تمويل جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1AI015503. قدمت الفئران المصابة المنشقات البلهارسيا نييد مركز الموارد في معهد البحوث الطبية الحيوية (روكفيل، دكتوراه في الطب) من خلال المعاهد الوطنية للصحة-نييد HHSN272201000005I العقد للتوزيع من خلال "موارد الشركة".

موافقة جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة ويسكونسن-ماديسون تحت البروتوكول لا. V005717. البروتوكول التالي ينطوي على العمل في منشأة للسلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) لمسببات الأمراض البشرية، على الرغم من أن أيا من مراحل المنشقات المبينة في هذا البروتوكول معدية للبشر أو لغيرها من الثدييات. اتبع سياسات مؤسسية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية خطر المجموعة 2 (RG2).
ملاحظة: نستخدم الإناث الفئران السويسرية وبستر (6-أسبوع من العمر) بسبب تعرضها أعلى إلى10من العدوى، وبالتالي تحقق أكبر بيضة أعباء. وتصف تاكر et al. الماوس والقواقع العدوى البروتوكولات المستخدمة في هذا النظام النموذجي11. يسرد الجدول للمواد جميع معدات محددة ومواد، الكواشف والمصادر الحيوانية اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول التجريبي.
1-تجهيز الكبد المصابة
<ol><li>Euthanize الفئران، 6-7 أسابيع بعد الإصابة، بالاختناق2 CO (معدل 10-30% حجم الدائرة في الدقيقة الواحدة). مراقبة الفئران لوقف التنفس وضربات القلب. ملاحظة: عادة ما يصل إلى 20 من الفئران قد تتم معالجة في وقت معين.</li>
	<li>بعد نقل euthanized الفئران للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، ضع الماوس على ظهورهم والرش على الأسطح البطني مع الإيثانول 70%. واسمحوا نقع لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>قرصه وسحب الجلد أسفل البطن وقطع عبر القاعدة الجلد انتزعت الأقرب إلى البطن مع مقص جراحي معقم. سحب قطع الجلد الأسفل (أي نحو الرأس) للكشف عن الكبد. ملاحظة أن الكبد ينبغي توسيعه ومنقط بسبب استجابة حبيبية المستحثة بالبيض (الشكل 2A).</li>
	<li>إزالة الكبد ووضعه في كوب يحتوي على 200 مل من معقم 1.2% كلوريد الصوديوم الحل الذي يتضمن القلم/بكتيريا.</li>
	<li>كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 مع الفئران المتبقية. ملاحظة: عادة ما يتم معالجة الفئران العشرين في محصول واحد.</li>
	<li>وضع الكبد في طبق بتري معقم وإزالة الأنسجة الضامة الدهون/غير الكبد مع الملقط العقيمة.</li>
	<li>نقل كبد قلص/تنظيف زجاجة معقمة للطرد مركزي 250 مل تحتوي على ~ 200 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% العقيمة مع القلم/بكتيريا.</li>
	<li>قوة يهز زجاجة تحتوي على الكبد، واستخدام ماصة المتاح عقيمة، إزالة السطح الزائد رغوة/تعويم الحطام. ببطء من أجل إيقاف المحلول الملحي المتبقي في حاوية أو بالوعة تحتوي على 1% التبييض (مطهر).</li>
	<li>إضافة ~ 200 مل المحلول الملحي الطازجة للكبد، وكرر الخطوة 1.8 ثلاث مرات أكثر.</li>
</ol>2-الكبد العزلة الاستخراج وميراسيديال
<ol><li>وضع الكبد في كأس خلاط الفولاذ المقاوم للصدأ عقيمة صغيرة وإضافة ~ 2 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% (الشكل 2).</li>
	<li>تغطية الكأس بإحباط وطبق بيتري لمنع الانسكابات، ومزج لمدة 1 دقيقة بالتناوب منخفضة وعالية السرعة (20 s منخفضة السرعة/10 ق عالية السرعة؛ وتكرار) (الشكل 2).</li>
	<li>توزيع بالتساوي بتعليق الكبد المخلوطة في زجاجات معقمة 250 مل أجهزة الطرد المركزي (لاستخدام كبد 20 4 زجاجات).</li>
	<li>إضافة المحلول الملحي المعقم بالمضادات الحيوية إلى حجم إجمالي ~ 200 مل/الزجاجة. وزن/التوازن الزجاجات قبل الطرد المركزي.</li>
	<li>كبد المخلوطة في ز 290 x لمدة 15 دقيقة في 4 س"جيم بلطف" صب قبالة سوبيرناتانتس في حاوية مع التبييض قبل التخلص من أجهزة الطرد المركزي.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.4-2.5 مرة. يجب التأكد من دقة ريسوسبيند الكبد الرسوبيات قبل الطرد المركزي.</li>
	<li>بعد التخلص من المياه المالحة الماضي يغسل (2.6 خطوة)، بإضافة 200 مل مياه الأحواض العقيمة مع القلم/بكتيريا نسيج الكبد الأعلاف، اهتز ريسوسبيند الرواسب، ونقل التعليق لتعقيم قارورة حجمي 1-L التي قد تم تغطيتها بشكل كامل مع الألومنيوم إحباط، باستثناء الجزء العلوي 3 سم الرقبة (الشكل 2D). ملاحظة: استخدام زجاجتين (= كبد 10) كل قارورة 1-L. مياه الأحواض يحاكي بيئة المياه العذبة الطبيعية اللازمة لحفز ميراسيديال الفقس من البيض.</li>
	<li>استخدام مياه الأحواض العقيمة، تملأ قارورة إلى حوالي 3 سم فوق إحباط تغطي على الرقبة. ثم، دون تأخير (كما ميراسيديا تبدأ قريبا التظليل) وإزالة الرغاوي المتبقية وأنسجة الكبد تطفو على السطح قبل بيبيتينج بسرعة حتى مل ~ 12 من أحواض المياه التي تحتوي على الحطام وتجاهل ذلك إلى منفصل تجاهل الأنبوبة. استبدال المياه العذبة الأحواض العقيمة.</li>
	<li>كرر التنظيف الخطوة 2.8، ثلاث مرات، والتحقق من وجود ميراسيديا في الأنبوب المرتجع. الكف عن تكرار التنظيف الخطوة إذا ميراسيديا تظهر في الحل الغسيل.</li>
	<li>بعد الغسيل الأخير، إضافة ببطء ~ 12 مل مياه الدافئة البركة العقيمة (قبل ارتفعت درجة حرارة 30 سج) لإنشاء تدرج درجة الحرارة مع الماء الدافئ نظيفة ومعقمة في الأعلى. ملاحظة: هذا هو إنجاز أفضل بتصريف المياه على طول الجانب من الرقبة قارورة لتجنب الاختلاط ببطء.</li>
	<li>ضع غطاء صحن بتري صغير على فتح قارورة وتسليط ضوء الساطع عبر الجزء العلوي من قارورة أعلاه غلاف إحباط لإلقاء الضوء على السطح العلوي للمياه. ملاحظة: عادة، خلال 5-10 دقيقة، السباحة ميراسيديا، تنجذب إلى الضوء، وسوف تركز بإعداد كبيرة داخل سم 2-3 أول من الأحواض المائية (الشكل 3A).</li>
</ol>3. زراعة وحصاد ميراسيديال
<ol><li>عندما جمعوا ميراسيديا في السطح بعد 10 دقائق، باستخدام بيبيت نقل عقيمة، إزالة ~ 8 مل من الأحواض المائية ونقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل عقيمة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على ميراسيديا على الجليد.</li>
	<li>إضافة مل 8 مرة أخرى من المياه الدافئة البركة العقيمة على طول داخل دورق حجمي وانتظر 10 دقائق أخرى.</li>
	<li>استخدام أنابيب جديدة كل مرة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 ثلاث مرات أكثر. بعد جمعال 4، إبقاء الأنبوب النهائي على الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح ميراسيديا تسوية. وتضم هذه المجموعة من أنابيب الحصاد الأول.</li>
