تمويل جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1AI015503. قدمت الفئران المصابة المنشقات البلهارسيا نييد مركز الموارد في معهد البحوث الطبية الحيوية (روكفيل، دكتوراه في الطب) من خلال المعاهد الوطنية للصحة-نييد HHSN272201000005I العقد للتوزيع من خلال "موارد الشركة".

موافقة جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة ويسكونسن-ماديسون تحت البروتوكول لا. V005717. البروتوكول التالي ينطوي على العمل في منشأة للسلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) لمسببات الأمراض البشرية، على الرغم من أن أيا من مراحل المنشقات المبينة في هذا البروتوكول معدية للبشر أو لغيرها من الثدييات. اتبع سياسات مؤسسية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية خطر المجموعة 2 (RG2).
ملاحظة: نستخدم الإناث الفئران السويسرية وبستر (6-أسبوع من العمر) بسبب تعرضها أعلى إلى10من العدوى، وبالتالي تحقق أكبر بيضة أعباء. وتصف تاكر et al. الماوس والقواقع العدوى البروتوكولات المستخدمة في هذا النظام النموذجي11. يسرد الجدول للمواد جميع معدات محددة ومواد، الكواشف والمصادر الحيوانية اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول التجريبي.
1-تجهيز الكبد المصابة
<ol><li>Euthanize الفئران، 6-7 أسابيع بعد الإصابة، بالاختناق2 CO (معدل 10-30% حجم الدائرة في الدقيقة الواحدة). مراقبة الفئران لوقف التنفس وضربات القلب. ملاحظة: عادة ما يصل إلى 20 من الفئران قد تتم معالجة في وقت معين.</li>
	<li>بعد نقل euthanized الفئران للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، ضع الماوس على ظهورهم والرش على الأسطح البطني مع الإيثانول 70%. واسمحوا نقع لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>قرصه وسحب الجلد أسفل البطن وقطع عبر القاعدة الجلد انتزعت الأقرب إلى البطن مع مقص جراحي معقم. سحب قطع الجلد الأسفل (أي نحو الرأس) للكشف عن الكبد. ملاحظة أن الكبد ينبغي توسيعه ومنقط بسبب استجابة حبيبية المستحثة بالبيض (الشكل 2A).</li>
	<li>إزالة الكبد ووضعه في كوب يحتوي على 200 مل من معقم 1.2% كلوريد الصوديوم الحل الذي يتضمن القلم/بكتيريا.</li>
	<li>كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 مع الفئران المتبقية. ملاحظة: عادة ما يتم معالجة الفئران العشرين في محصول واحد.</li>
	<li>وضع الكبد في طبق بتري معقم وإزالة الأنسجة الضامة الدهون/غير الكبد مع الملقط العقيمة.</li>
	<li>نقل كبد قلص/تنظيف زجاجة معقمة للطرد مركزي 250 مل تحتوي على ~ 200 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% العقيمة مع القلم/بكتيريا.</li>
	<li>قوة يهز زجاجة تحتوي على الكبد، واستخدام ماصة المتاح عقيمة، إزالة السطح الزائد رغوة/تعويم الحطام. ببطء من أجل إيقاف المحلول الملحي المتبقي في حاوية أو بالوعة تحتوي على 1% التبييض (مطهر).</li>
	<li>إضافة ~ 200 مل المحلول الملحي الطازجة للكبد، وكرر الخطوة 1.8 ثلاث مرات أكثر.</li>
</ol>2-الكبد العزلة الاستخراج وميراسيديال
<ol><li>وضع الكبد في كأس خلاط الفولاذ المقاوم للصدأ عقيمة صغيرة وإضافة ~ 2 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% (الشكل 2).</li>
	<li>تغطية الكأس بإحباط وطبق بيتري لمنع الانسكابات، ومزج لمدة 1 دقيقة بالتناوب منخفضة وعالية السرعة (20 s منخفضة السرعة/10 ق عالية السرعة؛ وتكرار) (الشكل 2).</li>
	<li>توزيع بالتساوي بتعليق الكبد المخلوطة في زجاجات معقمة 250 مل أجهزة الطرد المركزي (لاستخدام كبد 20 4 زجاجات).</li>
	<li>إضافة المحلول الملحي المعقم بالمضادات الحيوية إلى حجم إجمالي ~ 200 مل/الزجاجة. وزن/التوازن الزجاجات قبل الطرد المركزي.</li>
	<li>كبد المخلوطة في ز 290 x لمدة 15 دقيقة في 4 س"جيم بلطف" صب قبالة سوبيرناتانتس في حاوية مع التبييض قبل التخلص من أجهزة الطرد المركزي.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.4-2.5 مرة. يجب التأكد من دقة ريسوسبيند الكبد الرسوبيات قبل الطرد المركزي.</li>
