الكتاب نود أن نشكر هاريس كامي للتصميم التمهيدي، أشلي ماكيبون وجيسيكا توماس-أبيت للتصوير، وجون بلاكلي، ألكسندرا فولي-أبي، كريس ﻻنغلي، لويس جولي، ماكنتاير كيلسي، أشلي ماكيبون، الله كريس وروزي الكلب للظهور في فيديو. أ. م. ك. تدعمها "المؤسسة الكندية لأبحاث مرض لايم"، وتم توفير التمويل مشروع العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). م. ك. ب دبليو تلقي راتب التمويل من مؤسسة نيو برونزويك الابتكار (نبيف).

1-الحمض النووي في معزل عن القراد
<ol><li>الحصول على علامات التجزئة عن طريق الجمع الميداني، أو المراقبة السلبية من الأطباء البيطريين وأفراد الجمهور. ينبغي قتل بتجميد القراد، ووضعها في كيس مختوم، وترسل في درجة حرارة الغرفة.<ol>
<li>باستخدام نموذج الطلب، جمع المعلومات المتعلقة بالتاريخ والموقع الجغرافي للقاء، والتجزئة مرفق مركز الأنواع المضيفة، والأخيرة من تاريخ السفر من البلد المضيف.</li>
		<li>منذ PCR متداخلة أصلاً عرضه للتلوث، ضمان أن يتم إعداد مساحة العمل المختبري لتقليل التعرض عبر العينات. وهذا ينطوي على تنفيذ العناصر المختلفة للبروتوكول في مساحات منفصلة، مكرسة أيضا معزولة عن بعضها البعض تماما تنظيفها وتعقيمها، وضمان أن جميع الصكوك خالية من الملوثات.</li>
		<li>وعند استلام العينة، صورة القراد وتحديد الأنواع ومرحلة النمو والجنس وحالة تحفل بالمقارنة تعريف مفتاح32 .</li>
		<li>تحت ظروف معقمة، تقسم القراد باستخدام شفرة حلاقة العقيمة أو مشرط، ومكان الشظايا اثنين القراد في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لاستخراج الحمض النووي المجموع، استخدم أي إجراء العزل التي تسفر عن القالب المتوافق مع بكر؛ هذا البروتوكول يدل على نهج القائم على الخلبية بسيطة.<ol>
<li>ابدأ بإضافة بحجم مناسب (غالباً ما بين 50-200 ميليلتر) كاشف الخلبية الحال إلى الجزء القراد. المبلغ المحدد سوف تعتمد على حالة الحجم وتحفل العينة؛ المبادئ التوجيهية ينبغي أن توفرها الشركة المصنعة. مجانسة باستخدام مدقة microtube.</li>
		<li>احتضان عينات في حمام مائي عند 60 درجة مئوية 45 دقيقة، ودوامه بإيجاز.</li>
		<li>الطرد المركزي عينات لدقيقة 4 في 16,276 س ز (13,300 لفة في الدقيقة) في ميكروسينتريفوجي سطح مكتب.</li>
		<li>نقل المادة طافية microtube الطازجة، المسماة التي تحتوي على 50 ميليلتر الايزوبروبانول، مزيج من انعكاس، وإعادة الطرد المركزي كما هو الحال في (1.2.3).</li>
		<li>صب المادة طافية، وشطف بيليه الحمض النووي مع 50 ميليلتر من الإيثانول 70%.</li>
		<li>إزالة الزائدة الإيثانول مع ماصة، والسماح لبيليه أيردري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>ريسوسبيند الحمض النووي وإضافة 50 ميليلتر من 1 مم تريس pH 7.0، واحتضان عينات في حمام مائي ح 1 في 60 درجة مئوية. ويمكن الآن تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية للتحليل الجزيئي في المستقبل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-كشف بكر البورليه القانوني و شحممتداخلة.
ملاحظة: لمحة عامة بكر المبادئ والممارسات توفرها لورينز، 201233.
