NIH Grant RO1AI015503 finanziert teilweise. Schistosome-infizierten Mäusen lieferten die NIAID Schistosomiasis Resource Center unter Biomedical Research Institute (Rockville, MD) durch NIH-NIAID Vertrag HHSN272201000005I für den Vertrieb über BEI Ressourcen.

Alle Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden durch die institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss der University of Wisconsin-Madison unter Protokoll genehmigt keine. V005717. Das folgende Protokoll beinhaltet Arbeiten in einer Einrichtung Biosafety Level 2 (BSL2) für menschliche Krankheitserreger, obwohl keiner der schistosome-Stufen dargestellt, die in diesem Protokoll ansteckend für Menschen oder andere Säugetiere sind. Institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Risiko-Gruppe 2 (RG2) menschliche Krankheitserreger zu folgen.
Hinweis: Wir verwenden weibliche Swiss-Webster Mäuse (6 - Wochen alten) aufgrund ihrer höheren Anfälligkeit zur Infektion10, damit größere Ei Belastungen nachgeben. Tucker Et Al. beschreiben die Maus und Schnecke Infektion Protokolle in diesem Modell System11verwendet. Die Tabelle der Materialien zeigt eine Liste aller spezifischen Ausrüstung, Materialien, Reagenzien und tierischen Quellen, die zur Durchführung dieser experimentellen Protokolls.
1. Verarbeitung von infizierten Leber
<ol><li>Einschläfern Sie Mäuse, 6-7 Wochen nach der Infektion, durch CO2 ersticken (Rate von 10-30 % von dem Kammervolumen pro Minute). Mäuse für die Einstellung der Atmung und Herzschlag zu überwachen. Hinweis: In der Regel können bis zu 20 Mäuse zu einem bestimmten Zeitpunkt verarbeitet werden.</li>
	<li>Legen Sie nach der Übertragung euthanasierten Mäuse auf eine biologische Kabinett Mäuse auf den Rücken und sprühen Sie ihre ventralen Flächen mit 70 % Ethanol. 1 min. einwirken lassen.</li>
	<li>Kneifen und ziehen Sie die Haut des Unterleibs und quer durch die Basis der eingeklemmten Haut am nächsten an den Bauch mit sterilen Chirurgische Scheren. Ziehen Sie die geschnittenen Haut anterior (d. h. in Richtung zum Kopf), die Leber zu offenbaren. Beachten Sie, dass die Leber sollte vergrößert und durch eine Ei-induzierte granulomatöse Reaktion (Abbildung 2A gesprenkelt).</li>
	<li>Entfernen Sie die Leber und legen Sie sie in einen Becher mit 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 mit verbleibenden Mäuse. Hinweis: Zwanzig Mäuse sind in der Regel in einer einzigen Ernte verarbeitet.</li>
	<li>Die Leber in eine sterile Petrischale und entfernen Sie-Leber Fett/Bindegewebe mit der sterilen Pinzette.</li>
	<li>Auf eine sterile 250-mL-Zentrifuge-Flasche mit ~ 200 mL sterile 1,2 % NaCl-Lösung mit Pen/Strep getrimmt/gereinigt Lebern übertragen.</li>
	<li>Kräftig schütteln Sie die Flasche mit der Leber, und mit einer sterilen Einweg-Pipette, entfernen Sie die überschüssige Oberfläche Schaum/Treibgut. Langsam die restliche Salzlösung in ein Gefäß abgießen oder Waschbecken mit 1 % Bleichmittel (Desinfektionsmittel).</li>
	<li>Die Lebern ~ 200 mL frische Kochsalzlösung hinzu, und wiederholen Sie Schritt 1,8 noch dreimal.</li>
</ol>2. Leber Extraktion und Miracidial isolation
<ol><li>Legen Sie die Leber in einer kleinen sterilen Edelstahl-Mixbecher und ~ 2 mL 1,2 % NaCl-Lösung (Abb. 2 b).</li>
	<li>Decken Sie die Tasse mit Folie und einer Petrischale zur Verhinderung von Verschmutzungen und Mischung für 1 min durch den Wechsel von niedriger und hoher Geschwindigkeit (20 s niedrige Geschwindigkeit/10 s high-Speed, Wiederholung) (Abbildung 2).</li>
	<li>Verteilen Sie gleichmäßig die kombinierte Leber Aussetzung in sterilen 250-mL-Zentrifuge Flaschen (für 20 Lebern 4 Flaschen verwenden).</li>
	<li>~ 200 mL Gesamt Volumen/Flasche sterile Kochsalzlösung mit Antibiotika hinzufügen. Gewicht/Balance Flaschen vor der Zentrifugation.</li>
	<li>Zentrifuge gemischt Leber bei 290 X g für 15 min bei 4 oC. sanft aus Überstände in einen Behälter mit Bleichmittel vor der Entsorgung zu gießen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 einmal. Achten Sie darauf, gründlich vor Zentrifugation Leber Sediment aufzuwirbeln.</li>
	<li>Nach verwerfen die letzten Kochsalzlösung waschen Sie (Schritt 2,6), gebeizte Lebergewebe, schütteln Sediment aufzuwirbeln und übertragen die Aufhängung in eine sterilisierte 1 L volumetrischen Kolben, der komplett mit Aluminium abgedeckt wurde fügen 200 mL sterilem Teichwasser mit Pen/Strep hinzu Folie, mit Ausnahme der Spitze 3 cm des Halses (Abb. 2D). Hinweis: Verwenden Sie zwei Flaschen (= 10 Lebern) pro 1-L-Flasche. Teichwasser simuliert die natürliche Süßwassersee Umgebung musste Miracidial schlüpfen aus den Eiern zu stimulieren.</li>
	<li>Mit sterilem Teichwasser, füllen Sie die Flasche um ca. 3 cm oberhalb der Folie abdecken am Hals. Dann, ohne Verzögerung (wie Miracidia in Kürze beginnen zu schlüpfen), restliche Schaum und Lebergewebe schwimmend an der Oberfläche durch schnell Pipettieren bis ~ 12 mL Teichwasser mit Schutt entfernen und verwerfen es in einem separaten Rohr zu verwerfen. Ersetzen Sie durch frische sterile Teichwasser.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Reinigung Schritt 2.8, drei weitere Zeiten, Überprüfung auf Vorhandensein eines Miracidia in der Röhre verwerfen. Einzustellen Sie Wiederholung der Reinigung Schritt erscheint Miracidia in der Waschlösung.</li>
