نشكر بإخلاص أعضاء مختبر بال للمساعدة في إعداد هذه التظاهرة. وأيد هذه الدراسة PHS المنح AI076684 من المعاهد الوطنية للصحة وAI080615 / المعدية.

1. Microinjection من القراد اللبود الكتفي Nymphal 1. إعداد الإبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال الإبر microinjection عدة عن طريق التسخين وسحب أنابيب زجاجية 1 ملم الشعرية (الآلات الدقيقة الدولي) في جهاز الزجاج مجتذب micropipette (Narishige). إزالة بعناية الأنابيب الشعرية الهشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحبت تخزين الإبر (مع تلميح تواجه التصاعدي) على شريط لاصق في طبق بتري. </li></ol> 2. إعداد B. burgdorferi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو باء burgdorferi BSK في ثقافة الإعلام 7 حتى عند تركيز من حوالي 10 7 خلايا لكل مليلتر. تحسب اللولبيات تحت المجهر داكنة الحقل باستخدام غرفة عد Petroff - Hausser (Hausser العلمية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه B. burgdorferi بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وطاف بيليه resuspend تماما في وسائل الإعلام عن طريق تمرير BSK بلطف من خلال microtip 200 ميكرولتر العقيمة إلى التركيز النهائي للخلايا في 10 9 مل. لأن معلق الخلايا في خلية كثافة عالية ، ويمكن أن تتجمع معا ، ينبغي أن تستخدم لتعليق الخلية microinjection على الفور. </li></ol> 3. إعداد القراد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واضح ، وشريط لاصق على الوجهين على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل على حصيرة لزجة ، وإزالة بعناية القراد nymphal من الحاوية باستخدام فرشاة صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العدد المطلوب من القراد ليتم حقنه في شريط لاصق ، حتى الجانب البطني ، التي تواجه نفس الاتجاه. </li></ol> 4. القراد عن طريق الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 5 ميكرولتر من B. burgdorferi الثقافة في إبرة الشعرية سحبت باستخدام 20 ميكرولتر microloader ماصة الحافة (إيبندورف). تفقد إبرة لفقاعات الهواء المحبوس وتحديث الإبرة مع الثقافة البكتيرية ، وإذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض القراد تحت المجهر مجهر تشريح والتركيز على مجال التجزئة في فتحة الشرج. اللمس بلطف رأس الإبرة الشعرية من أجل كسر الأنبوب حيث قطرها أصغر قليلا من فتحة الشرج والقراد ، وتشكيل microinjection الإبرة. هذه الخطوة الحاسمة لأن أي محاولة لحقن القراد مع طرف الإبرة غير مناسبة يسبب الوفاة والاصابة المحتملة للحقن القراد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان القراد يجمد تحت المجهر مجهر تشريح والتركيز على فتحة الشرج ، والتي تغطيها الصفيحتين الشرج المنقولة. باستخدام الملقط غرامة ، وتلمس برفق والضغط الخفيف جدا إلى أي منطقة بالقرب من فتحة الشرج. هذا سيسمح لوحات فصل الشرج وفتح المسام الشرج الذي يتصل الأمعاء. بعناية إدراج رأس الإبرة قليلا في فتحة الشرج من خلال فتح القسري لوحات الشرج. يجب أن تبقى غرز الإبرة إلى الحد الأدنى كما يمكن ان يلحق الضرر طرف زجاج نصف شفاف والمعى المؤخر الذي يتصل المستقيم. باستخدام microinjector مجهزة التحكم الآلي القدم (إيبندورف) ، وضخ B. burgdorferi حل باستخدام المعلمات التالية : 1000 hectopascals (هكتوبسكال) ضغط الحقن ، الحقن مرة ثانية 0.2 و 8 هكتوبسكال ضغط التعويض. كل علامة يتلقى حقنة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microinjection التالية ، يجب أن تتصرف القراد مشابهة لحالة ما قبل الحقن. على سبيل المثال ، ينبغي أن القراد الزحف استجابة للمؤثرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسمح عادة القراد لاستعادة لمدة 48 ساعة في غرفة البيئية التي حددت في 24 درجة مئوية مع 16 ساعة / 8 ساعات الضوء / الظلام نظام الإضاءة والرطوبة 95 ٪. إذا كانت الغرفة غير متوفرة ، يمكن تخزين القراد حقن في درجة حرارة الغرفة في ظروف رطبة داخل حاوية محكمة الغلق ، مثل مجفف الغرفة العادية. إذا لزم الأمر ، يمكن أيضا الانتعاش مرة من القراد يمكن اختصارها لبضع ساعات قبل استخدامها لتتغذى على الفئران. </li></ol> 2. باء burgdorferi التعريب بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر المناعي 1. تشريح القراد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة وضع قطرات من الفوسفات الملحي (PBS) على شريحة زجاجية نظيفة للتشريح ، وآخر على شريحة بولي - L - يسين المغلفة (سيجما) للفحص المجهري. إعداد شريحة أخرى من الزجاج مع شريط لاصق على الوجهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القراد من الحاويات ومكان على شريط لاصق على الوجهين باستخدام فرشاة صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض والتركيز على وضع علامة في مجهر تشريح. مكان شفرة حلاقة حادة على القراد بين الأزواج الأول والثاني من الساقين. اضغط لأسفل بشدة قطاعات التجزئة في قطعتين السماح بالوصول إلى البطن. على الفور ، يغرق في البطن في قطيرة من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط دقيق جدا ، والاستيلاء على ظهري وبطني الهيكل الخارجي حول موقع القطع. سحب بعناية الدرع الظهري وحتى بعيدا من القراد تعريض رتوج الأمعاء البني اللون. توخي الحذر للحفاظ على القراد في إطار برنامج تلفزيوني تشريح في جميع الأوقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شبه شفافة بن الغدة اللعابيةوتقع dles على جانبي المنطقة الأمامية للامعاء ، ويمكن إزالتها عند هذه النقطة ، إذا رغبت في ذلك. عقد الهيكل الخارجي المتبقية في مكان بالملقط ، وسحب بعناية الأمعاء الخروج من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف تنظيف القناة الهضمية من خلال إزالة أي أنسجة المحاصرين (على سبيل المثال ، القصبة الهوائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط غيض من الغرامة ، ونقل بسرعة في الأمعاء القراد بقطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة زجاجية بولي - L - يسين. فصل الأمعاء إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات غرامة أو الضغط برفق مع ملقط غيض من الغرامة. نضح بعناية PBS الزائدة حول أنسجة الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأنسجة الأمعاء في الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأمعاء القراد التي غمرت في الأسيتون لمدة 10 دقيقة. تسمح للهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين الشرائح في هذه الخطوة لعدة أشهر في -20 درجة مئوية في وعاء محكم الهواء. </li></ol> 2. تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المناديل الورقية ، وإزالة الرطوبة الزائدة حول الأنسجة ورسم دائرة حول الأمعاء القراد المجففة بواسطة القلم حلمة الثدي أو أي بطانة جدار الجهاز مسعور. وهذا سوف يساعد على الاحتفاظ الحلول تلطيخ خلال الخطوات اللاحقة الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية القناة الهضمية التجزئة مع واحدة أو بضع قطرات من حجب العازلة (0.05 ٪ توين - 20 ، مصل الماعز 5 ٪ في PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. المصل المستخدمة لحجب يعتمد على مصدر الحيوان المضيف للجسم. لا تسمح الشريحة لتجف من هذه النقطة إلى الأمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح ببطء العازلة حظر. احتضان الأمعاء مع الأولية المناسبة و / أو حلول الضد الثانوية. نستخدم فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -- المسمى مكافحة باء burgdorferi الأضداد (Kirkegaard ومختبرات بيري) في التخفيف 1:100 في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تغطية الحاويات برقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الأجسام المضادة التي تطلع لطيف. احتضان الأمعاء مع صبغة الفلورسنت لأنسجة القراد التسمية ، مثل 4 &quot;،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) أو يوديد propidium. نستخدم عادة 20 ميكروغرام / مل يوديد propidium (سيغما) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات مع 0.05 ٪ توين - 20 في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب شريحة في الجلسرين مخزنة تحتوي على كاشف antifade مثل Slowfade (Invitrogen) والغطاء بعناية مع ساترة الزجاج. ويمكن تخزين الشرائح في هذه الخطوة لبضعة أشهر في 4 درجات مئوية داخل حاوية محكمة الغلق. صورة وباء توطين burgdorferi تحت المجهر مبائر. </li></ol> 3. ممثل النتائج موقف لوضع علامة nymphal microinjection وصورة تمثل B. ويرد burgdorferi التعريب في الأمعاء التجزئة في الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/2544/2544fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. Microinjection وتوطين B. burgdorferi في الأمعاء القراد. (A) لعرض بطني أولا nymphal قراد الكتفي وضعه لmicroinjection. فتحة الشرج هو مبين (رأس السهم) مع إدخال إبرة microinjection (السهم) تحت التكبير في أقحم. ويستخدم forcep غرامة لتطبيق ضغط لطيف للجسم ، مما سمح لوحات فصل الشرج وفتح المسام لmicroinjection الشرج. يتم تعبئة الإبرة بمحلول الزرقاء Coomassie رائعة لتعزيز الرؤية. (B) عن نتائج الممثل التصوير المناعي مبائر باء burgdorferi داخل أمعاء القراد. يظهر المنطقة الأمامية من رتج الأمعاء. نوى الأمعاء واللولبيات (السهم) وصفت مع يوديد propidium (اللون الأحمر) أو FITC - مترافق المضادة B. - burgdorferi (اللون الأخضر) ، على التوالي. بار = 20 ميكرومتر.

