وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل ريزيرف الأموال الغربية التي قدمت إلى جامعة بدء التشغيل E. جولي. وقدمت القواقع المصابة من قبل مركز المعلومات البلهارسيا ، NIH - المعدية (NIAID العقد رقم HHSN272201000009I). كما نشكر جلالة الملك وكريس رونالد بلانتون للحصول على الدعم في تأمين القواقع المصابة والبلهارسيا لإجراء مناقشات مفيدة.

تدابير السلامة : يمكن cercariae البلهارسيا اختراق الجلد مباشرة من دون حاجة لخفض أو المسام ، وتسبب مرض البلهارسيا من الأمراض المزمنة. S. المنسونية هو مستوى السلامة الحيوية 2 الكائن ، وبالتالي السليم معدات الحماية الشخصية ويجب اتباع تدابير السلامة المناسبة عند العمل مع المذنبات المعدية. معظم المعدات اللازمة للنمو وتحويل البلهارسيا هو المعيار ، مع وجود استثناءات قليلة لاحظت المفتاح في الجدول في نهاية البروتوكول. وينبغي القيام بجميع الأعمال بالمذنبات في غرفة منعزلة. وينبغي أن المثقف Schistosomules في العقيمة ، وافق هود للسلامة الأحيائية. وينبغي أن ترتديه من طبقتين أو النتريل قفازات مطاطية ، كما ينبغي أن معطف المختبر ، وزوج من الأحذية للماء ، والسراويل مع عدم وجود ثقوب أو الدموع ، وحماة الأكمام ماء لمعصميك والأسلحة. في حالة وجود تسرب عرضي ، رش المنطقة الملوثة فورا مع الايثانول 70 ٪ أو 10 ٪ التبييض ، وفرك بقوة إذا كان على الشخص الخاص. هذا سوف يكون كافيا لتعطيل الطفيلي ، ولكن ينبغي الإبلاغ عن جميع حالات العدوى المحتملة وتؤخذ على محمل الجد. على الرغم من schistosomules ليست معدية بالفطرة ، والمبادئ التوجيهية المؤسسية تختلف ، وينبغي استشارة لتحديد ما إذا كان يلزم BSL2 الاحتياطات خلال مراحل الحياة غير المعدية. تطهير جميع الأسطح التي تتلامس مع أي مادة قد تكون معدية بعد تنفيذ التجربة والتخلص من النفايات في حاوية an بيولوجية المعتمدة. ملاحظة : صناديق غطاء الحلزون المضيف 1-2 قبل أيام من إلقاء الضوء وحمايتها من 1. حصاد cercariae من المضيف الحلزون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل نظيف وخال من دورق 500mL المنظفات الكامل في منتصف الطريق مع الماء المقطر معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة. إذا كان يعمل مع القواقع المضيفة المصابين miracidia في تواريخ مختلفة ، واستخدام كوب منفصلة لكل تاريخ العدوى (وهذا أمر مهم لا سيما إذا كان سيتم استخدامها لاجراء تجارب على القواقع في المستقبل). يمكن حجم الدورق أيضا أن تكون أصغر اعتمادا على تجربة المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستضيف جمع القواقع المصابة ترغب في إلقاء ودائع بعناية في الدورق باستخدام معيار صافي أسماك الزينة وملقط الغرض العام حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درج دورق مكان على بقعة الطوارئ حوالي 8 إلى 12 بوصة تحت مصدر ضوء ساطع. اسمحوا الوقوف لمدة 1-2 ساعات تحت الضوء. Cercariae خروج المضيف الحلزون عند التعرض لضوء ساطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية بعناية القواقع من خليط cercariae. اتخاذ احتياطات السلامة الإضافية ، كما هو مزيج شديد العدوى. تذكر ، cercariae يمكن ان تخترق الجلد مباشرة الإنسان! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المخلوط تحت مصدر الضوء لمدة 15 دقيقة ، مما يسمح أي مسألة النفايات الجسيمات إلى تسوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل cercariae في دورق مخروطي نظيف باستخدام الماصة ، وتجنب الحطام في قاع الكأس. ضع قارورة في حوالي زاوية 45 درجة على الجليد في الظلام لمدة 45 -- 60 دقيقة ، مما يسمح لتسوية cercariae في زاوية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة 50 مل لإزالة 75-90 ٪ من طاف وايداعها في دورق يحتوي على مواد التبييض 10 ٪ أو 70 ٪ من الإيثانول ، مع الحرص على عدم السماح لقطرات المياه التي تحتوي على بالتنقيط cercariae من الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة في دورق مخروطي يحتوي على cercariae برفق لresuspend في cercariae في الحل. استخدام الماصة لنقل العينة إلى أنابيب معقمة مل 50 المخروطية. مكان الأنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. سوف Cercariae تسوية نحو الجزء السفلي من أنبوب في الظلام. </li></ol> 2. دليل لتحويل cercariae schistosomules قبل البدء : قم RPMI 1640 كاملة (RPMI ، 5 ٪ مصل بقري جنيني ، 1X القلم / بكتيريا) ودافئة إلى 37 درجة مئوية. (ومن الأهمية بمكان أن تم المعطل المصل البقري الأجنة المستخدمة من قبل الحضانة a 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والبلهارسيا يمكن أن تكون حساسة لتكملة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قلنسوة واقية ، وإزالة طاف وصولا الى 5-10 مل من الحل في كل مخروطية 50 مل باستخدام pipettor أو جهاز فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق قياس 22 المزدوج انتهت ، luer لوك الاستحلاب الإبرة إلى حقنة بحجم مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم ببطء الخليط في المحاقن. جمع cercariae من جميع الأنابيب في 50 مل حقنة. تكون منتبهة لنازف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره عبر حقنة بعناية بحيث نهاية الإبرة غير مرتبط متروك. حقنة أخرى نعلق على هذا الجانب من الإبرة الاستحلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير الخليط من خلال إبرة ما مجموعه 40 مرات (20 مرات ذهابا وإيابا) لتحويل cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف مثل المحاقن عموديا محتواة الخليط في المحقنة القاع ورأس المحقنة فارغة. إزالة وتطهير حقنة الأعلى في الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض مزيج الودائع قطرة في ارتفاع الجدران نظيفة طبق بيركس س 100mm 50mm أو صحن بلورة. تعقيم الإبر والمحاقن في الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 37 درجة مئوية RPMI 1640 كاملة وسائل الإعلام هذه أنغير مغطاة بالكامل الجزء السفلي من طبق بيتري ، كما لو صب طبق مرق لوريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة برفق لجمع schistosomules في وسط صحن بتري. تجنب الرش. ملاحظة : قد يكون مفيدا لإيقاف ضوء غطاء لهذه الخطوة إلى مزيد من كاف تصور schistosomules في المركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع فورا schistosomules تتركز في الطازجة جيدا الخلية 12 لوحة الثقافة جيدا باستخدام قطارة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 2.9 و 2.10 حتى schistosomules لم تعد موجودة في وسط الطبق (حوالي 10 مرات). إيداع كل مجموعة لاحقة في بئر جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر يصل في منتصف الطريق (~ 1،5 مل) مع وسائل الاعلام RPMI prewarmed كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور على مجهر مقلوب للتحقق من وجود وعدم وجود schistosomules cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو في حاضنة schistosomules CO 2 تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li></ol> 3. ممثل النتائج : وينبغي نقل بانتظار تحويلها إلى وسائل الإعلام schistosomules الثقافة والتصور تحت مجهر مقلوب مشرق الميدان (انظر الجدول معدات للحصول على مثال) العائد صورة مشابهة إلى الشكل 1 ، الذي تحول schistosomules فقط موجودة في البئر. يمكن أن تشمل الملوثات المحتملة cercariae سليمة ، والذيول بالمذنبات قطعت ، أو غيرها من الحطام. إذا لم يتوفر مجهر مقلوب ، وسوف المجهر القياسية أو حتى على نطاق تشريح تكون كافية لتصور schistosomules. علما أن هذا الإجراء لا يحول دائما 100 ٪ من cercariae. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : تحولت Schistosomulum <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : Cercariae والذيول المجزأة