	<li>بعد التخلص من المياه المالحة الماضي يغسل (2.6 خطوة)، بإضافة 200 مل مياه الأحواض العقيمة مع القلم/بكتيريا نسيج الكبد الأعلاف، اهتز ريسوسبيند الرواسب، ونقل التعليق لتعقيم قارورة حجمي 1-L التي قد تم تغطيتها بشكل كامل مع الألومنيوم إحباط، باستثناء الجزء العلوي 3 سم الرقبة (الشكل 2D). ملاحظة: استخدام زجاجتين (= كبد 10) كل قارورة 1-L. مياه الأحواض يحاكي بيئة المياه العذبة الطبيعية اللازمة لحفز ميراسيديال الفقس من البيض.</li>
	<li>استخدام مياه الأحواض العقيمة، تملأ قارورة إلى حوالي 3 سم فوق إحباط تغطي على الرقبة. ثم، دون تأخير (كما ميراسيديا تبدأ قريبا التظليل) وإزالة الرغاوي المتبقية وأنسجة الكبد تطفو على السطح قبل بيبيتينج بسرعة حتى مل ~ 12 من أحواض المياه التي تحتوي على الحطام وتجاهل ذلك إلى منفصل تجاهل الأنبوبة. استبدال المياه العذبة الأحواض العقيمة.</li>
	<li>كرر التنظيف الخطوة 2.8، ثلاث مرات، والتحقق من وجود ميراسيديا في الأنبوب المرتجع. الكف عن تكرار التنظيف الخطوة إذا ميراسيديا تظهر في الحل الغسيل.</li>
	<li>بعد الغسيل الأخير، إضافة ببطء ~ 12 مل مياه الدافئة البركة العقيمة (قبل ارتفعت درجة حرارة 30 سج) لإنشاء تدرج درجة الحرارة مع الماء الدافئ نظيفة ومعقمة في الأعلى. ملاحظة: هذا هو إنجاز أفضل بتصريف المياه على طول الجانب من الرقبة قارورة لتجنب الاختلاط ببطء.</li>
	<li>ضع غطاء صحن بتري صغير على فتح قارورة وتسليط ضوء الساطع عبر الجزء العلوي من قارورة أعلاه غلاف إحباط لإلقاء الضوء على السطح العلوي للمياه. ملاحظة: عادة، خلال 5-10 دقيقة، السباحة ميراسيديا، تنجذب إلى الضوء، وسوف تركز بإعداد كبيرة داخل سم 2-3 أول من الأحواض المائية (الشكل 3A).</li>
</ol>3. زراعة وحصاد ميراسيديال
<ol><li>عندما جمعوا ميراسيديا في السطح بعد 10 دقائق، باستخدام بيبيت نقل عقيمة، إزالة ~ 8 مل من الأحواض المائية ونقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل عقيمة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على ميراسيديا على الجليد.</li>
	<li>إضافة مل 8 مرة أخرى من المياه الدافئة البركة العقيمة على طول داخل دورق حجمي وانتظر 10 دقائق أخرى.</li>
	<li>استخدام أنابيب جديدة كل مرة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 ثلاث مرات أكثر. بعد جمعال 4، إبقاء الأنبوب النهائي على الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح ميراسيديا تسوية. وتضم هذه المجموعة من أنابيب الحصاد الأول.</li>
	<li>أنابيب الطرد المركزي الذي يحتوي على ميراسيديا في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سج في مبردة قبل تبريد أجهزة الطرد مركزي.</li>
	<li>على الفور إزالة معظم المادة طافية (~ 7 مل) مع الحرص على عدم تعكير بيليه الطفيلي (الشكل 3B).</li>
	<li>تجمع جميع ميراسيديا من هذا المحصول الأول في أحد أنبوب، ثم شطف جميع الأنابيب الأصلي مع ~ 1 مل ماء البركة العقيمة، وإضافة إلى الأنبوب "المجمعة".</li>
	<li>السماح للطفيليات ليستقر على الجليد ل ~ 5 دقيقة، ومرة أخرى الطرد المركزي الطفيليات في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سجيم</li>
	<li>بعناية إزالة المادة طافية وإضافة Chernin العقيمة في 6-8 مل متوازنة الحل الملح (مجلس دول بحر البلطيق +؛ انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على القلم/بكتيريا.</li>
	<li>بلطف بتعليق ميراسيديا وقاسمه لهم في لوحة ثقافة 24-جيدا (1 مل كل بئر)، تليها الشطف الأنبوب في 6-8 مل مجلس دول بحر البلطيق + وإضافة 1 مل شطف لكل بئر. احتضان الطفيليات في 26 سج تحت ظروف نورموكسيك. تركيزات ميراسيديا معزولة سوف تختلف، ولكن سيتم عادة المتوسط ~ 7000 مليلتر.</li>
	<li>إذا كانت لا تزال هي تركيز الطفيليات في مصدر الضوء، كرر الخطوات 3.1 إلى 3.9 لمواصلة الحصاد أواخر الفقس ميراسيديا لكن زيادة الفاصل الزمني بين المجموعات إلى 15-20 دقيقة. ملاحظة: تمثل هذه المجموعة الجديدة من أنابيب الحصاد الثاني. ومع ذلك، نظراً لأن الأرقام ميراسيديال عادة منخفضة، اليرقات من جميع الأنابيب عادة مجمعة في ثقافة واحدة تتضمن أيضا 2 مل مجلس دول بحر البلطيق +.</li>
	<li>في 24 ساعة بعد الحصاد، وزراعة، ريسوسبيند بلطف سبوروسيستس في آبارهم التي بيبيتينج.</li>
	<li>انتظر بضع دقيقة للسماح للطفيليات لتسوية إلى الجزء السفلي من الآبار. بمجرد أنهم استقروا بعناية إزالة المادة طافية (مل ~1.5)، التي سوف تحتوي على معظم لوحات البشرة عضو يلقي بها ميراسيديا خلال التحول اليرقات. أن تجاهل هذا "التحول" طافية أو إدماج دراسات المتابعة للمنتجات الافرازية اليرقات.</li>