	<li>Fügen Sie nach der letzten Wäsche hinzu, langsam ~ 12 mL warmen sterilem Teichwasser (30 oC vorgewärmt) um ein Temperaturgradient mit sauberem, sterile warmes Wasser an der Spitze zu schaffen. Hinweis: Dies geschieht am besten durch langsam entladen Wasser entlang der Seite des Halses Fläschchen mischen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie eine kleine Petrischale Abdeckung über der Öffnung der Flasche und strahlen ein helles Licht am oberen Rand der Flasche über die Folienabdeckung, die Oberfläche des Wassers zu beleuchten. Hinweis: In der Regel innerhalb von 5-10 Minuten, Schwimmen Miracidia, angezogen, das Licht in großer Zahl innerhalb der ersten 2-3 cm Teichwasser (Abbildung 3A) konzentrieren.</li>
</ol>3. Miracidial Ernte und Anbau
<ol><li>Wenn Miracidia haben nach 10 min an der Oberfläche gesammelt, mit einer sterilen Transferpipette ~ 8 mL Teichwasser und Transfer in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL entfernen. Legen Sie die Röhrchen mit Miracidia auf Eis.</li>
	<li>Zurück 8 mL warmen sterilem Teichwasser entlang der Innenseite der volumetrischen Küvette hinzufügen und weitere 10 Minuten warten.</li>
	<li>Mit neuen Röhren jedes Mal, wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 noch dreimal. Halten Sie nach der 4th -Sammlung das letzte Rohr auf Eis für 10 min erlauben die Miracidia zu begleichen. Dieser Satz von Rohren umfasst die erste Ernte.</li>
	<li>Zentrifugen-Röhrchen mit Miracidia 290 X g für 1 min bei 4 oC in einer vorgekühlten gekühlten Zentrifuge.</li>
	<li>Umgehend entfernen Sie die meisten des Überstands (~ 7 mL) darauf achten, nicht zu stören das Parasiten-Pellet (Abb. 3 b).</li>
	<li>Pool der Miracidia aus dieser ersten Ernte zu einem Rohr, dann spülen Sie alle der ursprünglichen Rohre mit ~ 1 mL sterilem Teichwasser und hinzufügen "gepoolte" Rohr.</li>
	<li>Können Parasiten für ~ 5 min auf Eis zu begleichen, und erneut Zentrifugieren der Parasiten bei 290 X g für 1 min bei 4 oC.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 6-8 mL sterile Chernin Salzlösung (CBSS +; siehe Tabelle of Materials) enthaltenden Pen/Strep ausgeglichen.</li>
	<li>Auszusetzen Sie die Miracidia und aliquoten folgte ihnen in eine Kultur 24-Well-Platte (1 mL pro Well), indem das Rohr in 6-8 mL CBSS + Spülung und 1 mL Spülen in jede Vertiefung sanft. Parasiten bei 26 oC unter inklusieve Bedingungen auszubrüten. Konzentrationen von isolierten Miracidia schwankt, aber werden in der Regel durchschnittlich ~ 7000/mL.</li>
	<li>Wenn Parasiten noch auf die Lichtquelle konzentrieren, wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.9 weiterhin Ernte spät-Schlupf Miracidia aber erhöhen Sie das Zeitintervall zwischen Sammlungen auf 15-20 min zu. Hinweis: Diese neue Reihe von Röhren steht die zweite Ernte. Jedoch weil die Miracidial Zahlen in der Regel niedrig sind, sind Larven aus allen Rohren in der Regel in einer einzigen Kultur gut mit 2 mL CBSS + gebündelt.</li>
	<li>24 h nach der Ernte und Anbau Aufschwemmen Sie sanft Sporocysts in den Brunnen durch pipettieren.</li>
	<li>Warten Sie ein paar Minuten um Parasiten, sich an der Unterseite der Brunnen zu ermöglichen. Sobald sie sich niedergelassen haben, entfernen Sie vorsichtig den überstand (~1.5 mL), enthalten die meisten der Nasenfunktion epidermalen Platten Schuppen von Miracidia während der larvalen Transformation. Diese "Verwandlung" überstand kann entweder verworfen oder in Folgestudien Larven sekretorischen Produkte integriert.</li>
	<li>Jeder Brunnen und sanft Pipette zum Sporocysts Aufschwemmen fügen Sie 1,5 mL frische CBSS hinzu +. Wiederholen Sie Schritt 3.12, wenn weitere waschen oder Umstellung auf ein anderes Medium gewünscht wird.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+schistosomiasis.">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+worldwide+in+2013.">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li><li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Th&#233;ron, A., Jamieson, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+sporocysts.">Schistosoma sporocysts.</a> Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).</li><li>Bayne, C. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts.">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li><li>Hansen, E. L., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+line+from+embryos+of+Biomphalaria+glabrata+(Pulmonata):+Establishment+and+characteristics.">A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics.</a> Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).</li><li>Yoshino, T. P., Laursen, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules.">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae.">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li></ol>

