الكتاب نود أن نشكر هاريس كامي للتصميم التمهيدي، أشلي ماكيبون وجيسيكا توماس-أبيت للتصوير، وجون بلاكلي، ألكسندرا فولي-أبي، كريس ﻻنغلي، لويس جولي، ماكنتاير كيلسي، أشلي ماكيبون، الله كريس وروزي الكلب للظهور في فيديو. أ. م. ك. تدعمها "المؤسسة الكندية لأبحاث مرض لايم"، وتم توفير التمويل مشروع العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). م. ك. ب دبليو تلقي راتب التمويل من مؤسسة نيو برونزويك الابتكار (نبيف).

1-الحمض النووي في معزل عن القراد
<ol><li>الحصول على علامات التجزئة عن طريق الجمع الميداني، أو المراقبة السلبية من الأطباء البيطريين وأفراد الجمهور. ينبغي قتل بتجميد القراد، ووضعها في كيس مختوم، وترسل في درجة حرارة الغرفة.<ol>
<li>باستخدام نموذج الطلب، جمع المعلومات المتعلقة بالتاريخ والموقع الجغرافي للقاء، والتجزئة مرفق مركز الأنواع المضيفة، والأخيرة من تاريخ السفر من البلد المضيف.</li>
		<li>منذ PCR متداخلة أصلاً عرضه للتلوث، ضمان أن يتم إعداد مساحة العمل المختبري لتقليل التعرض عبر العينات. وهذا ينطوي على تنفيذ العناصر المختلفة للبروتوكول في مساحات منفصلة، مكرسة أيضا معزولة عن بعضها البعض تماما تنظيفها وتعقيمها، وضمان أن جميع الصكوك خالية من الملوثات.</li>
		<li>وعند استلام العينة، صورة القراد وتحديد الأنواع ومرحلة النمو والجنس وحالة تحفل بالمقارنة تعريف مفتاح32 .</li>
		<li>تحت ظروف معقمة، تقسم القراد باستخدام شفرة حلاقة العقيمة أو مشرط، ومكان الشظايا اثنين القراد في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لاستخراج الحمض النووي المجموع، استخدم أي إجراء العزل التي تسفر عن القالب المتوافق مع بكر؛ هذا البروتوكول يدل على نهج القائم على الخلبية بسيطة.<ol>
<li>ابدأ بإضافة بحجم مناسب (غالباً ما بين 50-200 ميليلتر) كاشف الخلبية الحال إلى الجزء القراد. المبلغ المحدد سوف تعتمد على حالة الحجم وتحفل العينة؛ المبادئ التوجيهية ينبغي أن توفرها الشركة المصنعة. مجانسة باستخدام مدقة microtube.</li>
		<li>احتضان عينات في حمام مائي عند 60 درجة مئوية 45 دقيقة، ودوامه بإيجاز.</li>
		<li>الطرد المركزي عينات لدقيقة 4 في 16,276 س ز (13,300 لفة في الدقيقة) في ميكروسينتريفوجي سطح مكتب.</li>
		<li>نقل المادة طافية microtube الطازجة، المسماة التي تحتوي على 50 ميليلتر الايزوبروبانول، مزيج من انعكاس، وإعادة الطرد المركزي كما هو الحال في (1.2.3).</li>
		<li>صب المادة طافية، وشطف بيليه الحمض النووي مع 50 ميليلتر من الإيثانول 70%.</li>
		<li>إزالة الزائدة الإيثانول مع ماصة، والسماح لبيليه أيردري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>ريسوسبيند الحمض النووي وإضافة 50 ميليلتر من 1 مم تريس pH 7.0، واحتضان عينات في حمام مائي ح 1 في 60 درجة مئوية. ويمكن الآن تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية للتحليل الجزيئي في المستقبل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-كشف بكر البورليه القانوني و شحممتداخلة.
ملاحظة: لمحة عامة بكر المبادئ والممارسات توفرها لورينز، 201233.
