها باستمرار (على سبيل المثال SpBase http://www.echinobase.org 20 و S. purpuratus الجينوم البحث المتشعب: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index هتمل) لتحديد أن ملامح التعبير الزمانية المكانية يتداخل مع آلية تنموية في السؤال. إذا لم يكن هناك بيانات التعبير متاح، ثم تولد التمهيدي QPCR و / أو العقاقير في التحقيق الموقع لتقييم نمط التعبير الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحديد نمط التعبير المكاني والزماني، يجب الحصول على تسلسل الحمض النووي من المواقع على شبكة الإنترنت الجينوم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد أليغنوكليوتيد] morpholino حجب الترجمة، والحصول على تسلسل سو في &quot;المنطقة تترجم الامم المتحدة (5 &#39;5 UTR) المنبع مباشرة من كودون بدء من أعرب تسلسل العلامة (EST) قواعد البيانات المتاحة على SpBase أو S. purpuratus الجينوم مواقع البحث. إذا كانت هذه المعلومات غير متاحة لهذا الجين من الفائدة، ثم نفذ 5 &quot;سباق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصميم morpholino حجب لصق، ابحث عن تسلسل الجيني بما في ذلك الإكسونات وإنترونات باستخدام أداة سقالة blastn في SpBase أو S. purpuratus الجينوم أداة البحث. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الموقع النوكليوتيد تصميم http://oligodesign.gene-tools.com من أجل تصميم المطلوب 25 قاعدة تسلسل الزوج morpholino. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لmorpholino حجب متعدية، استخدم تسلسل مرنا من 5 &#39;إلى 3&#39; كمصدر للتسلسل الهدف متعدية. تشمل تسلسل 5 &#39;UTR (ما يقرب من 70 النيوكليوتيدات المنبع للموقع بداية النسخ)، بالإضافة إلى 25 قواعد الترميز المنطقة (المصب من موقع بداية) مع بداية كودون واي ملحوظقوسين ال (ATG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لmorpholino حجب لصق، حدد إنترون-إكسون أو تسلسل الحدود اكسون-إنترون وتشمل 50 قاعدة (25 قواعد تسلسل اكسون و 25 قواعد تسلسل إنترون) حول المناطق الحدودية. مسح الجينوم مع تسلسل morpholino للتحقق من أن تسلسل فريد من نوعه. </li></ol></li></ol> 2. Microinjection من Morpholino أليغنوكليوتيد] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3 الحلول الأسهم ملم من أليغنوكليوتيد] morpholino بإضافة 100 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه في morpholino قارورة 300 نانومول. ملاحظة: لا تستخدم DEPC المياه المعالجة لإعادة تعليق لاثيل pyrocarbonate يمكن أن تلحق الضرر morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأول تدور إعادة أسفل القارورة التي تحتوي على محلول المخزون النوكليوتيد لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لفترة وجيزة، الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق، دوامة لفترة وجيزة، والحفاظ على المخزون morpholino في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة على الأقل. Morpholino حل الأوراق المالية<html> يتم تخزين الصورة من -20 درجة مئوية إلى +4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الحقن التي تحتوي على أليغنوكليوتيد] morpholino في التركيز المطلوب. يحتوي هذا الحل عادة 20٪ الجلسرين أو 125 ملي بوكل باعتبارها الناقل و 15٪ FITC-ديكستران (فلوريسئين ثيوسيانات ديكستران 10000 ميغاواط 2.5 ملغ / ميكرولتر حل الأسهم). تستخدم FITC-ديكستران وغيرها تقارن ديكستران الفلورسنت بشكل روتيني لتحديد الأجنة حقن المجهري epifluorescence. حلول حقن مخزن في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة الحل morpholino عند 65 درجة مئوية في كتلة الحرارة أو حمام مائي لمدة لا تقل عن 2 - 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لفترة وجيزة الحل morpholino لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة (14،000 - 16،000 x ج) لمدة 10 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل إبر الحقن بمحلول morpholino. لبروتوكول حقن مكروي مفصل يرجى الاطلاع Stepicheva وكلمات 2014 21 وهتاف وEttensohn، 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> 3. التثبيت وفي بروتوكول الموضعي في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في س purpuratus الأجنة ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من اريناس-مينا وآخرون. 2000 23 و سيتي وآخرون. 2014 (24). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عدة قطرات من تثبيتي (انظر أدناه) إلى الآبار التي تحتوي على أجنة، مزيج بلطف قبل pipetting، والسماح لهم لتسوية. إزالة الحل تثبيتي، ثم خلط الأجنة مع اثنين من يغسل 180 ميكرولتر إضافية من تثبيتي. ملاحظة: من المهم أن تخلط جيدا الأجنة خلال يغسل طيف من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. يمكن عدم القيام بذلك تقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأجنة لإصلاح في غسل تثبيتي الثاني لمدة 50 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 4٪ المجهر الإلكتروني الصف امتصاص العرق تتكون من 10 ملي اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.1٪ توين-20، والاصطناعية seawateص (مضادة للغواصات). جعل هذا الحل جديدة في كل مرة حصول على أفضل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، لسهولة والتطبيق العملي الأجنة يتم إصلاحها في لوحات 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة 20 مل استخدام مثبت 5 مل 16٪ امتصاص العرق، 15 مل مضادة للغواصات، و 200 ميكرولتر 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، و 20 ميكرولتر توين-20. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 5 مرات في RT مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة مكونة من 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم و 0.1٪ توين-20 لمدة 5 دقائق على الأقل أو حتى الأجنة ينخفض ​​إلى أسفل البئر. مرة أخرى، ومن المهم أن تخلط جيدا الأجنة في غسل العازلة التي pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. غسل العازلة اجتماعات الأطراف يمكن أن تستخدم لمدة 2 أيام إذا تخزينها في 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 مل اجتماعات الأطراف غسل استخدام عازلة 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، و 32 مل درهم 2 O، و 40 ميكرولتر توين-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الأجنة ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام. ملاحظة: إذا تخزين الأجنة ثابتة لفترة أطول، ثم يضاف 0.2٪ أزيد الصوديوم في اجتماعات الأطراف غسل العازلة لمنع نمو البكتيريا.