	<li>إضافة 1.5 مل من جديد مجلس دول بحر البلطيق + لكل بئر وماصة ريسوسبيند سبوروسيستس برفق. كرر الخطوة 3، 12 إذا كان المطلوب هو زيادة الغسيل أو تغييرها إلى وسيلة مختلفة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+schistosomiasis.">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+worldwide+in+2013.">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li><li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Th&#233;ron, A., Jamieson, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+sporocysts.">Schistosoma sporocysts.</a> Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).</li><li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+(trematode)+Schistosoma+mansoni:+a+2009+assessment.">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li><li>Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+Biomphalaria-trematode+interactions.">Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions.</a> Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).</li><li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites:+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade.">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li><li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival.">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li><li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+schistosome+dermatitis.+IX.+The+life+cycles+of+three+dermatitis-producing+schistosomes+from+birds+and+a+discussion+of+the+subfamily+Bilharziellinae+(Trematoda:+Schistosomatidae).">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li><li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts.">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li><li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+mortality,+pathophysiology,+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice.">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li><li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li><li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni:+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation.">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li><li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni:+their+occurrence+and+cultivation.">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li><li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata.">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li><li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts.">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li><li>Hansen, E. L., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+line+from+embryos+of+Biomphalaria+glabrata+(Pulmonata):+Establishment+and+characteristics.">A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics.</a> Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).</li><li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li><li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni.">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li><li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscan+cells+in+culture:+primary+cell+cultures+and+cell+lines.">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li><li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flukes+without+snails:+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes.">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li><li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules.">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae.">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li></ol>

ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلف.

ميراسيديا س. المنسونيه، معزولة والتلاعب بها كما هو موضح هنا، يمكن أن تصيب فقط المضيف القواقع الوسيطة، ولذلك لا تمثل الإخطار البيولوجية بشرية خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات. بيد لتجنب التعرض العرضي/العدوى من القواقع، ينبغي الحرص أداء العزلة ميراسيديال في موقع آخر من المجالات ال?...

الإنسان الدم المثقوبة بلهارسيه spp.، وهي العوامل المسببة لمرض البلهارسيا، أمراض استوائية مهملة التي يعاني منها على 230 مليون شخص في العالم ما يقدر1. الأنواع الأكثر انتشارا، المنسونيه بلهارسيه، تتوزع جغرافيا في أمريكا الجنوبية والأرخبيل منطقة البحر الكاريبي، والشرق الأوسط و أفريقيا الصحراء2. دورة حياة س. المنسونيه، والأخرى المنشقات، معقد، والتي تنطوي على مضيف نهائي الثدييات والقواقع المياه العذبة من جنس كان بمثابة تلزم الوسيطة المضيفين.
دودة البالغين الذكور والإناث المنسونيه س. أزواج يعيشون في عروق المساريقي العلوي الخلفي تتكاثر الثدييات المضيفة، أسفر عن إطلاق سراح امبريوناتيد البيض (البويضات) التي أصبحت استقرت في الأوردة الصغيرة في الغشاء المخاطي المعوي. البيض ثم فواصل من خلال جدران الأوعية، تهاجر من خلال الأنسجة المخاطية، وأدخل في نهاية المطاف التجويف المعوي حيث أنها هي باطلة مع البراز. عند إدخال البويضات هاتش المياه العذبة وتخترق اليرقات (ميراسيديا)، يجب، في وقت قصير، وجدوا حلزون كان مناسبة لتصيب من أجل مواصلة دورة الحياة. تتضمن هذه العملية الإصابة مرفق ميراسيديال إلى سطح الجسم الخارجي في الحلزون متبوعاً باختراق النشطة ودخول اليرقة إلى المضيف. فور دخول، يبدأ ميراسيديوم إلقاء لوحات البشرة عضو الخارجي حيث أنه يشكل سينسيتيوم التي ستصبح على السطح الخارجي الجديد (لحافة) للمرحلة القادمة اليرقات سبوروسيست الأولية أو الأم. من خلال اللاجنسي، تنتج كل سبوروسيست الأولية والنشرات جيل ثان من سبوروسيستس، ووصف الثانوية أو ابنه سبوروسيستس، التي تخلق بدورها، والإفراج عن إعداد كبيرة من المرحلة النهائية إينترامولوسكان، المذنبات3 . الهروب من البلد المضيف الحلزون، سيركاريا تخترق عند قادر على إرفاق ومباشرة اختراق الجلد من مضيف الثدييات مناسبة البشرية أو غيرها. عند دخول المضيفة الجديدة، سيركاريا تحويل إلى مرحلة شيستوسومولا الطفيلية وغزو نظام الأوعية الدموية. ، بدوره، تهاجر إلى الرئة ومن ثم إلى الوريد الكبدي حيث تنضج الديدان الكبار وشكل أزواج من الذكور والإناث والسفر إلى الأوردة المساريقي العلوي لإكمال دورة حياتها.
إينترامولوسكان بنجاح أو تطوير "المرحلة الحلزون" المنشقات اليرقات ضروري لاستمرار دورة للبشرية مضيف إلى مضيف الإرسال. أهمية حاسمة هو دخول ميراسيديوم تخترق إلى المضيف الحلزون وتحولها المبكر للمرحلة الابتدائية سبوروسيست الفترة التالية. اعتماداً على توافق الفسيولوجية والمناعية بين المضيف والطفيلي، فمن خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات أن النجاح الأولى أو عدم إثبات الإصابات هو العزم4،5،6 . التطور اللاحق للابتدائي سبوروسيستس قادرة على إنتاج بلا تزاوج سبوروسيستس الثانوية، ثم تولد سيركاريا الإنسان المعدية، كذلك تتطلب بيئة متساهلة مضيف فسيولوجية التي توفر لكل من النمو الطفيلي و يحتاج الإنجابية.
وحتى الآن، يعرف الكثير عن الأساسية الفسيولوجية، والكيمياء الحيوية والجزيئية عمليات مراقبة التفاعلات المنشقات-الحلزون، لا سيما الجزيئات ومسارات تشارك في تنظيم التنمية اليرقات والإنجاب، أو تحوير الاستجابات المناعية المضيف. سهولة الوصول إلى إعداد كبيرة من هذه المراحل اليرقات في ظروف في المختبر الثقافة التي تسمح بالتلاعب التجريبية سيسهل اكتشاف المسارات الإنمائية والآليات الأساسية لنمو الخلايا، التمايز والاستنساخ. المسارات الحرجة الطفيلي أو آليات، يتم تحديدها من خلال التجريب في المختبر ، ثم يمكن لعرقلة نمو اليرقات/الاستنساخ في المضيف الحلزون، أو لتحديد الحلزون المضيف المناعية الآليات المعنية بالاعتراف والقضاء على مراحل ميراسيديال أو سبوروسيست.
وفي هذه المادة وعرض الفيديو، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لطريقة لعزل عدد كبير من تخترق المنسونيه س. ميراسيديا لإدخال الثقافة في المختبر الذي ثم يمكن أن يتعرضوا للمتابعة التجريبية التلاعب (انظر الشكل 1 نظرة تخطيطي لسير عمل البروتوكول). على الرغم من أن إجراءات مماثلة قد وصفت سابقا7،،من89، شعرنا أن بروتوكول مفصلة ستكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في استخدام هذا النموذج لمعالجة ما زالت التساؤلات المتصلة ب التنمية اليرقات إينترامولوسكان وانتشار الهاتف الخلوي، والتفاعلات المناعية المنشقات-الحلزون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تكييف هذا النهج لعزل البيض من غيرها تريماتودا طبيا هامة مثل المثانة مسكن دموية سأو المثقوبة الكبد أو الرئة المثقوبة.