<ol><li>توليف أو الحصول على البورليه اليغنوكليوتيد الخارجية والداخلية الخاصة بالجينات الإشعال. انظر الجدول 1 لمجموعات التمهيدي وأحجام أمبليكون كل منهما، ودرجات حرارة ذوبان.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>اسم الدليل</td>
			<td>الجينات المستهدفة</td>
			<td colspan="2">تسلسل (5 '-3')</td>
			<td>حجم أمبليكون</td>
			<td>درجة حرارة انلينغ</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم بمهاجم</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">جكاتكاكتتكاججتكتكا</td>
			<td rowspan="2">503 بي بي</td>
			<td rowspan="2">55 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم خارج Rv</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">تجججاكتجاتاجككتج</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم في مهاجم</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">كتتاجاجتكاتجتجاج</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>شحم في Rv</td>
			<td>شحم</td>
			<td colspan="2">تكاتجككاتجكاجاتجت</td>
		</tr>
<tr>
<td>مهاجم خارج القانوني</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">كتجاجتتتكااجاجات</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>رف خارج القانوني</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">كاكتجكتجاككككتكتات</td>
		</tr>
<tr>
<td>القانوني في مهاجم</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">أكاجاجكاجاكجاككاج</td>
			<td rowspan="2">350 شركة بريتيش بتروليوم</td>
			<td rowspan="2">58 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>القانوني في Rv</td>
			<td>القانوني</td>
			<td colspan="2">تجتجككاتتجاجتكجتا</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: كبسولة تفجير الداخلي والخارجي نبكر البورليه بورجدورفيريفلاب والقانوني. في الواقع، كشف كبسولة تفجير شحم بورجدورفيري ب س. س. والآخر ارتباطاً وثيقا جينوسبيسيس البورليه ، بينما الإشعال القانوني التقاط فقط بورجدورفيري س. س. تشير إلى التضخيم من كلا المكاني باء burgdorferi. س. س.
<ol start="2"><li>قبل تعقيم خزانة PCR مع الأشعة فوق البنفسجية من الضوء و 70% من الإيثانول. ملاحظة: لتقليل التلوث المحتملة بعينه، ينبغي أن تكون مميزة من موقع تشريح القراد، استخراج الحمض النووي، وهلام التفريد مساحة العمل هذه.<ol>
<li>لتشغيل بكر الأولى، استخدام الإشعال الخارجي بالتزامن مع قالب الحمض النووي استرداد في الخطوة 1، 0 أعلاه، وإعداد رد فعل الخليط كما هو موضح في الجدول 2. في موازاة ذلك، أداء إيجابيا يعمل التحكم تتألف من التحقق من البورليه الحمض النووي، وتشغيل المراقبة السلبية بما في ذلك ردود الفعل لا قالب للكشف عن التلوث الكاشف والهباء الجوي. إضافة الحمض النووي في النهاية إلى تقليل التلوث المحتملة من الكواشف. ضمان كل أنبوبة مغلقة في جميع الأوقات عندما لا يتم إضافة الكواشف وإغلاق الأنابيب فورا بعد إضافة الحمض النووي، وقبل أن يتم فتح أنابيب أخرى.</li>
		<li>برنامج cycler حرارية النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الصلب درجة الحرارة لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية ل 45 s؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ وعقد في 4 درجات مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إجراء الجولة الثانية من PCR مشابهة لأول رد فعل، فيما عدا استخدام كبسولة تفجير الداخلية مع 2 ميليلتر من أول منتج PCR (المنتجة في 2.2.2). ملاحظة: حجم رد الفعل مرة أخرى ترد في الجدول 2. ويجب الحرص على تجنب التلوث عبر من أمبليكونس بضمان أن تتم إضافة الحمض النووي قالب آخر وأن أنابيب فقط تناظر عينة واحدة مفتوحة في وقت واحد. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>المكون</td>
				<td>بكر # 1 وحدات التخزين</td>
				<td>بكر # 2 وحدات التخزين</td>
			</tr>
<tr>
<td>بوليميراز ماجستير بوليميريز ميكس 2 X</td>
				<td>ميليلتر 12.5</td>
				<td>ميليلتر 12.5</td>
			</tr>
<tr>
<td>المياه خالية من نوكلاس</td>
				<td>ميليلتر 8.5</td>
				<td>ميليلتر 8.5</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 ميكرومتر كبسولة تفجير للأمام وعكس</td>
				<td>الإشعال الخارجي ميليلتر 1.0</td>
				<td>كبسولة تفجير داخلية ميليلتر 1.0</td>
			</tr>
<tr>
<td>قالب الحمض النووي</td>
				<td>ميليلتر 2.0، من استخراج عينة (1.2.7)</td>
				<td>ميليلتر 2.0، من جولة 1 من بكر (2.2.2)</td>
			</tr>
</tbody></table>
الجدول 2: بكر خليط من رد فعل لإيضاحات مسهبة الأولى والثانية. 