<ol><li>توليف أو الحصول على البورليه اليغنوكليوتيد الخارجية والداخلية الخاصة بالجينات الإشعال. انظر الجدول 1 لمجموعات التمهيدي وأحجام أمبليكون كل منهما، ودرجات حرارة ذوبان.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>اسم الدليل</td>
			<td>الجينات المستهدفة</td>
			<td colspan="2">تسلسل (5 '-3')</td>
			<td>حجم أمبليكون</td>
			<td>درجة حرارة انلينغ</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم بمهاجم</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">جكاتكاكتتكاججتكتكا</td>
			<td rowspan="2">503 بي بي</td>
			<td rowspan="2">55 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم خارج Rv</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">تجججاكتجاتاجككتج</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم في مهاجم</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">كتتاجاجتكاتجتجاج</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم في Rv</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">تكاتجككاتجكاجاتجت</td>
		</tr>
<tr>
<td>مهاجم خارج القانوني</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">كتجاجتتتكااجاجات</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>رف خارج القانوني</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">كاكتجكتجاككككتكتات</td>
		</tr>
<tr>
<td>القانوني في مهاجم</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">أكاجاجكاجاكجاككاج</td>
			<td rowspan="2">350 شركة بريتيش بتروليوم</td>
			<td rowspan="2">58 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>القانوني في Rv</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">تجتجككاتتجاجتكجتا</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: كبسولة تفجير الداخلي والخارجي نبكر البورليه بورجدورفيريفلاب والقانوني. في الواقع، كشف كبسولة تفجير شحم بورجدورفيري ب س. س. والآخر ارتباطاً وثيقا جينوسبيسيس البورليه ، بينما الإشعال القانوني التقاط فقط بورجدورفيري س. س. تشير إلى التضخيم من كلا المكاني باء burgdorferi. س. س.
<ol start="2"><li>قبل تعقيم خزانة PCR مع الأشعة فوق البنفسجية من الضوء و 70% من الإيثانول. ملاحظة: لتقليل التلوث المحتملة بعينه، ينبغي أن تكون مميزة من موقع تشريح القراد، استخراج الحمض النووي، وهلام التفريد مساحة العمل هذه.<ol>
<li>لتشغيل بكر الأولى، استخدام الإشعال الخارجي بالتزامن مع قالب الحمض النووي استرداد في الخطوة 1، 0 أعلاه، وإعداد رد فعل الخليط كما هو موضح في الجدول 2. في موازاة ذلك، أداء إيجابيا يعمل التحكم تتألف من التحقق من البورليه الحمض النووي، وتشغيل المراقبة السلبية بما في ذلك ردود الفعل لا قالب للكشف عن التلوث الكاشف والهباء الجوي. إضافة الحمض النووي في النهاية إلى تقليل التلوث المحتملة من الكواشف. ضمان كل أنبوبة مغلقة في جميع الأوقات عندما لا يتم إضافة الكواشف وإغلاق الأنابيب فورا بعد إضافة الحمض النووي، وقبل أن يتم فتح أنابيب أخرى.</li>
		<li>برنامج cycler حرارية النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الصلب درجة الحرارة لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية ل 45 s؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ وعقد في 4 درجات مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إجراء الجولة الثانية من PCR مشابهة لأول رد فعل، فيما عدا استخدام كبسولة تفجير الداخلية مع 2 ميليلتر من أول منتج PCR (المنتجة في 2.2.2). ملاحظة: حجم رد الفعل مرة أخرى ترد في الجدول 2. ويجب الحرص على تجنب التلوث عبر من أمبليكونس بضمان أن تتم إضافة الحمض النووي قالب آخر وأن أنابيب فقط تناظر عينة واحدة مفتوحة في وقت واحد. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>المكون</td>
				<td>بكر # 1 وحدات التخزين</td>
				<td>بكر # 2 وحدات التخزين</td>
			</tr>
<tr>
<td>بوليميراز ماجستير بوليميريز ميكس 2 X</td>
				<td>ميليلتر 12.5</td>
				<td>ميليلتر 12.5</td>
			</tr>
<tr>
<td>المياه خالية من نوكلاس</td>
				<td>ميليلتر 8.5</td>
				<td>ميليلتر 8.5</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 ميكرومتر كبسولة تفجير للأمام وعكس</td>
				<td>الإشعال الخارجي ميليلتر 1.0</td>
				<td>كبسولة تفجير داخلية ميليلتر 1.0</td>
			</tr>
<tr>
<td>قالب الحمض النووي</td>
				<td>ميليلتر 2.0، من استخراج عينة (1.2.7)</td>
				<td>ميليلتر 2.0، من جولة 1 من بكر (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
الجدول 2: بكر خليط من رد فعل لإيضاحات مسهبة الأولى والثانية. 
	 
	<ol>
<li>برنامج cycler الحرارية كما كان من قبل، ولكن ضبط درجة الحرارة انلينغ لاستيعاب الإشعال الداخلية (انظر الجدول 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-[اغروس] هلام التفريد والتصوير
ملاحظة: للحصول على الإرشادات الأساسية حول فصل الحمض النووي بالتفريد، راجع لي et al., 201234.