Autoren haben nichts preisgeben.

Miracidia von S. Mansoni, isoliert und manipuliert, wie hier beschrieben nur die Schnecke Zwischenwirt infizieren können und daher repräsentieren keine menschliche Biohazard während dieser Phase der Larvalentwicklung. Jedoch um versehentliche Belichtung/Infektion der Schnecken zu vermeiden, sollte darauf geachtet werden, Miracidial Isolationen an einem anderen Ort aus ausführen wo anfällig Biomphalaria Schneckenarten anwesend oder gepflegt werden können. Ein separater Raum, registriert als BSL2 Ra...

Das menschliche Blut Egel Schistosoma spp., sind die Erreger der Schistosomiasis, eine vernachlässigte tropische Krankheiten leidet schätzungsweise 230 Millionen Menschen weltweit1. Die am weitesten verbreitete Art, Schistosoma Mansoniist in Südamerika, des karibischen Archipels, Nahost und Afrika südlich der Sahara in Afrika2geografisch verteilt. Der Lebenszyklus von S. Mansoniund andere Schistosomen ist komplex, mit einem Säugetier Definitive Host und Süßwasserschnecken der Gattung Biomphalaria , die als obligate Zwischenwirte dienen.
S. Mansoni männlichen und weiblichen Erwachsenen Wurm Paare Leben in den hinteren mesenterialen Adern der Säugetier-Wirt reproduzieren, was die Auflösung von embryonierten Eiern (Ova), die in die kleinen Venolen der Darmschleimhaut eingereicht werden. Eiern dann durchbricht die Gefäßwände durch Schleimhaut Wandern, und schließlich geben Sie das Darmlumen, wo sie mit dem Kot storniert werden. Bei Ova Süßwasser und freischwimmenden Larven (Miracidia) schlüpfen müssen, sie in kurzer Zeit eine geeignete Biomphalaria Schnecke zu infizieren, um seinen Lebenszyklus weiter vorkommen. Dieser Infektionsprozess beinhaltet Miracidial Bindung an die Schnecke äußeren Körperoberfläche gefolgt von aktiven eindringen und Eindringen von der Larve in den Host. Bald nach Eintritt beginnt das Miracidium, die Außenlamellen ciliated epidermalen Schuppen, wie es ein Syncytium bildet, die die neue äußere Oberfläche (Schale) des nächsten Larvenstadium, die primäre oder Mutter Sporocyst werden. Durch Ungeschlechtliche Fortpflanzung jede primäre Sporocyst produziert und veröffentlicht eine zweite Generation von Sporocysts, als sekundäre oder Tochter Sporocysts, die wiederum erzeugen und lösen zahlreicher intramolluscan Endphase der Cercaria3 . Bei der Flucht aus der Schnecke Host können Nautiliden Cercariae zuweisen und direkt die Haut eines Menschen oder andere geeignete Säugetier-Hosts durchdringt. Bei der Einreise in ihren neuen Wirt Cercariae auf die parasitären Schistosomula Bühne verwandeln und dringen in das Gefäßsystem. Sie migrieren wiederum an der Lunge und dann an die Lebervene wo sie Reifen zu Erwachsenen Würmer, männliche und weibliche Paare bilden und Reisen zu den mesenterialen Adern um ihren Lebenszyklus zu vervollständigen.
Erfolgreiche intramolluscan oder "Schnecke-Phase" Entwicklung der Larven Schistosomen unbedingt Fortsetzung des Zyklus des menschlichen Host-to-Host-Übertragung. Von entscheidender Bedeutung ist die folgende Posten von der freischwimmenden Miracidium in der Schnecke Host und seine frühen Transformation auf die primäre Sporocyst-Bühne. Abhängig von den physiologischen und immunologischen Kompatibilität zwischen Wirt und Parasit ist es in dieser Phase der Larvalentwicklung dieser anfänglichen Erfolg oder Misserfolg zu Infektionen ist bestimmt4,5,6 . Nachfolgende Entwicklung der primären Sporocysts asexuell produzieren sekundäre Sporocysts, die dann Menschen infektiöse Cercariae erzeugen, weitere erfordern eine permissive physiologischen Host-Umgebung, die für alle der Parasit Wachstum bereitstellt und reproduktive braucht.
Bisher ist wenig bekannt über die zugrunde liegenden, physiologische, biochemische und molekulare Prozesse schistosome-Schnecke Interaktionen, vor allem die Moleküle und Wege beteiligt zur Regelung der Larvalentwicklung und Reproduktion oder Modulation Host-Immunantworten. Zugriff auf eine große Anzahl dieser Larvenstadien unter in-vitro- Kulturbedingungen, die experimentelle Manipulation zulassen würde erheblich erleichtern die Entdeckung des entwicklungspolitischen Wege und zugrunde liegenden Mechanismen des Zellwachstums, Differenzierung und Reproduktion. Kritischen Parasit Wege oder Mechanismen, identifiziert durch in-vitro- Experimente, könnte dann Larven Wachstum/Reproduktion in der Schnecke Host zu stören oder Schnecke Host Abwehrmechanismen beteiligt Erkennung und Beseitigung von identifizieren verwendet werden Miracidial oder Sporocyst Stufen.
In diesem Artikel und video-Präsentation bieten wir eine detaillierte Beschreibung einer Methode zur Isolierung von freischwimmenden S. Mansoni zahlreicher Miracidia für Einführung in in-vitro- Kultur, die dann mit weiteren experimentellen ausgesetzt sein könnten Manipulation (siehe Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die Protokoll-Workflow). Obwohl ähnliche Verfahren beschrieben wurden bisher7,8,9, fühlten wir, dass ein detailliertes Protokoll sinnvoll, Forscher, die dieses Modell wäre, um noch offene Fragen im Zusammenhang mit Adresse beschäftigen wollen intramolluscan Larvalentwicklung, Zellproliferation und schistosome-Schnecke immun Interaktionen. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz für die Isolierung von Eiern aus anderen medizinisch wichtigen Trematoden wie Blase-Wohnung S. Haematobium, Leberegel oder Lunge Egel leicht angepasst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chernin&#39;s balanced salt solution (CBSS+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 g sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Dissolve salts, except calcium chloride, and&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 g of potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>sugars in 800 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Dissolve calcium chloride separately in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 g magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td>mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.53 g calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4160</td>