	 
	<ol>
<li>برنامج cycler الحرارية كما كان من قبل، ولكن ضبط درجة الحرارة انلينغ لاستيعاب الإشعال الداخلية (انظر الجدول 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-[اغروس] هلام التفريد والتصوير
ملاحظة: للحصول على الإرشادات الأساسية حول فصل الحمض النووي بالتفريد، راجع لي et al., 201234.
<ol><li>إعداد 1.2% [اغروس] هلام استخدام 20 "س س" العازلة (0.2 M هيدروكسيد الصوديوم، 0.8 متر الماء المقطر pH 8)، يخفف إلى 1 X، وإضافة حوالي 5 ميليلتر من وصمة الحمض النووي، قبل سكب، إذا قبل تلطيخ جل هو المطلوب.</li>
	<li>تحميل 10 ميليلتر للمنتج من رد فعل بكر (الداخلية) الثانية من كل التجريبية ونموذج عنصر تحكم، جنبا إلى جنب مع سلم bp 100 (5 ميليلتر).<ol>
<li>اليكتروفوريسي على ح 1 107 الخامس (5 فولت/سم).</li>
	</ol>
</li>
	<li>عرض وتوثيق الجل باستخدام ترانسيلوميناتور والكاميرا المرتبطة بها والبرمجيات.</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

على مدى عقود الاستخدام، أثبتت التقنيات المستندة إلى بكر ثبات قيمتها في الكشف عن البورليه من العينات المفصلية والثدييات، سواء البورليه تأتي من أصول بيئية أو السريرية. بكر يقدم العديد من التحسينات على نهج موجود مسبقاً للمراقبة. جدير بالذكر أن لا يعتمد على تطوير وأداء الكواشف الأجسام المضادة، وبدلاً من ذلك يمكن بسهولة تكييفها للكشف عن أهداف جديدة للاهتمام ببساطة عن طريق تعديل تسلسل التمهيدي. بكر يستوعب أيضا تقييم مواقع متعددة في نفس الوقت، أما بصورة مستقلة أو عن طريق فعل متعدد. يمكن تطبيقها على المدخلات العينة المتنوعة، بما في ذلك القراد الطازجة والمحفوظة في الأرشيف22والحيوان أو سوائل الجسم البشري والأنسجة مستأصل25. كما غلة بكر أمبليكونس التي يمكن معالجتها بالمزيد، على سبيل المثال بهضم إنزيم التقييد أو التهجين مسبار أو التسلسل، زيادة التبصير الهوية الميكروبية21.
كأداة سريرية، بكر الأفضل نظرياً إلى تشخيص المصلية القياسية، كما أنها توفر إشارة مباشرة لوجود البكتيريا، بدلاً من الاعتماد على الاستجابة المناعية المضيف كتدبير ثانوي للإصابة. بيد بوريليوسيس لايم يرتبط بعبء الميكروبية متواضعة نسبيا (< الكائنات 50/مل من البول أو البلازما) والنتائج سبيروتشيتيميا عابرة، الذي يمكن أن يؤدي إلى سلبية زائفة25. حساسية هذا الأسلوب في العيادة يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لنوع النسيج، المرحلة من العدوى، والشرط عينة، التي تقع بين 12.5% و 62% في الدراسات الحالية للدم والسائل النخاعي، وفحص الأنسجة36. حساسية الجزيئية القيود ليست مصدر قلق إذا PCR يجري بعد ثقافة البكتيرية، بيد أن استعادة اللولبية قابلة للاستمرار من العينات السريرية أثبتت كذلك تحديا. إلا في الآونة الأخيرة قد تم تحسين البروتوكولات لأعلى غلة35. وفي الوقت نفسه، القناة الهضمية التجزئة الكبار المصابين يمكن إيواء في المتوسط في أي مكان من 000 2 إلى أكثر 50,000 البورليه37،38،39، وقوة داخل نطاق الكشف نبكر. وهكذا، البروتوكول مناسبة تماما لجهود المراقبة القراد.