<ol><li>إعداد 1.2% [اغروس] هلام استخدام 20 "س س" العازلة (0.2 M هيدروكسيد الصوديوم، 0.8 متر الماء المقطر pH 8)، يخفف إلى 1 X، وإضافة حوالي 5 ميليلتر من وصمة الحمض النووي، قبل سكب، إذا قبل تلطيخ جل هو المطلوب.</li>
	<li>تحميل 10 ميليلتر للمنتج من رد فعل بكر (الداخلية) الثانية من كل التجريبية ونموذج عنصر تحكم، جنبا إلى جنب مع سلم bp 100 (5 ميليلتر).<ol>
<li>اليكتروفوريسي على ح 1 107 الخامس (5 فولت/سم).</li>
	</ol>
</li>
	<li>عرض وتوثيق الجل باستخدام ترانسيلوميناتور والكاميرا المرتبطة بها والبرمجيات.</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

على مدى عقود الاستخدام، أثبتت التقنيات المستندة إلى بكر ثبات قيمتها في الكشف عن البورليه من العينات المفصلية والثدييات، سواء البورليه تأتي من أصول بيئية أو السريرية. بكر يقدم العديد من التحسينات على نهج موجود مسبقاً للمراقبة. جدير بالذكر أن لا يعتمد على تطوير وأداء الكواشف الأجسام المضادة، وبدلاً من ذلك يمكن بسهولة تكييفها للكشف عن أهداف جديدة للاهتمام ببساطة عن طريق تعديل تسلسل التمهيدي. بكر يستوعب أيضا تقييم مواقع متعددة في نفس الوقت، أما بصورة مستقلة أو عن طريق فعل متعدد. يمكن تطبيقها على المدخلات العينة المتنوعة، بما في ذلك القراد الطازجة والمحفوظة في الأرشيف22والحيوان أو سوائل الجسم البشري والأنسجة مستأصل25. كما غلة بكر أمبليكونس التي يمكن معالجتها بالمزيد، على سبيل المثال بهضم إنزيم التقييد أو التهجين مسبار أو التسلسل، زيادة التبصير الهوية الميكروبية21.
كأداة سريرية، بكر الأفضل نظرياً إلى تشخيص المصلية القياسية، كما أنها توفر إشارة مباشرة لوجود البكتيريا، بدلاً من الاعتماد على الاستجابة المناعية المضيف كتدبير ثانوي للإصابة. بيد بوريليوسيس لايم يرتبط بعبء الميكروبية متواضعة نسبيا (< الكائنات 50/مل من البول أو البلازما) والنتائج سبيروتشيتيميا عابرة، الذي يمكن أن يؤدي إلى سلبية زائفة25. حساسية هذا الأسلوب في العيادة يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لنوع النسيج، المرحلة من العدوى، والشرط عينة، التي تقع بين 12.5% و 62% في الدراسات الحالية للدم والسائل النخاعي، وفحص الأنسجة36. حساسية الجزيئية القيود ليست مصدر قلق إذا PCR يجري بعد ثقافة البكتيرية، بيد أن استعادة اللولبية قابلة للاستمرار من العينات السريرية أثبتت كذلك تحديا. إلا في الآونة الأخيرة قد تم تحسين البروتوكولات لأعلى غلة35. وفي الوقت نفسه، القناة الهضمية التجزئة الكبار المصابين يمكن إيواء في المتوسط في أي مكان من 000 2 إلى أكثر 50,000 البورليه37،38،39، وقوة داخل نطاق الكشف نبكر. وهكذا، البروتوكول مناسبة تماما لجهود المراقبة القراد.