			<td>Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 g sodium bicarbonate&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>with constant mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g glucose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>152527</td>
			<td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g trehalose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td>0.22 &#181;m disposable bottle-top filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL 100X penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add filtered penicillin and streptomycin soln&#160; 
			prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Bge&#160; medium (Ibge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 900 mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>220 mL Schneider&#8217;s Drosophila medium modified</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-351Q</td>
			<td>Mix Schneider&#39;s medium with 680 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9010</td>
			<td>Add lactalbumin hydrolysate and galactose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 g galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td>Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 &#181;m 
			pre-sterilized disposable bottle-top filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Bge medium (cBge)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 mL of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mL Incomplete Bge medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td>waterbath at 60&#176;C for 1 hr while gently&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL 100X penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>swirling the bottle every 10 min 
			Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes&#160; 
			and store at -20&#176;C.&#160; Mix medium + FBS and 
			filter sterilize using a 0.22 &#181;m pre-sterilized&#160; 
			disposable bottle-top filter&#160; 
			Add penicillin and streptomycin prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond water (stock solution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1L of stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.5 g calcium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C64-500</td>
			<td>Mix all salts in 1L of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25 g magnesium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M27-500</td>
			<td>Note that the salts will not have completely&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25 g&#160; sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>dissolved.&#160; Shake vigorously to suspend&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 g&#160; potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>salts prior to making the working soln&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond water (working solution)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix stock to ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1500 mL of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize pond water by autoclaving (slow&#160;cycle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add penicillin and streptomycin prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (1.2% NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.5L of solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>Autoclave saline solution to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Add penicillin and streptomycin prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional equipment and material:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-L mouse euthanizing chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Following approved IACUC protocol no. V001551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank and regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pathogen-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-L volumetric flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source (150W)</td>
			<td>Chiu Tech Corp</td>
			<td>Model F0-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, refrigerated, swinging bucket</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles (250 mL)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable transfer pipets&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pre-sterilized disposable bottle-top filter&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blender</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>Model 51BL31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender cup, 100 mL capacity</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Nikon Instruments&#160;</td>
			<td>Eclipse TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass isolation and in vitro cultivation of intramolluscan stages of the human blood fluke schistosoma mansoni