وعلى الرغم من مزاياها العديدة، نبكر تطرح بعض التحديات، وقدرة هذه التقنية على تقرير دقيق الإصابة بالقراد ولذلك تعتمد على التحديد الاستراتيجي للجينات وأمبليكونس، ومهام سير العمل التجريبية الدقيقة التي استرداد نوعية الحمض النووي من العينات مع تقليل التعرض عبر العينات، واستخدام عناصر التحكم المناسبة التي يمكن تقرير الملوثات في البيئة المختبرات والمواد الكاشفة. قبل أي التجريب، نطاق والنوايا للتحقيق ينبغي تحديد بوضوح حتى أن المكاني الوراثية المناسبة، ومناطق فيها، يمكن تحديدها. إذا كان الهدف توفير على شاشة غير منحازة س يسبب لايم البورليه burgdorferi المعقدة، ينبغي إنشاء كبسولة تفجير للكشف عن كافة سلالات المقترنة مع تقارب مماثل وكفاءة التضخيم، دون التقاط لا علاقة لها 25من الكائنات الحية. يمكن تصميم كبسولة تفجير جديدة والمقررة في السيليكون باستخدام أدوات البرمجيات مثل انفجار التمهيدي40، على الرغم من أنها ينبغي أيضا التحقق من صحة تجريبيا ضد مرجعية معيارية يعزل قبل تطبيقه على عينات أونتشاراكتيريزيد. والهدف من هذا الإجراء استخراج الحمض النووي لاسترداد قالب الميكروبية سليمة من عينة بيئية مختلطة (علامة هوموجيناتي). خطوة اختيارية قبل المتابعة مع بكر لتقييم سلامة الحمض النووي المستخرج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد ردود أفعال موازية لاستهداف جين التدبير المنزلي في القراد. الأسلوب الأخير يمكن أن تشير أيضا إلى وجود مثبطات في خليط رد فعل، توفير زيادة الثقة بأن ردود الفعل السلبية البورليه نظراً لغياب الكائن الحي، وعدم وجود ملوث المثبطة.
زيادة الحساسية للنهج PCR متداخلة يأتي على حساب تلوث محتمل أن يولد نتائج إيجابية كاذبة. يمكن إدخال قالب خارجية بعينه أثناء تشريح القراد والانتعاش الحمض النووي، أو عملية إعداد ردود فعل التضخيم الخارجي والداخلي. ولذلك المهم خصوصا لاتباع أفضل الممارسات بروتوكولات لبكر لتجنب قالب أو amplicon التلوث المتبادل. هذه تشمل استخدام محطات عمل منفصلة مع أيرفلووس المستقلة، والاحتواء في بكر وخزانات السلامة البيولوجية، حسب الاقتضاء، شاملة الكيميائية والفيزيائية تنظيف وتعقيم الأسطح والمواد الكاشفة، والتعامل مع الحذر من الحمض النووي 41-عناصر القالب لا أيضا حيوية في تحديد تلوث كواشف الأسهم. مشكلة عدم حصانة خاصة نبكر amplicon المناولة التي تحدث عند نقل المنتجات من أول رد فعل في السفينة PCR الثانية. منذ الهدف الحمض النووي وقد خضع بالفعل تخصيب الأسى في عينات إيجابية، هذه الخطوة لا سيما المعرضة للتلوث عبر، وقد تم وضع بروتوكول نبكر أنبوب واحد للالتفاف حول هذا القيد. في هذا النهج، يتم إضافة مجموعتي كبسولة تفجير لجين معين معا إلى أنبوب رد فعل التي تظل مختومة لكل جولات PCR31. يجب أن تكون أزواج التمهيدي الخارجي والداخلي [ثرمودنميكلي] مميزة، مثل أن الزوجين الخارجي يضاعف القالب عند درجة حرارة انلينغ عالية باهظة للإشعال الداخلية. في الجولة الثانية، هو خفض درجة الحرارة انلينغ لاستيعاب الزوج الداخلية. ليس فقط هل هذا تجاوز خطوة يحتمل الخلط، ويسمح أيضا استخدام إضافية تدابير مكافحة التلوث31،42. إلا أن هذا التعديل قد التضحية ببعض الحساسية المقايسة. بغض النظر عن النهج، زيادة عدد replicates التقنية التي تجري بشكل مستقل على عينة سوف يساعد على تحديد التلوث زائفة.
