معاملة عابرة للأشكال القوية من Echinococcus granulosus. نحن نصف تقنية نقل عابرة سريعة في مراحل النمو المختلفة من Echinococcus granulosus باستخدام الجيل الثالث من ناقلات lentivirus. داء المشوكات الكيسي أو مرض الهيداتيد هو واحد من أهم الأمراض الطفيلية الحيوانية المنشأ التي تسببها المشوكات الحبيبية ، وهي دودة شريطية صغيرة تؤوي في أمعاء الأنياب.
هناك حاجة ملحة للبحوث الجينية التطبيقية لفهم آليات التسبب في الأمراض ومكافحة الأمراض والوقاية منها. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نظام فعال لتقييم الجينات يعوق التفسير المباشر لعلم الوراثة الوظيفي للطفيليات cestode ، بما في ذلك أنواع Echinococcus. لا يزال التقدم في نقل الجينات في الديدان المسطحة الطفيلية محدودا مقارنة بطفيلي البروتوزوان.
وقد برز استخدام نظام التوصيل الفيروسي كأداة أساسية لتوصيل الجينات المحورة والتحقيق في الجينات / البروتين على مدى العقدين الماضيين. لذلك قمنا بتقييم النقل العابر للفيروسات اللينتيفيروسية لجين مراسل GFP إلى البروتوسكوليسيس والديدان القوية للمكورات الحبيبية Echinococcus. يوضح الشكل 1 عرضا تخطيطيا لبروتوكول الدراسة لمراحل المشوكات الحبيبية.
واحد ، جمع الخراجات hydatid. جمع الخراجات الكبدية من الأغنام المصابة بشكل طبيعي والتي يتم ذبحها بشكل روتيني في مسلخ. تعقيم سطح الكيس بالكامل باستخدام شاش معقم و 70 ٪ من الكحول قبل شفط البروتوسكوليس.
استنشاق 20 إلى 50 مل من سائل الهيداتيد إلى أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل. بعد التصريف ، قم بمسح الكيس بشفرة حادة ، ونقل الطبقة الجرثومية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل ، وهزه لفترة قصيرة لزيادة جمع البروتوسكوليس. اغسل البروتوسكوليكس باستخدام مخزن PBS المؤقت من ثلاث إلى خمس مرات.
راقب البروتوسكوليسيس في 0.1٪ eosin لمدة خمس دقائق لتحديد جدوى البروتوسكوليتس تحت المجهر الضوئي. استخدم البروتوسكوليتس مع قابلية 95٪ على الأقل للثقافة. علاج البروتوسكوليتس تترسب مع اثنين مل من البيبسين لمدة 15 إلى 20 دقيقة.
لعزل البروتوسكوليتس الفردية ، أعد تعليق رواسب البروتوسكوليكس في PBS ومررها عبر طبقتين من الشاش المعقم إلى أنبوب مخروطي جديد معقم 50 مل. ثانيا ، زراعة ثنائية الطور من البروتوسكوليتس من Echinococcus granulosus للحصول على الديدان البالغة. أضف 10 مل من وسط الطور السائل إلى كل قارورة استزراع مربعة 25 سم.
أضف ما يقرب من 5000 بروتوسكوليتس إلى قارورة الثقافة وانقلها إلى حاضنة CO2. بعد 24 إلى 48 ساعة ، انقل البروتوسكوليتس إلى قارورة جديدة ذات طور صلب وأضف مل واحد من نفس وسط الطور السائل الطازج لكل قارورة. انقل القوارير إلى الحاضنة ، 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
كل خمسة إلى سبعة أيام ، استبدل الوسط بوسط الطور السائل الطازج. ثلاثة ، زراعة أحادية الطور من protoscoleces من Echinococcus granulosus. تأكد من أن الزراعة أحادية الطور تتم قبل 24 إلى 48 ساعة من النقل.