وعلى الرغم من مزاياها العديدة، نبكر تطرح بعض التحديات، وقدرة هذه التقنية على تقرير دقيق الإصابة بالقراد ولذلك تعتمد على التحديد الاستراتيجي للجينات وأمبليكونس، ومهام سير العمل التجريبية الدقيقة التي استرداد نوعية الحمض النووي من العينات مع تقليل التعرض عبر العينات، واستخدام عناصر التحكم المناسبة التي يمكن تقرير الملوثات في البيئة المختبرات والمواد الكاشفة. قبل أي التجريب، نطاق والنوايا للتحقيق ينبغي تحديد بوضوح حتى أن المكاني الوراثية المناسبة، ومناطق فيها، يمكن تحديدها. إذا كان الهدف توفير على شاشة غير منحازة س يسبب لايم البورليه burgdorferi المعقدة، ينبغي إنشاء كبسولة تفجير للكشف عن كافة سلالات المقترنة مع تقارب مماثل وكفاءة التضخيم، دون التقاط لا علاقة لها 25من الكائنات الحية. يمكن تصميم كبسولة تفجير جديدة والمقررة في السيليكون باستخدام أدوات البرمجيات مثل انفجار التمهيدي40، على الرغم من أنها ينبغي أيضا التحقق من صحة تجريبيا ضد مرجعية معيارية يعزل قبل تطبيقه على عينات أونتشاراكتيريزيد. والهدف من هذا الإجراء استخراج الحمض النووي لاسترداد قالب الميكروبية سليمة من عينة بيئية مختلطة (علامة هوموجيناتي). خطوة اختيارية قبل المتابعة مع بكر لتقييم سلامة الحمض النووي المستخرج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد ردود أفعال موازية لاستهداف جين التدبير المنزلي في القراد. الأسلوب الأخير يمكن أن تشير أيضا إلى وجود مثبطات في خليط رد فعل، توفير زيادة الثقة بأن ردود الفعل السلبية البورليه نظراً لغياب الكائن الحي، وعدم وجود ملوث المثبطة.
زيادة الحساسية للنهج PCR متداخلة يأتي على حساب تلوث محتمل أن يولد نتائج إيجابية كاذبة. يمكن إدخال قالب خارجية بعينه أثناء تشريح القراد والانتعاش الحمض النووي، أو عملية إعداد ردود فعل التضخيم الخارجي والداخلي. ولذلك المهم خصوصا لاتباع أفضل الممارسات بروتوكولات لبكر لتجنب قالب أو amplicon التلوث المتبادل. هذه تشمل استخدام محطات عمل منفصلة مع أيرفلووس المستقلة، والاحتواء في بكر وخزانات السلامة البيولوجية، حسب الاقتضاء، شاملة الكيميائية والفيزيائية تنظيف وتعقيم الأسطح والمواد الكاشفة، والتعامل مع الحذر من الحمض النووي 41-عناصر القالب لا أيضا حيوية في تحديد تلوث كواشف الأسهم. مشكلة عدم حصانة خاصة نبكر amplicon المناولة التي تحدث عند نقل المنتجات من أول رد فعل في السفينة PCR الثانية. منذ الهدف الحمض النووي وقد خضع بالفعل تخصيب الأسى في عينات إيجابية، هذه الخطوة لا سيما المعرضة للتلوث عبر، وقد تم وضع بروتوكول نبكر أنبوب واحد للالتفاف حول هذا القيد. في هذا النهج، يتم إضافة مجموعتي كبسولة تفجير لجين معين معا إلى أنبوب رد فعل التي تظل مختومة لكل جولات PCR31. يجب أن تكون أزواج التمهيدي الخارجي والداخلي [ثرمودنميكلي] مميزة، مثل أن الزوجين الخارجي يضاعف القالب عند درجة حرارة انلينغ عالية باهظة للإشعال الداخلية. في الجولة الثانية، هو خفض درجة الحرارة انلينغ لاستيعاب الزوج الداخلية. ليس فقط هل هذا تجاوز خطوة يحتمل الخلط، ويسمح أيضا استخدام إضافية تدابير مكافحة التلوث31،42. إلا أن هذا التعديل قد التضحية ببعض الحساسية المقايسة. بغض النظر عن النهج، زيادة عدد replicates التقنية التي تجري بشكل مستقل على عينة سوف يساعد على تحديد التلوث زائفة.