ظلت تتطور منذ إدخال نبكر التقنيات الجزيئية، وهذه النهج الجديدة توفر مزايا تحديد أكثر التصاميم الأصلية، أن كان ذلك في زيادة المصروفات المالية. وكما يوحي اسمها، PCR الكمي (الوقت الحقيقي أو qPCR (RT)-PCR) يسمح لتعداد الكائنات الممرضة في عينة، بينما نوعي في طبيعة43التقنيات التقليدية. حساسية قبكر يشبه يقال أن نبكر38، على الرغم من أنه يمكن أن تتقلب تبعاً للخصائص التمهيدي28. كما أظهرت تباين qPCR يستخدم منارات الجزيئية (ميغابايت) بدلاً من التقليدية تكمان المسابير الوعد في الكشف عن البورليه في العينات السريرية44،،من4546. بسبب هيكلها الثانوي فريدة من نوعها، إنتاج منارات الجزيئية يقال أن أقل الخلفية الفلورية وإشارات شرعية أعلى، مما يوفر حساسية فائقة47. توحي التقييمات قبل السريرية عتبة كشف محتملة بين واحد وعشرة اللولبية44،45. وعلاوة على ذلك، التقنية قد طبقت بنجاح في التفاعلات المتعددة في نفس الوقت كشف جينات مضيف الثدييات44 والأخرى المسببة للأمراض التي ينقلها القراد45، وما لا يمكن تحقيقه سهولة مع نبكر. وتشمل تعديلات التصميم الأخرى الحبرية بكر (دبكر) التكنولوجيا الرقمية، التي يمكن تحديدها كمياً الحمض النووي دون استخدام39،المنحنى المعياري48. الحد الأدنى للكشف عن هذا الأسلوب البورليه بالمثل نحو عشر عينة اللولبية/39. مقارنة نبكر، هذه النهج قد أيضا استفادة إمكانات المخفضة للتلوث، كما أنها تتطلب فقط بروتوكول واحد تضخيم.
إذا كان هدف المراقبة بدلاً من ذلك على التشكيل الجانبي محتويات علامة البكتيرية المتنوعة، هو فحص الجينومية الرنا الريباسي 16S خياراً جذاباً49. على الرغم من أن هذا النهج هو أكثر تكلفة ويتطلب التعاقب الحمض النووي المتخصصة غير موجودة في جميع مختبرات البيولوجيا الجزيئية ويقتضي التفسير القائم على المعلوماتية الحيوية أكثر تطورا، فإنه يمكن التقاط مجموعة واسعة من الجراثيم لأكثر دقة ويمثل الحمل الممرض ناقل.
بينما قبكر ومشتقاته أساليب الاختيار للتطبيقات الكمية، وشاشات metagenomics توفر مخزونات واسعة من ميكروبيومي التجزئة، جهود المراقبة المستهدفة غالباً ما تعني بثنائي الإبلاغ عن وجود أو عدم وجود عوامل ممرضة واحدة أو عدد قليل في ناقل. في ظل هذه الظروف، قد يعرض هذه النهج أحدث وأكثر تفصيلاً تعقيد لا لزوم لها والعبء المالي في العملية. ولهذه الأسباب، قد نبكر صمدت لاختبارات الزمن كأسلوب رئيسي في تجزئة الاختبار.