استزرع ما يقرب من 5000 بروتوسكوليتس في قارورة استزراع مربعة 25 سم مع RPMI و 10٪ FBS. انقل القوارير إلى حاضنة CO2 حتى الاستخدام. رابعا ، زراعة الخلايا لإنتاج الفيروس وإعداده.
انقل 500،000 خلية HEK إلى قارورة مربعة 25 سم تحتوي على 5 مل من DMEM مع 10٪ FBS ، و 100 U / mL البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين. احتضان خلايا HEK2 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ومرورها في وسط الثقافة الكامل كل 48 ساعة. أخيرا ، استخدم خلايا HEK منخفضة المرور للنقل.
خمسة ، إنتاج وإعداد الفيروس مع الجيل الثالث من ناقلات lentivirus. اليوم الأول ، بعد التربسين خلايا HEK في لوحات زراعة 6 آبار ، قم بزرع 70،000 خلية لكل بئر مع DMEM طازج خال من المضادات الحيوية يحتوي على 10٪ FBS. استخدم الخلايا عند التقاء 50 إلى 60٪ للنقل بطريقة فوسفات الكالسيوم.
في اليوم الثاني ، استبدل زراعة الخلايا المتوسطة قبل ساعتين إلى ثلاث ساعات من التجربة ب DMEM طازج خال من المضادات الحيوية يحتوي على 2٪ FBS. في أنبوب 1.5 مل ، امزج البلازميدات الفيروسية من الجيل الثالث ، بما في ذلك 7 ميكروغرام / ميكرولتر pCDH513b ناقل نقل ، و 4 ميكروغرام / ميكرولتر PLPII ، و 4 ميكروغرام / ميكرولتر PLPI ، و 2 ميكروغرام / ميكرولتر PMD2G ناقلات مساعدة. أضف مخزن HEPES العازل إلى الخليط للوصول إلى حجم 422 ميكرولتر.
أضف 16 ميكرولتر من 1٪ TE المخزن المؤقت إلى الخليط. أضف 62 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 2.5 مل إلى الأنابيب واخلطها جيدا. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2x HBS إلى الخليط ، قطرة بقطرة في غضون دقيقة إلى دقيقتين باستخدام ماصة باستور.
اخلطي بلطف حتى يتم الحصول على محلول شبه معتم واحتضني الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في النهاية ، أضف الخليط إلى كل طبق ببطء ووزعه بحركات دائرية بطيئة. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 واستبدال الوسط بعد أربع إلى ست ساعات ب DMEM خال من المضادات الحيوية يحتوي على 10٪ FBS.
اليوم الثالث ، تأكد من نجاح النقل العابر وبقاء الخلية باستخدام مجهر فلوري مقلوب. في اليوم الرابع، حصاد الفيروسات من الوسط الاستزراعي عن طريق جمع المواد الفائقة لكل بئر وتخزينها في سالب 70 درجة مئوية حتى الاستخدام. ستة ، نقل عابر لمراحل مختلفة من المشوكات الحبيبية مع الفيروس.
في اليوم الأول ، استخدم لوحة ثقافة من 12 بئرا لنقل الجينات. الثقافة 5،000 إلى 50،000 خلايا HEK في ثلاثة أضعاف مع وسيط DMEM كامل كمرجع داخلي. ثقافة 150 بروتوسكوليكس طازجة في ثلاثة أضعاف في RPMI و 10٪ FBS.
ثقافة 30 الديدان القوية في ثلاثة أضعاف في DMEM و 10٪ FBS المعطلة بالحرارة. تحضير خليط من 1 مليون فيروس مع أربعة ميكروغرام / مل كاشف نقل لنقل خلايا HEK ومراحل مختلفة من الدودة. أضف الخليط إلى كل طبق ببطء ووزعه بحركات دائرية بطيئة.
احتضان الصفائح لمدة أربع إلى ست ساعات في حاضنة CO2 ، 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. استبدل الوسط لكل عينة بنفس وسط الاستزراع الكامل لتقليل الآثار السامة لكواشف النقل. في اليوم الثاني ، كرر خطوتين سابقتين لزيادة كفاءة النقل العابر لخلايا HEK ، و protoscoleces ، والديدان القوية.