ظلت تتطور منذ إدخال نبكر التقنيات الجزيئية، وهذه النهج الجديدة توفر مزايا تحديد أكثر التصاميم الأصلية، أن كان ذلك في زيادة المصروفات المالية. وكما يوحي اسمها، PCR الكمي (الوقت الحقيقي أو qPCR (RT)-PCR) يسمح لتعداد الكائنات الممرضة في عينة، بينما نوعي في طبيعة43التقنيات التقليدية. حساسية قبكر يشبه يقال أن نبكر38، على الرغم من أنه يمكن أن تتقلب تبعاً للخصائص التمهيدي28. كما أظهرت تباين qPCR يستخدم منارات الجزيئية (ميغابايت) بدلاً من التقليدية تكمان المسابير الوعد في الكشف عن البورليه في العينات السريرية44،،من4546. بسبب هيكلها الثانوي فريدة من نوعها، إنتاج منارات الجزيئية يقال أن أقل الخلفية الفلورية وإشارات شرعية أعلى، مما يوفر حساسية فائقة47. توحي التقييمات قبل السريرية عتبة كشف محتملة بين واحد وعشرة اللولبية44،45. وعلاوة على ذلك، التقنية قد طبقت بنجاح في التفاعلات المتعددة في نفس الوقت كشف جينات مضيف الثدييات44 والأخرى المسببة للأمراض التي ينقلها القراد45، وما لا يمكن تحقيقه سهولة مع نبكر. وتشمل تعديلات التصميم الأخرى الحبرية بكر (دبكر) التكنولوجيا الرقمية، التي يمكن تحديدها كمياً الحمض النووي دون استخدام39،المنحنى المعياري48. الحد الأدنى للكشف عن هذا الأسلوب البورليه بالمثل نحو عشر عينة اللولبية/39. مقارنة نبكر، هذه النهج قد أيضا استفادة إمكانات المخفضة للتلوث، كما أنها تتطلب فقط بروتوكول واحد تضخيم.
إذا كان هدف المراقبة بدلاً من ذلك على التشكيل الجانبي محتويات علامة البكتيرية المتنوعة، هو فحص الجينومية الرنا الريباسي 16S خياراً جذاباً49. على الرغم من أن هذا النهج هو أكثر تكلفة ويتطلب التعاقب الحمض النووي المتخصصة غير موجودة في جميع مختبرات البيولوجيا الجزيئية ويقتضي التفسير القائم على المعلوماتية الحيوية أكثر تطورا، فإنه يمكن التقاط مجموعة واسعة من الجراثيم لأكثر دقة ويمثل الحمل الممرض ناقل.
بينما قبكر ومشتقاته أساليب الاختيار للتطبيقات الكمية، وشاشات metagenomics توفر مخزونات واسعة من ميكروبيومي التجزئة، جهود المراقبة المستهدفة غالباً ما تعني بثنائي الإبلاغ عن وجود أو عدم وجود عوامل ممرضة واحدة أو عدد قليل في ناقل. في ظل هذه الظروف، قد يعرض هذه النهج أحدث وأكثر تفصيلاً تعقيد لا لزوم لها والعبء المالي في العملية. ولهذه الأسباب، قد نبكر صمدت لاختبارات الزمن كأسلوب رئيسي في تجزئة الاختبار.

مرض لايم (LD) هو الأكثر شيوعاً العدوى المنقولة في نصف الكرة الشمالي، ويواصل انتشاره زيادة1. بسبب هذا المرض الموهن مسببات الأمراض سبيروتشيتيل لايم borreliosis (رطل) معقدة (يشار إلى البورليه burgdorferi بالمعنى الواسع، أو س)، الذي يضم تاريخيا الممرض أمريكا الشمالية الغالبة، ب burgdorferi معناها الحرفي (ما)، بالإضافة إلى أفزيليي و جاريني باء، الذي يتم على نطاق واسع في جميع أنحاء أوروبا وآسيا، وهي الأنواع الناشئة أهمية سريرية2،3. تنتقل هذه البكتيريا إلى الإنسان عن طريق لدغة القراد Ixodes المصابة2. على الرغم من أن ناقلات أمريكا الشمالية الرئيسية هي سكابولاريس أولاً و باسيفيكوس أولاً، وجدت الأنواع متعددة داخل هذا جنس للمرفأ، ويحيل بكتيريا4. في البشر، ويمكن أن يسبب بورجدورفيري باء- إطار الأعراض التي تؤثر على الجلد، والمفاصل، والقلب والجهاز العصبي، الغدد الصماء، الجهاز الهضمي، والأجهزة الداخلية5،،من67، 8،،من910. حاليا تقديرات مركز السيطرة على الأمراض والوقاية 300,000 أكثر حالات بشرية جديدة سنوياً في الولايات المتحدة11،12. في حين غالباً ما التشخيص مواتية عند المرض يتم تشخيصه وعلاجه في المراحل المبكرة، اقترحت الدراسات في أي مكان بين 10 في المائة و 60 في المائة من المرضى الذين تلقوا نظام صادات الموصى بها التي ظلت تواجه الأعراض بعد العلاج وقف، في ظاهرة تسمى وظيفة علاج مرض لايم مرض (بتلدس)13،،من1415. وعلاوة على ذلك، التأخر في التدخل السريرية يمكن أن تنشأ نتيجة لنقص الوعي بلدغة القراد، العرض التقديمي غير محددة للمرض الأولى، وانخفاض حساسية التشخيص التقليدية المستندة إلى علم الأمصال عند استخدامها في بداية العدوى. فشل لعلاج سريع ومناسب يتيح تطور الأعراض التي يمكن أن تظهر في متزايد المنهكة مضاعفات16،17. وللوقاية من مرض لايم حجر زاوية في إدارة المخاطر. استراتيجيات لمكافحة هذا التهديد المتزايد وتشمل تدابير المراقبة قوية تشير إلى أن انتشار الكائنات الممرضة في القراد، وتحديد المناطق الجغرافية من القلق.