مرض لايم (LD) هو الأكثر شيوعاً العدوى المنقولة في نصف الكرة الشمالي، ويواصل انتشاره زيادة1. بسبب هذا المرض الموهن مسببات الأمراض سبيروتشيتيل لايم borreliosis (رطل) معقدة (يشار إلى البورليه burgdorferi بالمعنى الواسع، أو س)، الذي يضم تاريخيا الممرض أمريكا الشمالية الغالبة، ب burgdorferi معناها الحرفي (ما)، بالإضافة إلى أفزيليي و جاريني باء، الذي يتم على نطاق واسع في جميع أنحاء أوروبا وآسيا، وهي الأنواع الناشئة أهمية سريرية2،3. تنتقل هذه البكتيريا إلى الإنسان عن طريق لدغة القراد Ixodes المصابة2. على الرغم من أن ناقلات أمريكا الشمالية الرئيسية هي سكابولاريس أولاً و باسيفيكوس أولاً، وجدت الأنواع متعددة داخل هذا جنس للمرفأ، ويحيل بكتيريا4. في البشر، ويمكن أن يسبب بورجدورفيري باء- إطار الأعراض التي تؤثر على الجلد، والمفاصل، والقلب والجهاز العصبي، الغدد الصماء، الجهاز الهضمي، والأجهزة الداخلية5،،من67، 8،،من910. حاليا تقديرات مركز السيطرة على الأمراض والوقاية 300,000 أكثر حالات بشرية جديدة سنوياً في الولايات المتحدة11،12. في حين غالباً ما التشخيص مواتية عند المرض يتم تشخيصه وعلاجه في المراحل المبكرة، اقترحت الدراسات في أي مكان بين 10 في المائة و 60 في المائة من المرضى الذين تلقوا نظام صادات الموصى بها التي ظلت تواجه الأعراض بعد العلاج وقف، في ظاهرة تسمى وظيفة علاج مرض لايم مرض (بتلدس)13،،من1415. وعلاوة على ذلك، التأخر في التدخل السريرية يمكن أن تنشأ نتيجة لنقص الوعي بلدغة القراد، العرض التقديمي غير محددة للمرض الأولى، وانخفاض حساسية التشخيص التقليدية المستندة إلى علم الأمصال عند استخدامها في بداية العدوى. فشل لعلاج سريع ومناسب يتيح تطور الأعراض التي يمكن أن تظهر في متزايد المنهكة مضاعفات16،17. وللوقاية من مرض لايم حجر زاوية في إدارة المخاطر. استراتيجيات لمكافحة هذا التهديد المتزايد وتشمل تدابير المراقبة قوية تشير إلى أن انتشار الكائنات الممرضة في القراد، وتحديد المناطق الجغرافية من القلق.
يوضح هذا المقال فائدة متداخلة البلمرة المتسلسل (نبكر) كأداة فحص جزيئي بموجبه تحديد القراد المصابة. لزيادة الدقة، تستخدم اثنين من الجينات البورليه التضخيم موازية. فلاجيلين ب (شحم) يشفر بروتين خيوط رئيسية من السوط18، والجين الموجود على كروموسوم خطي واحدة، بينما المنتج بروتين دهني بروتين السطح الخارجي A (القانوني) يتوسط الأمامي القراد الاستعمار، وهو ترميز بلازميد19،20. يتكون سير العمل من مجموعة التجزئة، واستخراج الحمض النووي، ومن ثم إجراء جولة أولى من PCR للكشف عن البورليه-مواضع محددة. يستخدم PCR اللاحقة المنتج من أول رد فعل كقالب جديد لتوليد شظايا التضخيم أصغر حجماً والداخلية. يعتبر علامة إيجابية البورليه burgdorferi عندما أمبليكونس الداخلية من كلا الجينات البورليه يمكن الكشف عنها بواسطة [اغروس] هلام التفريد.
تقنية نبكر، و شحم وأهداف الجينات القانوني ، وقد استخدمت على نطاق واسع للمراقبة الإيكولوجية والكشف السريري ل spirochete لايم منذ أوائل التسعينات21،،من2223 ،،من2425. قبل وضع بروتوكولات الجزيئية، قيمت القراد بإخضاع محتويات القناة الهضمية لمضاداتالبورليه تلطيخ الفلورة (إذا كان) أو الثقافة الميكروبية، أو مزيج منها26. هذه النهج تعاني من القيود الكامنة، بما في ذلك بطء النمو وطبيعة الحساسية البورليه27وجسم مشاكل الأداء، وشرط القراد يعيش لحالة تجهيز21. بكر اعتمد لاحقاً تقديم تعريف الناقلة المصابة حساسة وسريعة ومحددة. أنه يوفر تحسينات ملحوظة على المنهجية التقليدية، بما في ذلك ثقافة مستقلة التطبيق المباشر لأنواع العينات المتنوعة، مثل القراد الميت والمؤرشفة التي لولا ذلك غير مناسب لاختبار21،22 . تصاميم تجريبية المتداخلة في مواصلة تحسين على خصوصية وحساسية PCR الكلاسيكية باستخدام مجموعتين متميزة من الإشعال الخاصة بالجينات في جولتين متتاليتين من التضخيم25،28.