Menschliches Blut Egel, Schistosoma spp., haben einen komplexen Lebenszyklus, der sexuelle und asexuelle Entwicklungsphasen innerhalb einer Schnecke zwischen- und Säugetieren Endwirt, bzw. beinhaltet. Die Fähigkeit, zu isolieren und Aufrechterhaltung der verschiedenen Lebenszyklusphasen unter in-vitro- Kulturbedingungen hat Untersuchungen der zellulären, biochemischen und molekularen Mechanismen zur Regulierung Parasit Wachstum, Entwicklung und Host erheblich erleichtert. Interaktionen. Übertragung von Schistosomiasis erfordert Ungeschlechtliche Fortpflanzung und Entwicklung mehrere Larvenstadien innerhalb der Schnecke Host; von der infektiösen Miracidium, durch primäre und sekundäre Sporocysts zu cercarial Endstufe, die für den Menschen ansteckend ist. In diesem Beitrag präsentieren wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur Masse Schraffur und Isolierung von Schistosoma Mansoni Miracidia von Eizellen aus Lebern von infizierten Mäusen und ihre nachträgliche Einführung in in-vitro- Kultur. Es wird erwartet, dass das ausführliche Protokoll wird neue Forscher zu betreiben und erweitern diese wichtige Forschungsfeld schistosome-zu fördern.

Die überwiegende Mehrheit der Miracidia wird in der Regel in den ersten beiden "ernten" gesammelt wurden. Inkubation von isolierten Miracidia in CBSS + löst den Miracidium-Sporocyst Transformationsprozess (Abbildung 4A- C). Innerhalb der ersten Stunde Brunnen folgende Übertragung auf Kultur mit CBSS +, die meisten Miracidia nicht mehr schwimmen (Abb. 4A). Um 6 Uhr in der Kultur Miracidia sind dabei aktiv shedd...

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Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die groß angelegte axenic Isolierung und Sammlung von freischwimmenden Miracidia der menschlichen Blut Egel Schistosoma Mansoni und deren Weiterverarbeitung für Einführung in die in-vitro- Kultur.

Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

9.1K Aufrufe.  University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die groß angelegte axenic Isolierung und Sammlung von freischwimmenden Miracidia der menschlichen Blut Egel Schistosoma Mansoni und deren Weiterverarbeitung für Einführung in die in-vitro- Kultur.

Serie: Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...