	<li>أنابيب الطرد المركزي الذي يحتوي على ميراسيديا في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سج في مبردة قبل تبريد أجهزة الطرد مركزي.</li>
	<li>على الفور إزالة معظم المادة طافية (~ 7 مل) مع الحرص على عدم تعكير بيليه الطفيلي (الشكل 3B).</li>
	<li>تجمع جميع ميراسيديا من هذا المحصول الأول في أحد أنبوب، ثم شطف جميع الأنابيب الأصلي مع ~ 1 مل ماء البركة العقيمة، وإضافة إلى الأنبوب "المجمعة".</li>
	<li>السماح للطفيليات ليستقر على الجليد ل ~ 5 دقيقة، ومرة أخرى الطرد المركزي الطفيليات في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سجيم</li>
	<li>بعناية إزالة المادة طافية وإضافة Chernin العقيمة في 6-8 مل متوازنة الحل الملح (مجلس دول بحر البلطيق +؛ انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على القلم/بكتيريا.</li>
	<li>بلطف بتعليق ميراسيديا وقاسمه لهم في لوحة ثقافة 24-جيدا (1 مل كل بئر)، تليها الشطف الأنبوب في 6-8 مل مجلس دول بحر البلطيق + وإضافة 1 مل شطف لكل بئر. احتضان الطفيليات في 26 سج تحت ظروف نورموكسيك. تركيزات ميراسيديا معزولة سوف تختلف، ولكن سيتم عادة المتوسط ~ 7000 مليلتر.</li>
	<li>إذا كانت لا تزال هي تركيز الطفيليات في مصدر الضوء، كرر الخطوات 3.1 إلى 3.9 لمواصلة الحصاد أواخر الفقس ميراسيديا لكن زيادة الفاصل الزمني بين المجموعات إلى 15-20 دقيقة. ملاحظة: تمثل هذه المجموعة الجديدة من أنابيب الحصاد الثاني. ومع ذلك، نظراً لأن الأرقام ميراسيديال عادة منخفضة، اليرقات من جميع الأنابيب عادة مجمعة في ثقافة واحدة تتضمن أيضا 2 مل مجلس دول بحر البلطيق +.</li>
	<li>في 24 ساعة بعد الحصاد، وزراعة، ريسوسبيند بلطف سبوروسيستس في آبارهم التي بيبيتينج.</li>
	<li>انتظر بضع دقيقة للسماح للطفيليات لتسوية إلى الجزء السفلي من الآبار. بمجرد أنهم استقروا بعناية إزالة المادة طافية (مل ~1.5)، التي سوف تحتوي على معظم لوحات البشرة عضو يلقي بها ميراسيديا خلال التحول اليرقات. أن تجاهل هذا "التحول" طافية أو إدماج دراسات المتابعة للمنتجات الافرازية اليرقات.</li>
	<li>إضافة 1.5 مل من جديد مجلس دول بحر البلطيق + لكل بئر وماصة ريسوسبيند سبوروسيستس برفق. كرر الخطوة 3، 12 إذا كان المطلوب هو زيادة الغسيل أو تغييرها إلى وسيلة مختلفة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+schistosomiasis.">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+worldwide+in+2013.">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li><li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Th&#233;ron, A., Jamieson, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+sporocysts.">Schistosoma sporocysts.</a> Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).</li><li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+(trematode)+Schistosoma+mansoni:+a+2009+assessment.">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li><li>Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+Biomphalaria-trematode+interactions.">Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions.</a> Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).</li><li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites:+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade.">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li><li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival.">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li><li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+schistosome+dermatitis.+IX.+The+life+cycles+of+three+dermatitis-producing+schistosomes+from+birds+and+a+discussion+of+the+subfamily+Bilharziellinae+(Trematoda:+Schistosomatidae).">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li><li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts.">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li><li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+mortality,+pathophysiology,+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice.">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li><li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li><li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni:+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation.">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li><li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni:+their+occurrence+and+cultivation.">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li><li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata.">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li><li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts.">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li><li>Hansen, E. L., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+line+from+embryos+of+Biomphalaria+glabrata+(Pulmonata):+Establishment+and+characteristics.">A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics.</a> Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).</li><li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li><li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni.">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li><li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscan+cells+in+culture:+primary+cell+cultures+and+cell+lines.">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li><li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flukes+without+snails:+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes.">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li><li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules.">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae.">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li></ol>

ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلف.

ميراسيديا س. المنسونيه، معزولة والتلاعب بها كما هو موضح هنا، يمكن أن تصيب فقط المضيف القواقع الوسيطة، ولذلك لا تمثل الإخطار البيولوجية بشرية خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات. بيد لتجنب التعرض العرضي/العدوى من القواقع، ينبغي الحرص أداء العزلة ميراسيديال في موقع آخر من المجالات ال?...

الإنسان الدم المثقوبة بلهارسيه spp.، وهي العوامل المسببة لمرض البلهارسيا، أمراض استوائية مهملة التي يعاني منها على 230 مليون شخص في العالم ما يقدر1. الأنواع الأكثر انتشارا، المنسونيه بلهارسيه، تتوزع جغرافيا في أمريكا الجنوبية والأرخبيل منطقة البحر الكاريبي، والشرق الأوسط و أفريقيا الصحراء2. دورة حياة س. المنسونيه، والأخرى المنشقات، معقد، والتي تنطوي على مضيف نهائي الثدييات والقواقع المياه العذبة من جنس كان بمثابة تلزم الوسيطة المضيفين.
دودة البالغين الذكور والإناث المنسونيه س. أزواج يعيشون في عروق المساريقي العلوي الخلفي تتكاثر الثدييات المضيفة، أسفر عن إطلاق سراح امبريوناتيد البيض (البويضات) التي أصبحت استقرت في الأوردة الصغيرة في الغشاء المخاطي المعوي. البيض ثم فواصل من خلال جدران الأوعية، تهاجر من خلال الأنسجة المخاطية، وأدخل في نهاية المطاف التجويف المعوي حيث أنها هي باطلة مع البراز. عند إدخال البويضات هاتش المياه العذبة وتخترق اليرقات (ميراسيديا)، يجب، في وقت قصير، وجدوا حلزون كان مناسبة لتصيب من أجل مواصلة دورة الحياة. تتضمن هذه العملية الإصابة مرفق ميراسيديال إلى سطح الجسم الخارجي في الحلزون متبوعاً باختراق النشطة ودخول اليرقة إلى المضيف. فور دخول، يبدأ ميراسيديوم إلقاء لوحات البشرة عضو الخارجي حيث أنه يشكل سينسيتيوم التي ستصبح على السطح الخارجي الجديد (لحافة) للمرحلة القادمة اليرقات سبوروسيست الأولية أو الأم. من خلال اللاجنسي، تنتج كل سبوروسيست الأولية والنشرات جيل ثان من سبوروسيستس، ووصف الثانوية أو ابنه سبوروسيستس، التي تخلق بدورها، والإفراج عن إعداد كبيرة من المرحلة النهائية إينترامولوسكان، المذنبات3 . الهروب من البلد المضيف الحلزون، سيركاريا تخترق عند قادر على إرفاق ومباشرة اختراق الجلد من مضيف الثدييات مناسبة البشرية أو غيرها. عند دخول المضيفة الجديدة، سيركاريا تحويل إلى مرحلة شيستوسومولا الطفيلية وغزو نظام الأوعية الدموية. ، بدوره، تهاجر إلى الرئة ومن ثم إلى الوريد الكبدي حيث تنضج الديدان الكبار وشكل أزواج من الذكور والإناث والسفر إلى الأوردة المساريقي العلوي لإكمال دورة حياتها.
إينترامولوسكان بنجاح أو تطوير "المرحلة الحلزون" المنشقات اليرقات ضروري لاستمرار دورة للبشرية مضيف إلى مضيف الإرسال. أهمية حاسمة هو دخول ميراسيديوم تخترق إلى المضيف الحلزون وتحولها المبكر للمرحلة الابتدائية سبوروسيست الفترة التالية. اعتماداً على توافق الفسيولوجية والمناعية بين المضيف والطفيلي، فمن خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات أن النجاح الأولى أو عدم إثبات الإصابات هو العزم4،5،6 . التطور اللاحق للابتدائي سبوروسيستس قادرة على إنتاج بلا تزاوج سبوروسيستس الثانوية، ثم تولد سيركاريا الإنسان المعدية، كذلك تتطلب بيئة متساهلة مضيف فسيولوجية التي توفر لكل من النمو الطفيلي و يحتاج الإنجابية.
وحتى الآن، يعرف الكثير عن الأساسية الفسيولوجية، والكيمياء الحيوية والجزيئية عمليات مراقبة التفاعلات المنشقات-الحلزون، لا سيما الجزيئات ومسارات تشارك في تنظيم التنمية اليرقات والإنجاب، أو تحوير الاستجابات المناعية المضيف. سهولة الوصول إلى إعداد كبيرة من هذه المراحل اليرقات في ظروف في المختبر الثقافة التي تسمح بالتلاعب التجريبية سيسهل اكتشاف المسارات الإنمائية والآليات الأساسية لنمو الخلايا، التمايز والاستنساخ. المسارات الحرجة الطفيلي أو آليات، يتم تحديدها من خلال التجريب في المختبر ، ثم يمكن لعرقلة نمو اليرقات/الاستنساخ في المضيف الحلزون، أو لتحديد الحلزون المضيف المناعية الآليات المعنية بالاعتراف والقضاء على مراحل ميراسيديال أو سبوروسيست.
وفي هذه المادة وعرض الفيديو، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لطريقة لعزل عدد كبير من تخترق المنسونيه س. ميراسيديا لإدخال الثقافة في المختبر الذي ثم يمكن أن يتعرضوا للمتابعة التجريبية التلاعب (انظر الشكل 1 نظرة تخطيطي لسير عمل البروتوكول). على الرغم من أن إجراءات مماثلة قد وصفت سابقا7،،من89، شعرنا أن بروتوكول مفصلة ستكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في استخدام هذا النموذج لمعالجة ما زالت التساؤلات المتصلة ب التنمية اليرقات إينترامولوسكان وانتشار الهاتف الخلوي، والتفاعلات المناعية المنشقات-الحلزون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تكييف هذا النهج لعزل البيض من غيرها تريماتودا طبيا هامة مثل المثانة مسكن دموية سأو المثقوبة الكبد أو الرئة المثقوبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chernin&#39;s balanced salt solution (CBSS+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 g sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 g of potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>sugars in 800 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Dissolve calcium chloride separately in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td>mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.53 g calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4160</td>