<ol>
	<li>Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+Lyme+disease.">The emergence of Lyme disease.</a> J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).</li><li>Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T., Samuels, D. S., Radolf, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. , 353-405 (2010).</li><li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OspC+facilitates+Borrelia+burgdorferi+invasion+of+Ixodes+scapularis+salivary+glands.">OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands.</a> J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).</li><li>Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+OspA/B+in+the+life+cycle+of+the+Lyme+disease+spirochete.">Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete.</a> J Exp Med. 199, 641-648 (2004).</li><li>Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BB0323+function+is+essential+for+Borrelia+burgdorferi+virulence+and+persistence+through+tick-rodent+transmission+cycle.">BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle.</a> J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).</li><li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TROSPA,+an+Ixodes+scapularis+receptor+for+Borrelia+burgdorferi.">TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi.</a> Cell. 119, 457-468 (2004).</li><li>Barbour, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+Lyme+disease+spirochetes.">Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes.</a> Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference.">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tick+antioxidant+facilitates+the+Lyme+disease+agent's+successful+migration+from+the+mammalian+host+to+the+arthropod+vector.">A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector.</a> Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).</li><li>Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glass+capillary+tube+feeding:+a+method+for+infecting+nymphal+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+with+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).</li><li>Policastro, P. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+Ixodes+scapularis+larvae+(Acari:+Ixodidae)+by+immersion+in+low+passage+cultures+of+Borrelia+burgdorferi.">Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).</li><li>Fuente, d. e. l. a., Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks.">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هنا نظهر إجراء microinjection المستندة للعدوى سريعة وفعالة من القراد اللبود nymphal مع الممرض البكتيرية B. burgdorferi. وصفنا أيضا إجراء مبائر المناعي للكشف عن B. burgdorferi في الأمعاء التجزئة في الموقع. على الرغم من أن المظاهرة ينطوي على القناة الهضمية لدينا nymphal ، وإجراءا?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glass capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical glass puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser scientific</td>
<td>3900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>930001007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Femtojet microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>920010504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot control FemtJet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>920005098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>Filter-sterilized</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

methods for rapid transfer and localization of lyme disease pathogens within the tick gut