</li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في حل من قبل pipetting لطيف عدة مرات، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. يتكون عازلة تهجين من 70٪ الفورماميد، 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 1 ملغ / مل BSA و 0.1٪ توين-20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 مل استخدام عازلة تهجين 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، 4 مل O 2 درهم، 0.04 ز BSA، و 40 ميكرولتر توين-20. مزيج جيد من قبل vortexing، إضافة 28 مل الفورماميد، ودوامة مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل ومخازن التهجين وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 1: 2 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في الحل، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التحقيق التهجين المزيج بلطف الأجنة في 100-150 ميكرولتر من العازلة التهجين. احتضان الأجنة عند 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1ح. ملاحظة: احتضان الأجنة بين عشية وضحاها غير مقبول. قبل تفرخ، وختم الآبار مع ورقة لاصقة من أجل منع التبخر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب منفصل إضافة 0،1-0،3 نانوغرام / ميكرولتر من التحقيق و 500 ميكروغرام / مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال إلى عازلة تهجين، ثم دوامة بلطف لخلق حل التحقيق. يضاف الحمض الريبي النووي النقال الخميرة إلى حل التحقيق لخفض غير محددة ملزمة لجنة التحقيق لمكافحة الشعور. سخن هذا الحل إلى 50 درجة مئوية، والعازلة نضح التهجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط الأجنة المهجنة مسبقا إلى 100 ميكرولتر من محلول التحقيق، وختم مع ورقة لاصقة، وهجن عند 50 درجة مئوية لمدة 2-7 أيام اعتمادا على التحقيق (التحقيق foxq2 يمكن المحتضنة لمدة 2 أيام). ملاحظة: سوف تختلف الأوقات الحضانة القائم قبالة التحقيق. بعض الجينات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة تتطلب تصل إلى الحضانة لمدة 7 أيام. لوحات 96-جيدا يمكن وضعها في صندوق الرطوبة بمثابة تأمين ضد التبخر إذا كان ADHESفشلت ورقة إيف لختم صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 5 مرات في 50 درجة مئوية مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف تقدم طازجة غسل عازلة ليصبح المجموع 3 ساعات. ثم، ويغسل 3 مرات (15 دقيقة) مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. تذكر أن مزيج الأجنة في غسل العازلة في كل مرة من قبل pipetting بلطف عدة مرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وخلط الأجنة في 180 ميكرولتر من عرقلة العازلة التي تتكون من 10٪ مصل الأغنام عادي و 5 ملغ / مل BSA في اجتماعات الأطراف غسل العازلة واحتضان لمدة 45 دقيقة على الأقل في RT أو 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عازلة تمنع وثم خلط الأجنة في عرقلة العازلة التي تحتوي على التخفيف 1: 1500 من القلوية الأجسام المضادة الفوسفاتيز مترافق مكافحة digoxigenin المخفف في عرقلة العازلة. احتضان بين عشية وضحاها في RT في لوحة مغلقة لتجنب التبخر. ملاحظة: لا تترك الأجسام المضادة لفترة أطول من ليلة وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة 6 مرات (5 دقائق أو حتى إسقاط الأجنة) في اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. يمكن الأجنةخزنها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي تطور الموقعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة 3 مرات (10 دقيقة) في RT مع تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 تتألف من 0.1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 2، 1 ملم الليفاميزول، و 0.1٪ توين-20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة 20 مل درجة الحموضة استخدام 9.5 العازلة 2 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 400 ميكرولتر 5M كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgCl 2 و 20 ميكرولتر توين-20، 16.6 مل درهم 2 O، و0.0048 ز الليفاميزول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية في المخزن تلطيخ محمية من الضوء. يتكون عازلة تلطيخ من 10٪ ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر / مل 4-نيترو نتروبلو الأزرق كلوريد (NBT)، و 3.5 ميكرولتر / مل 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات (BCIP) في تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل1 مل من العازلة تلطيخ استخدام 100 ميكرولتر ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر NBT، و 3.5 ميكرولتر BCIP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل الفوسفاتيز القلوية عن طريق غسل 3-5 مرات في اجتماعات الأطراف غسل العازلة. واي رد فعلعشر التحقيق foxq2 وعادة ما يستغرق 30 دقيقة إلى 1 ساعة. قد يحتاج بعض تحقيقات الحضانة بين عشية وضحاها في أي RT أو 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط الأجنة في حل 70٪ غسل المماسح و30٪ الجلسرين. يوفر الجلسرين معامل الانكسار اللازمة للفحص المجهري. الأجنة يمكن تخزينها في هذا الحل لعدة أسابيع. ختم لوحات مع البارافين البلاستيك لمنع التبخر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح والتقاط صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح عن طريق ترتيب ثلاث شرائح صغيرة من الشريط على الوجهين في مثلث مع فجوات صغيرة بين الشرائط على شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في غسل المماسح 70٪ و 30٪ الحل الجلسرين إلى مركز المثلث، وتغطي مع ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم ساترة عن طريق تطبيق طبقة من طلاء الأظافر حول حواف ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور باستخدام مجهر الضوء مركب مع هدف 20X وكاميرا مثبتة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Erwin, D. H., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+hierarchical+gene+regulatory+networks.">The evolution of hierarchical gene regulatory networks.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+body+plan+development.">Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development.</a> Cell. 144, 970-985 (2011).</li><li>Borggrefe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch+intracellular+domain+integrates+signals+from+Wnt,+Hedgehog,+TGFbeta/BMP+and+hypoxia+pathways.">The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways.</a> Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).</li><li>Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+canonical+and+noncanonical+Wnt+signaling+pathways+patterns+the+neuroectoderm+along+the+anterior-posterior+axis+of+sea+urchin+embryos.">Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos.</a> PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).</li><li>Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF,+TGFbeta+and+Wnt+crosstalk:+embryonic+to+in+vitro+cartilage+development+from+mesenchymal+stem+cells.">FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).</li><li>Lapraz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTK+and+TGF-beta+signaling+pathways+genes+in+the+sea+urchin+genome.">RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome.</a> Dev Biol. 300, 132-152 (2006).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+signalling+pathways+in+animal+development.">The evolution of signalling pathways in animal development.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).</li><li>Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+signaling+crosstalk+regulates+endomesoderm+segregation+in+sea+urchin+embryos.">Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos.</a> Science. 335, 590-593 (2012).</li><li>Range, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+positioning+of+the+anterior+neuroectoderm+in+deuterostome+embryos.">Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos.</a> Genesis. 52, 222-234 (2014).</li><li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+and+the+polarity+of+the+primary+body+axis.">Wnt signaling and the polarity of the primary body axis.</a> Cell. 139, 1056-1068 (2009).</li><li>Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deuterostome+origin+of+the+Spemann+organiser+suggested+by+Nodal+and+ADMPs+functions+in+Echinoderms.">A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms.</a> Nature communications. 6, 8434 (2015).</li><li>Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+mechanisms+of+Wnt+signaling+pathways.">Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways.</a> Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).</li><li>Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development.">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).</li><li>Houart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+the+telencephalon+during+gastrulation+by+local+antagonism+of+Wnt+signaling.">Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling.</a> Neuron. 35, 255-265 (2002).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Rottinger, E., Lowe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+hemichordates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates.</a> Development. 139, 2463-2475 (2012).</li><li>Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+control+in+the+sea+urchin+aboral+ectoderm:+spatial+initiation,+signaling+inputs,+and+cell+fate+lockdown.">Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown.</a> Dev Biol. 374, 245-254 (2013).</li><li>Saudemont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancestral+regulatory+circuits+governing+ectoderm+patterning+downstream+of+Nodal+and+BMP2/4+revealed+by+gene+regulatory+network+analysis+in+an+echinoderm.">Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm.</a> PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).</li><li>Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpBase:+the+sea+urchin+genome+database+and+web+site.">SpBase: the sea urchin genome database and web site.</a> Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).</li><li>Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+Hox+cluster+genes+in+the+ontogeny+of+a+sea+urchin.">Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin.</a> Development. , 4631-4643 (2000).</li><li>Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+labeling+in+developmental+gene+regulatory+network+analysis.">Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis.</a> Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).</li><li>Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+is+essential+for+patterning+the+maternally+specified+animal-vegetal+axis+in+the+sea+urchin+embryo.">beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).</li><li>Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wnt-FoxQ2-nodal+pathway+links+primary+and+secondary+axis+specification+in+sea+urchin+embryos.">A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos.</a> Dev Cell. 14, 97-107 (2008).</li><li>Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal:+master+and+commander+of+the+dorsal-ventral+and+left-right+axes+in+the+sea+urchin+embryo.">Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).</li><li>Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo.">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li><li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin,+a+TGF-beta+related+to+Vg1.">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li><li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin.">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li><li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells,+control+skeletal+morphogenesis+[corrected]+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development.">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li><li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin.">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology.">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li><li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm.">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).</li><li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li><li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos.">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li><li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos.">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li><li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR/Cas9+system.">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