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يمكن أن تنشأ عدة مشاكل محتملة أثناء إجراء التحويل ، إلا أن هذا البروتوكول يهدف إلى تفادي معظم هذه المشاكل. أحد الأخطار المحتملة هو انسداد الإبرة الاستحلاب ، والذي ينشأ عادة بسبب الحطام التي خلفها الحصاد في الخطوة 1.3. تأكد من السماح لجميع الجسيمات ليستقر في الخطوة 1.5 و لنقل cercariae بعناية في الخطوة 1.6 لتجنب هذه المشكلة. أيضا ، كما هو موضح من قبل ، والعمل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، واستخدام معدات الحماية الشخصية (حتى دروع لحماية الوجه) ، وتجنب الضغط الزائد على المحاقن مستحسنة. يمكن فصل بالمذنبات ذيول يمكن تصور في وسائل الإعلام ، مما يدل على الفقراء خلال فصل الخطوة 2.9. ذيول يحمل اقتراحا مثل تشنج ولها شكل متميز (انظر الشكل 2) ، ويتم تمييزها بسهولة thusly من schistosomules. يمكن إزالة ذيول بواسطة غسل schistosomules تتجاوز RPMI كاملة schistosomules السماح لتسوية. وسوف تظل عائمة ذيول ويمكن إيقاف بالمكنسة الكهربائية. إذا cercariae سليمة موجودة في وسائل الإعلام ، لم ينفذ هذا التحول في الخطوة 2.5 بشكل صحيح. ويصور مشهدا لالمذنبات سليمة في الشكل 3B كمرجع. إذا كانت هذه المشكلة ، التأكد من أن الإبرة الاستحلاب المستخدمة هي من الحجم المناسب. أيضا ، يمكن زيادة عدد المرات التي يتم تمريرها من خلال خليط بالمذنبات الإبرة ، على الرغم من 40 مرة هو عادة أكثر بكثير مما يكفي لتقترب من 100 ٪ من قص ذيول بالمذنبات. وكان أول وصف التحول من المذنبات في schistosomules في عام 1974 وWikel كولي (13). منذ ذلك الحين ، أنجز إعداد schistosomules باستخدام استراتيجية القص مع الإبر والمحاقن على النحو المبين في هذا البروتوكول ، أو باستخدام نهج vortexing والمنفصلين مع تدرجات لpercoll (14 ، 15) أو تحريكها كما هو موضح في هذه الورقة. موصوفة بجمال هذه التقنيات اثنين من أجل التحضير لويس schistosomules فريد (16) ولمزيد من المعلومات عن زراعة مزيد من schistosomules للنمو على المدى الطويل يمكن العثور عليها في مركز الموارد البلهارسيا المعدية ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto - resource.org</a> ).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> 22g س 2-7/8 &quot;إبرة الاستحلاب </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-825 - 17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 1X متوسطة (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) الحرارة المعطل </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستبرتوميسين (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> بلورة الطبق (100mm) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 08 - 741D </td></tr><tr><td> الملقط للأغراض العامة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 10 - 316C </td></tr><tr><td> بتكو ماء صافي الأرتيميا </td><td> بتكو </td><td> SKU : 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