ويتسبب مرض لايم عن طريق العدوى مع الممرض burgdorferi البورلية ملتوية ، وهو الحفاظ على الطبيعة من قبل في دورة العدوى القراد القوارض 1. وقد تم تطوير نموذج التجزئة التي تنقلها الفئران 2 لدراسة مرض لايم في المختبر. بينما يمكن أن يصاب القراد السذاجة مع B. burgdorferi بواسطة إطعامهم على الفئران المصابة ، وعملية طرح الريش يستغرق عدة أسابيع أو أشهر ليكتمل. ولذلك ، وتطوير أسرع وأكثر كفاءة تقنيات عدوى التجزئة ، مثل إجراء microinjection المستندة إلى أداة هامة لدراسة مرض لايم 3،4. الإجراء يتطلب ساعات فقط لتوليد القراد المصابة ويسمح بالسيطرة على تسليم كميات متساوية من اللولبيات في فوج من القراد. هذا مهم خصوصا وأن الجيل باء القراد burgdorferi المصابة بواسطة عملية التغذية الطبيعية باستخدام الفئران فشل لضمان 100 ٪ نسبة العدوى والنتائج المحتملة في الاختلاف من عبء الممرض بين القراد فدان. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام microinjection تصيب القراد مع B. burgdorferi يعزل في الحالات التي يكون فيها سلالة موهنة غير قادر على إنشاء العدوى في الفئران ، وبالتالي لا يمكن الحصول عليها بشكل طبيعي عن طريق القراد 5. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لتقديم مجموعة متنوعة من المواد البيولوجية الأخرى في القراض ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة المحددة أو الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي مزدوج 6. في هذه المقالة ، سوف نظهر للmicroinjection من القراد مع nymphal في المختبر ، نمت B. burgdorferi. سوف نقوم أيضا تصف طريقة لتوطين مسببات مرض لايم في الأمعاء القراد باستخدام المجهر مبائر المناعي.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut at JoVE.com

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

دراسات بحثية لايم المرض غالبا ما تتطلب جيل من القراد المصابين burgdorferi البورلية الممرض ، وهي العملية التي عادة ما يستغرق عدة أسابيع. نحن هنا يبرهن على وجود عدوى قراد microinjection المستندة إلى الإجراء الذي يمكن أن ينجز في غضون ساعات. نظهر أيضا أسلوب المناعي للتوطين في الموقع من burgdorferi باء داخل القراد.

الطرق السريعة لنقل وتوطين مسببات المرض داخل القناة الهضمية لايم القراد

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

methods-for-rapid-transfer-localization-lyme-disease-pathogens-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K Views.  University of Maryland. دراسات بحثية لايم المرض غالبا ما تتطلب جيل من القراد المصابين burgdorferi البورلية الممرض ، وهي العملية التي عادة ما يستغرق عدة أسابيع. نحن هنا يبرهن على وجود عدوى قراد microinjection المستندة إلى الإجراء الذي يمكن أن ينجز في غضون ساعات. نظهر أيضا أسلوب المناعي للتوطين في ال...

Video: Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

منهجية لدراسة نقل أفقي جين في<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس ليسا من الأنسجة الثابتة الفورمالين

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

تصور الزائفة الزنجارية داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

القياس الكمي للأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح في متغيرات SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

تسليط الضوء على المؤلف: نظام فيروس من النمط الكاذب لتقييم المتغيرات الفرعية لأوميكرون وتحييد الأجسام المضادة في أبحاث SARS-CoV-2

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

تطبيق الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وتحييد الأجسام المضادة

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...