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chernin&#039;s balanced salt solution (CBSS+)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 1L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>2.8 g sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.15 g of potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>sugars in 800 mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Dissolve calcium chloride separately in 200&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0.53 g calcium chloride dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 g sodium bicarbonate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>with constant mixing</td></tr><tr><td>1 g glucose</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 g trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0.22 &amp;micro;m disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&amp;nbsp;&lt;br/&gt; prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incomplete Bge&amp;nbsp; medium (Ibge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 900 mL solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>220 mL Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Mix Schneider&#039;s medium with 680 mL ddH2O</td></tr><tr><td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td></tr><tr><td>1.3 g galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m&lt;br/&gt; pre-sterilized disposable bottle-top filter</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Complete Bge medium (cBge)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;For 100 mL of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>90 mL Incomplete Bge medium</td><td></td><td></td><td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>waterbath at 60&amp;deg;C for 1 hr while gently&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>swirling the bottle every 10 min&lt;br/&gt; Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&amp;nbsp;&lt;br/&gt; and store at -20&amp;deg;C.&amp;nbsp; Mix medium + FBS and&lt;br/&gt; filter sterilize using a 0.22 &amp;micro;m pre-sterilized&amp;nbsp;&lt;br/&gt; disposable bottle-top filter&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Add penicillin and streptomycin prior to use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (stock solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1L of stock solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12.5 g calcium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td></tr><tr><td>1.25 g magnesium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Note that the salts will not have completely&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.25 g&amp;nbsp; sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>dissolved.&amp;nbsp; Shake vigorously to suspend&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25 g&amp;nbsp; potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>salts prior to making the working soln&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pond water (working solution)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix stock to ddH2O</td></tr><tr><td>1500 mL of ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&amp;nbsp;cycle)</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline solution (1.2% NaCl)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;1.5L of solution&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoclave saline solution to sterilize</td></tr><tr><td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Add penicillin and streptomycin prior use</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional equipment and material:&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L mouse euthanizing chamber</td><td></td><td></td><td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Taconic Biosciences</td><td></td><td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; tank and regulator</td><td></td><td></td><td>pathogen-free</td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-L volumetric flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light source (150W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (250 mL)</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Sterile disposable transfer pipets&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel blender</td><td>Waring Commercial</td><td>Model 51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Blender cup, 100 mL capacity</td><td>Waring Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Nikon Instruments&amp;nbsp;</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