			<td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 g sodium bicarbonate&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>with constant mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g glucose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>152527</td>
			<td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td>0.22 &#181;m disposable bottle-top filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&#160; 
			prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Bge&#160; medium (Ibge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 900 mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>220 mL Schneider&#8217;s Drosophila medium modified</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-351Q</td>
			<td>Mix Schneider&#39;s medium with 680 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9010</td>
			<td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 g galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &#181;m 
			pre-sterilized disposable bottle-top filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Bge medium (cBge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 mL of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mL Incomplete Bge medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td>waterbath at 60&#176;C for 1 hr while gently&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>swirling the bottle every 10 min 
			Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&#160; 
			and store at -20&#176;C.&#160; Mix medium + FBS and 
			filter sterilize using a 0.22 &#181;m pre-sterilized&#160; 
			disposable bottle-top filter&#160; 
			Add penicillin and streptomycin prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond water (stock solution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1L of stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.5 g calcium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C64-500</td>
			<td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25 g magnesium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M27-500</td>
			<td>Note that the salts will not have completely&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25 g&#160; sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>dissolved.&#160; Shake vigorously to suspend&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 g&#160; potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>salts prior to making the working soln&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond water (working solution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix stock to ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1500 mL of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&#160;cycle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add penicillin and streptomycin prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (1.2% NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Autoclave saline solution to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add penicillin and streptomycin prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional equipment and material:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-L mouse euthanizing chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank and regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pathogen-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-L volumetric flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source (150W)</td>
			<td>Chiu Tech Corp</td>
			<td>Model F0-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles (250 mL)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable transfer pipets&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blender</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>Model 51BL31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender cup, 100 mL capacity</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Nikon Instruments&#160;</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