يوضح هذا المقال فائدة متداخلة البلمرة المتسلسل (نبكر) كأداة فحص جزيئي بموجبه تحديد القراد المصابة. لزيادة الدقة، تستخدم اثنين من الجينات البورليه التضخيم موازية. فلاجيلين ب (شحم) يشفر بروتين خيوط رئيسية من السوط18، والجين الموجود على كروموسوم خطي واحدة، بينما المنتج بروتين دهني بروتين السطح الخارجي A (القانوني) يتوسط الأمامي القراد الاستعمار، وهو ترميز بلازميد19،20. يتكون سير العمل من مجموعة التجزئة، واستخراج الحمض النووي، ومن ثم إجراء جولة أولى من PCR للكشف عن البورليه-مواضع محددة. يستخدم PCR اللاحقة المنتج من أول رد فعل كقالب جديد لتوليد شظايا التضخيم أصغر حجماً والداخلية. يعتبر علامة إيجابية البورليه burgdorferi عندما أمبليكونس الداخلية من كلا الجينات البورليه يمكن الكشف عنها بواسطة [اغروس] هلام التفريد.
تقنية نبكر، و شحم وأهداف الجينات القانوني ، وقد استخدمت على نطاق واسع للمراقبة الإيكولوجية والكشف السريري ل spirochete لايم منذ أوائل التسعينات21،،من2223 ،،من2425. قبل وضع بروتوكولات الجزيئية، قيمت القراد بإخضاع محتويات القناة الهضمية لمضاداتالبورليه تلطيخ الفلورة (إذا كان) أو الثقافة الميكروبية، أو مزيج منها26. هذه النهج تعاني من القيود الكامنة، بما في ذلك بطء النمو وطبيعة الحساسية البورليه27وجسم مشاكل الأداء، وشرط القراد يعيش لحالة تجهيز21. بكر اعتمد لاحقاً تقديم تعريف الناقلة المصابة حساسة وسريعة ومحددة. أنه يوفر تحسينات ملحوظة على المنهجية التقليدية، بما في ذلك ثقافة مستقلة التطبيق المباشر لأنواع العينات المتنوعة، مثل القراد الميت والمؤرشفة التي لولا ذلك غير مناسب لاختبار21،22 . تصاميم تجريبية المتداخلة في مواصلة تحسين على خصوصية وحساسية PCR الكلاسيكية باستخدام مجموعتين متميزة من الإشعال الخاصة بالجينات في جولتين متتاليتين من التضخيم25،28.
نجاح التجربة اعتماداً كبيرا على تصميم التحديد و amplicon الجينات الاستراتيجية. دقة تقدير وجود البورليه burgdorferi، كبسولة تفجير ينبغي الكشف عن مسببات الأمراض ذات الصلة دون كروسريكتينج بالحمى الراجعة اللولبية في جنس البورليه أيضا. في حالة شحم، وخصوصية هذا يتحقق من خلال استهداف منطقة داخلية متغير من الجينات، بدلاً من تسلسل ترافقه المصانة نسبيا التي يشترك فيها البكتيريا المتنوعة (الشكل 1)24،29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> رقم 1: مفهوم نبكر، كما هو موضح باستخدام البورليه شحم الجينات كهدف. تيرميني 5 'و 3' الجينات شائعة للكائنات الحية خارج البورليه burgdorferi س. ل.، مما يجعل هذه المناطق غير مناسب لتقييم العوامل الممرضة المسببة لايم محددة. باستخدام تسلسل الداخلية التي حفظت أقل كأهداف التمهيدي، يتم تنفيذ جولتين من PCR للكشف عن أمبليكون النهائي، والداخلية. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
في اختبار قدرتها التمييزية، ويقيم ما يزيد على 80 يعزل البورليه مختلفة الداخلية شحم الإشعال، ووجدت لتحديد فقط تلك المرتبطة بمرض لايم24. وقد تم توثيق الحد الأدنى للكشف نبكر في بين ستة24 والبكتيريا31 عشرة من ثقافة نقية، على الرغم من أن يمكن زيادة تحسين الحساسية من النشاف في أمبليكون الجنوبية، والتهجين راديولابيليد أو التحقيق تشيميلومينيسسينت. اقتران التقنيات يقلل من عتبة الكشف إلى قرص واحد سبيروتشيتي31. بالمقارنة المباشرة، تم العثور على بكر واحد-الجولة التقليدية، أونبروبيد تقرير وجود حد أدنى من 104 اللولبية31. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أقل حساسية الفحص عند العمل مع العينات السريرية والبيئية المعقدة، نظراً لوجود الساحقة لا علاقة لها الحمض النووي والمواد المثبطة المحتملة. هذه التحديات يمكن التحايل عليها إلى حد كبير عن طريق استخدام نبكر.