طفيليات البلهارسيا هي العوامل المسببة للمرض البلهارسيا ، وهو مرض مزمن يؤثر على المنهكة أكثر من 200 مليون شخص حول العالم ويحتل المرتبة الثانية بعد الملاريا من بين الأمراض الطفيلية في مجال الصحة العامة وآثار اجتماعية واقتصادية (1-4). طفيليات البلهارسيا والديدان مثقوبة مع دورة حياة معقدة تتبادل بين الحياة الطفيلية في الثدييات والرخويات المضيفين مع التدخل السباحة الحرة مراحل. لفترة وجيزة ، حرر السباحة cercariae تصيب مجموعة الثدييات عن طريق اختراق الجلد مع المعونة من البروتياز يفرز ، خلال الوقت الذي تفقد cercariae ذيولها ، تتحول schistosomules. يجب أن تهرب الآن schistosomules النظام المضيف المناعي ، ووضع القناة الهضمية للهضم من خلايا الدم الحمراء ، وعلى الرغم من أن ترحيل الرئتين والدورة الدموية بوابة طريقها إلى وجهتها النهائية في الكبد ونظام البوابة في نهاية المطاف الأوردة المساريقي (لS. المنسونية) حيث الذكور والإناث والديدان لم الزوج ، وتنتج مئات من البيض يوميا. تفرز بعض البيض من الجسم في المياه العذبة ، حيث يفقس البيض في السباحة الحرة miracidia (5-10). وتصيب أنواع القواقع miracidia محددة وتحويلها الى sporocysts الأم وابنتها ، والتي بدورها ، تنتج cercariae المعدية ، واستكمال دورة الحياة. للأسف ، لا يمكن كامل دورة حياة البلهارسيا يمكن تربيتها في المختبر ، ولكن يمكن أن تتحول إلى عدوى cercariae schistosomules ، ويمكن تربيتها في schistosomules لأسابيع لتحليل التنمية البلهارسيا في المختبر أو تحليل ميكروأري. في هذا البروتوكول ، ونحن نقدم وصفا للتحول بالمذنبات البصرية واستزراع schistosomules المختبر. تسلط علينا من cercariae المعدية ذات السرتين الجرداء الحلزون المضيف وتحويل يدويا لهم في فصل schistosomules التي ذيولها باستخدام الاستحلاب المزدوج انتهت الإبرة. وصف التحول في المختبر بالمذنبات وتقنيات الثقافة schistosomules تجنب استخدام مجموعة الثدييات ، والذي يبسط التصور من البلهارسيا ويسهل جمع الطفيلي للتحليل تجريبي. التحول في المختبر وتقنيات زراعة من البلهارسيا وقد تم القيام به لسنوات (11 ، 12) ، ولكن لم توضع بروتوكولات البصرية التي تتوافر للمجتمع الدولي بأسره.

Watch this Scientific Journal Video about Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules at JoVE.com

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

نحن تصف<em&gt; في المختبر</em&gt; طريقة لزراعة schistosomula من الطفيليات دودة مسطحة<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ، عن طريق التحول من الحصاد وcercariae معدية من حلزون المياه العذبة وسيطة ذات السرتين الجرداء المضيف.

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

17.9K Views.  Case Western Reserve University. نحن تصف في المختبر طريقة لزراعة schistosomula من الطفيليات دودة مسطحة البلهارسيا المنسونية ، عن طريق التحول من الحصاد وcercariae معدية من حلزون المياه العذبة وسيطة ذات السرتين الجرداء المضيف.

Video: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

باستخدام بويضات من<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نموذج من التهاب الرئة الناجم عن الديدان الطفيلية

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

زراعة<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; إن المناعية نيماتودا الطفيلي ومنتجاتها يفرز

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, investigations of interactions between endobiotics (e.g., drugs and prebiotics) and gut microbiota have become an important research topic. However, in vivo experiments with human volunteers are not ideal for such studies due to bioethics and economic constraints. As a result, animal models have been used to evaluate these interactions in vivo. Nevertheless, animal model studies are still limited by bioethics considerations, in addition to differing compositions and diversities of microbiota in animals vs. humans. An alternative research strategy is the use of batch fermentation experiments that allow evaluation of the interactions between endobiotics and gut microbiota in vitro. To evaluate this strategy, bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) were used as a representative xenobiotic. Then, the interactions between Bif EPS and human gut microbiota were investigated using several methods such as thin-layer chromatography (TLC), bacterial community compositional analysis with 16S rRNA gene high-throughput sequencing, and gas chromatography of short-chain fatty acids (SCFAs). Presented here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems. Importantly, this protocol can also be modified to investigate general interactions between other endobiotics and gut microbiota.

Described here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems.

تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...