احتضان جميع اللوحات لمدة 24 إلى 48 ساعة في حاضنة CO2 بنفس ظروف الثقافة بناء على نوع وسائط الخلية. في اليوم الثالث ، تأكد من نجاح النقل باستخدام المجهر الفلوري. النتائج التمثيلية.
هنا نصف تقنية نقل عابرة سريعة وفعالة في Echinococcus granulosus باستخدام الجيل الثالث من ناقلات lentivirus. لقد قمنا بزراعة البروتوسكوليتس في وسائط الثقافة ثنائية الطور للحصول على ديدان قوية وفقا لدراساتنا السابقة. يتم تطوير البروتوسكوليتس إلى الديدان القوية بعد ستة أسابيع من الثقافة المختبرية.
لوحظت مراحل مختلفة من المكورات الحبيبية في وسط الاستزراع ثنائي الطور، بما في ذلك البروتوسكوليكس الغازية، الشكل 2 أ، البروتوسكوليتس المتهرب منها، الشكل 2 ب، والديدان القوية، مع تكوين البروغلوتيد الأول والثالث، الشكل 2C من خلال E.Protoscoleces والديدان الستروبيلية التي تم الحصول عليها من الزراعة أحادية الطور وثنائية الطور، على التوالي، تم نقلها بواسطة فيروسات lentivirus المعبرة عن GFP، الشكل 3. عبرت خلايا HEK بوضوح عن GFP كتحكم عابر في عملية النقل. عبرت الديدان البالغة عن GFP بشكل أكثر وضوحا في الطبقة التيجومنتالية.
ومع ذلك ، فقد أظهرت البروتوسكوليتس مستوى أقل إلى حد ما من التعبير عن GFP بعد 48 ساعة. تسببت بعض بقايا سائل الكيس و / أو حطام الطبقة الجرثومية حول البروتوسكوليكس في بعض الخلفية الفلورية في العينات المنقولة. زادت شدة التألق في خلايا HEK والديدان القوية بعد 24 و 48 ساعة.
يعد فهم الأساس الجزيئي للديدان الخيطية وبيولوجيا Platyhelminthes أحد أهم الحدود في إمراض الطفيليات الحيوانية المنشأ. ويشكل عدم وجود نظام فعال لتقييم الجينات عقبة رئيسية أمام التفسير المباشر للوراثة الوظيفية للطفيليات المشقوقة، بما في ذلك أنواع المشوكات المشوكة. كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو توضيح عملية نقل ناقلات الفيروسات الخيطية التي ستكون حاسمة في أبحاث داء المشوكات في المستقبل.
وتظهر النتائج أن الديدان القوية أكثر استجابة للانتقال العابر للجين من البروتوسكوليسيس ، والتي قد تكون نتيجة للبنية التيجومنتالية الواسعة في الأشكال القوية. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة النقل الفيروسي اللئيم ، فإن شدة التألق في البروتوسكوليكس متعدد الخلايا والديدان القوية عادة ما تكون أقل بكثير من خلايا HEK أحادية الطبقة. هناك حاجة ملحة للبحوث الجينية التطبيقية على المستويين الجينومي والنسخ للمشوكات وكذلك مجموعة واسعة من أنظمة نماذج الدودة المسطحة الطفيلية والحية الحرة.
لذلك، فإن تطوير عملية نقل الجينات إلى الديدان الشريطية يمهد الطريق للاستخدام المحتمل للتقنيات الجديدة مثل رسم خرائط الجينات القائمة على الفيروسات أو تحرير الجينات بوساطة كريسبر-كاس9. يقدم هذا العمل النقل الفيروسي في نموذج الدودة الشريطية ويظهر نتائج واعدة مع تأثير محتمل على بيولوجيا الدودة المسطحة. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات المتعمقة لتحسين الأساليب وتطوير إمكانية تطبيق هذه التقنيات للتجارب المستقبلية.