وعلى الرغم من أوجه التقدم في التكنولوجيا الجزيئية في العقود الماضية، يظل نبكر تقنية التدبيس في جهود المراقبة الحديثة. إذا هو الحرص في تصميم وتنفيذ هذا البروتوكول، نهج قوية وقابلة للتكيف، وبسيط نسبيا لالتقاط وجود مسببات الأمراض في ناقلات التجزئة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

مرض لايم هو عدوى المنقولة خطيرة بسبب الضيق البورليه burgdorferi أسرة لاتو اللولبية التي تنتقل إلى الإنسان عن طريق لدغة القراد Ixodes المصابة. أن عامل المسببة الأولية في أمريكا الشمالية معناها الضيق البورليه burgdorferi . توسيع مناطق المخاطر الجغرافية، فإنه من الحكمة لدعم برامج المراقبة القوية التي يمكن قياس معدلات الإصابة بالقراد وإبلاغ النتائج إلى الأطباء والأطباء البيطريين، وعامة الجمهور. تقنية جزيئية متداخلة البلمرة المتسلسل (نبكر) منذ فترة طويلة تستخدم لهذا الغرض، ويبقى اتباع نهج المركزية، وغير مكلفة والقوية في الكشف عن البورليه في القراد والحياة البرية.
يوضح هذا المقال تطبيق نبكر القراد مقتطفات الحمض النووي لتحديد العينات المصابة. دولتين مستقلتين بورجدورفيري باء- الأهداف، الجينات ترميز فلاجيلين ب (شحم) و بروتين السطح الخارجي A (القانوني)، وقد استخدمت على نطاق واسع مع هذا الأسلوب. البروتوكول يشمل جمع التجزئة، واستخراج الحمض النووي، ومن ثم إجراء جولة أولى من PCR للكشف عن كل من هذين البورليه-مواضع محددة. يستخدم اللاحقة البلمرة المتسلسل (PCR) المنتج من أول رد فعل كقالب جديد لتوليد شظايا التضخيم أصغر حجماً والداخلية. يحسن هذا النهج المتداخل على خصوصية وحساسية PCR التقليدية على حد سواء. ويعتبر علامة إيجابية بالنسبة لمسببات المرض عندما أمبليكونس الداخلية من كلا الجينات البورليه يمكن الكشف عنها بواسطة [اغروس] هلام التفريد.

نبكر نهج أنيقة لزيادة خصوصية وحساسية للكشف عن مسببات الأمراض، لا سيما عندما يجري التحقيق في العينات البيئية المعقدة. كما هو مبين في الشكل 1، جولتين من PCR استهداف منطقة استراتيجية موضع شحم البورليه (و القانوني، لا في الصورة) يمكن تقرير وجود البكتيريا البورليه burgdorferi من خلال توليد الداخلية قصيرة أمبليكونس. عندما تحل بالتفريد هلام، نواتج التفاعل شحم و القانوني من كل علامة يمكن بصريا وسجل ومقارنته مع عناصر التحكم. في الشكل 2، تتوفر معرفات فريدة من نوعها العينة على طول الجزء العلوي من كل جيل، ولا-قالب والهباء الجوي يتم تمثيل عناصر التحكم في أقصى اليسار واليمين، على التوالي، المتاخمة للسلالم.