وقد المثقوبة الدم البشري، بلهارسيه spp.، لها دورة حياة معقدة تشمل المراحل الإنمائية اللاجنسي والجنسي داخل القواقع الوسيطة والثدييات مضيف نهائي، على التوالي. القدرة على عزل والمحافظة عليها في مراحل مختلفة من دورة الحياة تحت ظروف الثقافة في المختبر سهلت إلى حد كبير تحقيقات الآليات الخلوية والكيمياء الحيوية والجزيئية التي تنظم النمو الطفيلي، والتنمية والمضيف التفاعلات. ويتطلب انتقال البلهارسيا اللاجنسي والتنمية متعددة المراحل اليرقات داخل البلد المضيف الحلزون؛ من ميراسيديوم المعدية، من خلال سبوروسيستس الأولية والثانوية، إلى المرحلة النهائية السباحين الذي يتم المعدية للبشر. في هذه الورقة نقدم بروتوكول خطوة بخطوة الفقس الجماعي وعزل بلهارسيه المنسونيه ميراسيديا من البيض التي تم الحصول عليها من كبد الفئران المصابة، وإدخالها لاحقاً إلى الثقافة في المختبر . ومن المتوقع أن البروتوكول مفصلاً ستشجع الباحثين جديدة للانخراط في وتوسيع هذا المجال الهام من بحوث البلهارسيا.

الغالبية العظمى من ميراسيديا عادة سوف قد جمعت في الأولين "الحصاد". حضانة ميراسيديا معزولة في مجلس دول بحر البلطيق + مشغلات عملية التحول ميراسيديوم إلى سبوروسيست (الشكل 4 أ-ج). خلال الساعة الأولى الآبار التالية نقل إلى الثقافة التي تحتوي على + مجلس د...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni at JoVE.com

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

توضح هذه المقالة بروتوكول لعزله أكسينيك على نطاق واسع وجمع من ميراسيديا تخترق من حظ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه وتجهيزها اللاحقة لإدخال الثقافة في المختبر .

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K Views.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. توضح هذه المقالة بروتوكول لعزله أكسينيك على نطاق واسع وجمع من ميراسيديا تخترق من حظ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه وتجهيزها اللاحقة لإدخال الثقافة في المختبر .

Video: Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

باستخدام بويضات من<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نموذج من التهاب الرئة الناجم عن الديدان الطفيلية

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

النقل العابر للأشكال القوية من المشوكات الحبيبية

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genetics

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن<em&gt; المتصورة</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق<em&gt; الدودي Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

باستخدام بويضات من

النقل العابر للأشكال القوية من المشوكات الحبيبية

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة

النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن

استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

ككل جبل