منهجية المعروضة هنا هي مثال يوضح قوة باستخدام الأجنة مع أقل التعقيد الجيني والصرفي من الفقاريات لفهم مسارات الإشارات تنبيغ وGRNs التي تحكم آليات التنموية الأساسية .. العديد من المعامل تستخدم المقايسات مماثلة خلال تطوير قنفذ البحر في وقت مبكر لتشريح مسارات الإشارات ال...

شبكات الجينات التنظيمية (GRNs) وإشارة مسارات نقل تنشئ التعبير المكاني والزماني للجينات خلال التطور الجنيني التي تستخدم لبناء خطة الكبار جسم الحيوان. خلية الى خلية مسارات نقل الإشارة هي المكونات الأساسية لهذه الشبكات التنظيمية، وتوفير الوسائل التي تتواصل الخلايا. هذه التفاعلات الخلوية إنشاء وصقل التعبير عن الجينات التنظيمية والتمايز في ومن بين المناطق المختلفة خلال مرحلة التطور الجنيني 1 و 2. التفاعلات بين جهري يفرز خارج الخلية (بروابط، الخصوم)، المستقبلات، وشارك في مستقبلات السيطرة على أنشطة مسارات نقل الإشارة. مجموعة متنوعة من الجزيئات داخل الخلايا transduces هذه المدخلات مما أدى إلى التعبير المعدلة وراثيا، وتقسيم، و / أو شكل الخلية. في حين أن العديد من الجزيئات الأساسية المستخدمة على الصعيدين خارج الخلية والخلايا في مسارات رئيسية هيالمعروف، وهو المعرفة غير مكتملة بسبب في جزء كبير منه إلى تعقيد مسارات الإشارات الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، مسارات الإشارات المختلفة غالبا ما تتفاعل مع بعضها البعض إما سلبا أو إيجابا في الخلية، داخل الخلايا، ومستويات النسخي 3، 4، 5، 6. الأهم من ذلك أن المكونات الأساسية لمسارات نقل الإشارة والحفظ جدا في جميع الأنواع metazoan، وبشكل ملحوظ، فإن معظم مسارات الإشارات الرئيسية غالبا ما تؤدي وظائف تنموية مماثلة في العديد من الأنواع عند المقارنة بين الكائنات الحية من من الكائنات الحية ذات صلة وثيقة على وجه الخصوص 7، 8، 9، 10، 11. دراسة يشير خلال التنمية هي مهمة شاقة في أي كائن حي، وهناكهي عدة تحديات كبيرة لدراسة مسارات إشارات في معظم النماذج ثنائي الفم (الفقاريات، حبليات اللافقارية، نصف حبليات، وشوكيات الجلد): 1) في الفقاريات هناك أعداد كبيرة من الممكن يجند والتفاعلات مستقبلات / المشارك المغير، جزيئات تنبيغ الخلايا، وكذلك التفاعلات المحتملة بين مسارات الإشارات المختلفة نظرا لتعقيد للجينوم 12، 13، 14؛ 2) مورفولوجيا معقدة والحركات التخلق في الفقاريات غالبا ما تجعل الأمر أكثر صعوبة لتفسير التفاعلات الوظيفية في وبين مسارات نقل الإشارة. 3) تحليل في معظم الأنواع اللافقارية نموذج ثنائي الفم غير شوكي-تقتصر من قبل ويندوز قصيرة من الحمول باستثناء بعض الأنواع الغلالة 15 و 16. القنفذ البحر الجنين لديها عدد قليل من القيود المذكورة أعلاه ويقدم العديد من المزايا الفريدة لإجراء تحليل مفصل لمسارات نقل الإشارة في الجسم الحي. وتتضمن ما يلي: 1) البساطة النسبية للجينوم قنفذ البحر يقلل بشكل ملحوظ من عدد ممكن يجند، مستقبلات / مستقبل مساعد والخلايا جزيء التنبيغ التفاعلات 17؛ 2) GRNs السيطرة على مواصفات والزخرفة من طبقات جرثومية ومحاور الجنينية الرئيسية هي راسخة في الأجنة قنفذ البحر، والمساعدة في فهم السياق التنظيمي للخلية / إقليم تلقي الإشارات 18، 19؛ 3) العديد من مسارات نقل إشارة يمكن دراستها بين مراحل الانقسام والمعيدة في وقت مبكر عندما تتكون الأجنة من ظهارة الطبقات واحدة التي التشكل هو أسهل لتحليل. 4) جزيئات تنطويد في مسارات إشارات في والتلاعب بها بسهولة قنافذ البحر. 5) وحامل العديد من قنافذ البحر لمدة 10 إلى 11 شهرا في السنة (على سبيل المثال Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus). هنا، فإننا نقدم وسيلة لتمييز منهجي وكفاءة مكونات مسارات الإشارات التي تحدد والأقاليم نمط في الأجنة قنفذ البحر لتوضيح المزايا التي توفرها العديد من الأنظمة نموذج اللافقارية في دراسة الآليات الجزيئية المعقدة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino</td>
			<td>Gene Tools LLC</td>
			<td>Customized</td>
			<td>More information at www.gene-tools.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td>D1821</td>
			<td>Make 25mg/mL stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1254-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23336-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>47671-1L-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15401-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 093 274 910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride (levamisole)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9756-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base UltraPure</td>
			<td>Research Products Internationall Corp</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 383 221 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 383 213 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the power of simplicity: sea urchin embryos as in vivo developmental models for studying complex cell-to-cell signaling network interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