عصابات أمبليكون قوية تتجلى بوضوح في تحديد العينات التجريبية، وتمييزها بسهولة من كبسولة تفجير الفائض والمتبقي الحمض النووي (الشكل 2). استناداً إلى مبادئ التصميم التجريبي، علامة تعتبر إيجابية البورليه عندما موازية إثبات عناصر سلبية لا التضخيم، وتنتج أمبليكونس الداخلية من الإشعال شحم و القانوني على حد سواء. وفي هذه الحالة، اجتمع العينات T907 و T604 و T606 معايير المراقبة لمسببات المرض لايم (الشكل 2). By contrast، لم يكن إلا T923 الإيجابية القانوني، نتيجة التي توجد عدة تفسيرات محتملة: A) القراد المنشأ كان سلبيا بالنسبة البورليه، ولكن إعداد PCR القانوني الخارجي أو الداخلي أيامهم كانت ملوثة قالب الحمض النووي (علما بأن التلوث المنهجي من الكواشف استبعد عبر عناصر سلبية)، ب) القراد لايم البورليه، ولكن كميات منخفضة من قالب أو خطأ تجريبي منعت التضخيم من شحمأو ج) كائن حي كان حاضرا التي الواردة في التسلسل القانوني مصانة، ولكن تفتقر إلى فلاجيلين أو كانت الهوية غير كافية في المنطقة المستهدفة من شحم يصلب لكبسولة تفجير. وفي الواقع، لوحظت التشابه التسلسل القانوني في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، بما في ذلك النباتات والحيوانات28. الحالة العكسية، تضخيم الأكثر حفظت فلاجيلين الجينات، ولكن ليس الجين القانوني ، يمكن الإشارة إلى أنواع البورليه ذات صلة. في الممارسة العملية، هذا البروتوكول تعطي نتائج إيجابية واحدة القانوني أكثر من القيام بالاشعال شحم ، مما يوحي بأن السيناريو 'A' هو التفسير الأقل احتمالاً. دون مزيد من التحليل التجريبي للعينة المثيرة للجدل، ومع ذلك، من غير الممكن تحديد المصدر بنتيجة إيجابية واحدة. قد تساعد زيادة عدد replicates التقنية التي أجريت على عينات ملتبسة للتوفيق بين وضعهم الحقيقي، إذ لن يكون أي الملوثات التي أدخلت أيامهم إلى ردود الفعل السابقة الموجودة في الحمض النووي المؤرشفة. بيد إذا كانت التفاعلات اللاحقة مع هذه الإشعال لا توفر نتائج قاطعة، المكاني البورليه أخرى يمكن التحقيق في PCR. يمكن أيضا تعيين تسلسل أمبليكونس المتولدة من ردود الفعل هذه ومقارنة بين يعزل للمساعدة في تعيين الهوية، وتقدير درجة الاختلاف سلالة. Sapi والزملاء تقديم مثال لسير العمل هذا باستخدام العينات السريرية البشرية35.
اعتبار جميع العوامل، معايير البروتوكول والتفسير المبين قد قدرت أن تحقق معدلات سلبية إيجابية وكاذبة كاذبة 0.17 في المائة و 0.0063 في المائة، على التوالي.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> الشكل 2 : الكشف عن البورليه burgdorferi في القراد الفردية التي نبكر من شحم و القانوني- يتم تمثيل الرموز المعينة إلى كل التجزئة عبر الجزء العلوي من المواد الهلامية، والهويات محاذاتها عمودياً تقرير كشف القانوني و شحم في كل عينة. الممرات المعنون ب إلى يسار عناصر التحكم في قالب لا تمثل الصورة، بينما الضوابط الهباء الجوي للقبض على تلوث البيئة مختبر (ممرات يد اليمنى). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR at JoVE.com

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

يعشق [بكر] هو تقنية حساسة ومحددة وواضحة يمكن تطبيقها للتجزئة استخراج الحمض النووي للتحقيق البورليه burgdorferi، المسبّب لمرض لايم. التجربة الأولية PCR يستخدم الإشعال الخاصة بالجينات لتوليد أمبليكونس طويلة، ثم تصبح قوالب لفعل لاحقة باستخدام كبسولة تفجير الداخلية.

الكشف عن مرض لايم Spirochete، البورليه Burgdorferi، في القراد باستخدام PCR متداخلة

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.8K Views.  Mount Allison University. يعشق [بكر] هو تقنية حساسة ومحددة وواضحة يمكن تطبيقها للتجزئة استخراج الحمض النووي للتحقيق البورليه burgdorferi، المسبّب لمرض لايم. التجربة الأولية PCR يستخدم الإشعال الخاصة بالجينات لتوليد أمبليكونس طويلة، ثم تصبح قوالب لفعل لاحقة باستخدام كبسولة تفجير الداخلي?...

Video: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

PCR Thermocycling السريع باستخدام الحراري الحرارية الميكروسكيل

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.