وقد المثقوبة الدم البشري، بلهارسيه spp.، لها دورة حياة معقدة تشمل المراحل الإنمائية اللاجنسي والجنسي داخل القواقع الوسيطة والثدييات مضيف نهائي، على التوالي. القدرة على عزل والمحافظة عليها في مراحل مختلفة من دورة الحياة تحت ظروف الثقافة في المختبر سهلت إلى حد كبير تحقيقات الآليات الخلوية والكيمياء الحيوية والجزيئية التي تنظم النمو الطفيلي، والتنمية والمضيف التفاعلات. ويتطلب انتقال البلهارسيا اللاجنسي والتنمية متعددة المراحل اليرقات داخل البلد المضيف الحلزون؛ من ميراسيديوم المعدية، من خلال سبوروسيستس الأولية والثانوية، إلى المرحلة النهائية السباحين الذي يتم المعدية للبشر. في هذه الورقة نقدم بروتوكول خطوة بخطوة الفقس الجماعي وعزل بلهارسيه المنسونيه ميراسيديا من البيض التي تم الحصول عليها من كبد الفئران المصابة، وإدخالها لاحقاً إلى الثقافة في المختبر . ومن المتوقع أن البروتوكول مفصلاً ستشجع الباحثين جديدة للانخراط في وتوسيع هذا المجال الهام من بحوث البلهارسيا.

الغالبية العظمى من ميراسيديا عادة سوف قد جمعت في الأولين "الحصاد". حضانة ميراسيديا معزولة في مجلس دول بحر البلطيق + مشغلات عملية التحول ميراسيديوم إلى سبوروسيست (الشكل 4 أ-ج). خلال الساعة الأولى الآبار التالية نقل إلى الثقافة التي تحتوي على + مجلس د...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

توضح هذه المقالة بروتوكول لعزله أكسينيك على نطاق واسع وجمع من ميراسيديا تخترق من حظ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه وتجهيزها اللاحقة لإدخال الثقافة في المختبر .

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K Views.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. توضح هذه المقالة بروتوكول لعزله أكسينيك على نطاق واسع وجمع من ميراسيديا تخترق من حظ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه وتجهيزها اللاحقة لإدخال الثقافة في المختبر .

Video: Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

عزل الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية وزراعتها على المسامية مصفوفة العظام

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...