في جنين قنفذ البحر أظهرنا أن 3 إشارات Wnt مختلف فروع (WNT / β-كاتينين، WNT / JNK، وWNT / بي كي سي) 4، 25 تفاعل لتشكيل شبكة الإشارات WNT الذي يحكم الأمامي الخلفي (ا ف ب) الزخرفة. إحدى النتائج الأكثر أهمية في هذه الأحداث يشير هو أن أعرب ع...

Watch this Scientific Journal Video about The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions at JoVE.com

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

تفاصيل هذه المقالة الفيديو مباشرة في منهجية الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لمنهجية وكفاءة تميز مكونات مسارات الإشارات المعقدة وشبكات تنظيمية في العديد من الأجنة اللافقاريات.

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما<em&gt; في فيفو</em&gt; نماذج التنموية لدراسة مجمع خلية الى خلية اشارة شبكة التفاعلات

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

The overall goal of these experiments is to illustrate the advantages that simple organisms offer in the study of complex interactions among gene regulatory networks that direct developmental processes.This methodology can help answer key questions in evolutionary and developmental biology, such as how signaling pathways govern cell fate specification along the major embryonic axes in metazoans.One of the main advantages of this methodology is it can be used to efficiently characterize the signaling pathways and the gene regulatory networks that they activate in an in vivo developmental context.Demonstrating this procedure will be Marina Martinez-Bartolom

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

7.8K Views.  Mississippi State University. The overall goal of these experiments is to illustrate the advantages that simple organisms offer in the study of complex interactions among gene regulatory networks that direct developmental processes.This methodology can help answer key questions in evolutionary and developmental biology, such as how signaling pathways govern cell fate specification along the major embryonic axes in metazoans.One of the main advantages of this methodology is it can be used to efficiently characterize the si...

Video: The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...