نجاح التجربة اعتماداً كبيرا على تصميم التحديد و amplicon الجينات الاستراتيجية. دقة تقدير وجود البورليه burgdorferi، كبسولة تفجير ينبغي الكشف عن مسببات الأمراض ذات الصلة دون كروسريكتينج بالحمى الراجعة اللولبية في جنس البورليه أيضا. في حالة شحم، وخصوصية هذا يتحقق من خلال استهداف منطقة داخلية متغير من الجينات، بدلاً من تسلسل ترافقه المصانة نسبيا التي يشترك فيها البكتيريا المتنوعة (الشكل 1)24،29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> رقم 1: مفهوم نبكر، كما هو موضح باستخدام البورليه شحم الجينات كهدف. تيرميني 5 'و 3' الجينات شائعة للكائنات الحية خارج البورليه burgdorferi س. ل.، مما يجعل هذه المناطق غير مناسب لتقييم العوامل الممرضة المسببة لايم محددة. باستخدام تسلسل الداخلية التي حفظت أقل كأهداف التمهيدي، يتم تنفيذ جولتين من PCR للكشف عن أمبليكون النهائي، والداخلية. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
في اختبار قدرتها التمييزية، ويقيم ما يزيد على 80 يعزل البورليه مختلفة الداخلية شحم الإشعال، ووجدت لتحديد فقط تلك المرتبطة بمرض لايم24. وقد تم توثيق الحد الأدنى للكشف نبكر في بين ستة24 والبكتيريا31 عشرة من ثقافة نقية، على الرغم من أن يمكن زيادة تحسين الحساسية من النشاف في أمبليكون الجنوبية، والتهجين راديولابيليد أو التحقيق تشيميلومينيسسينت. اقتران التقنيات يقلل من عتبة الكشف إلى قرص واحد سبيروتشيتي31. بالمقارنة المباشرة، تم العثور على بكر واحد-الجولة التقليدية، أونبروبيد تقرير وجود حد أدنى من 104 اللولبية31. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أقل حساسية الفحص عند العمل مع العينات السريرية والبيئية المعقدة، نظراً لوجود الساحقة لا علاقة لها الحمض النووي والمواد المثبطة المحتملة. هذه التحديات يمكن التحايل عليها إلى حد كبير عن طريق استخدام نبكر.
وعلى الرغم من أوجه التقدم في التكنولوجيا الجزيئية في العقود الماضية، يظل نبكر تقنية التدبيس في جهود المراقبة الحديثة. إذا هو الحرص في تصميم وتنفيذ هذا البروتوكول، نهج قوية وقابلة للتكيف، وبسيط نسبيا لالتقاط وجود مسببات الأمراض في ناقلات التجزئة.

<table><tbody><tr><td>LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0.22 mm thickness</td></tr><tr><td>Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&amp;nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA extraction reagent</td></tr><tr><td>Microtube Pestle</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>Designed for 1.5 ml tubes</td></tr><tr><td>Water bath - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Primer Synthesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cabinet</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>The water comes with the GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power pack&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (Serial number 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

مرض لايم هو عدوى المنقولة خطيرة بسبب الضيق البورليه burgdorferi أسرة لاتو اللولبية التي تنتقل إلى الإنسان عن طريق لدغة القراد Ixodes المصابة. أن عامل المسببة الأولية في أمريكا الشمالية معناها الضيق البورليه burgdorferi . توسيع مناطق المخاطر الجغرافية، فإنه من الحكمة لدعم برامج المراقبة القوية التي يمكن قياس معدلات الإصابة بالقراد وإبلاغ النتائج إلى الأطباء والأطباء البيطريين، وعامة الجمهور. تقنية جزيئية متداخلة البلمرة المتسلسل (نبكر) منذ فترة طويلة تستخدم لهذا الغرض، ويبقى اتباع نهج المركزية، وغير مكلفة والقوية في الكشف عن البورليه في القراد والحياة البرية.
يوضح هذا المقال تطبيق نبكر القراد مقتطفات الحمض النووي لتحديد العينات المصابة. دولتين مستقلتين بورجدورفيري باء- الأهداف، الجينات ترميز فلاجيلين ب (شحم) و بروتين السطح الخارجي A (القانوني)، وقد استخدمت على نطاق واسع مع هذا الأسلوب. البروتوكول يشمل جمع التجزئة، واستخراج الحمض النووي، ومن ثم إجراء جولة أولى من PCR للكشف عن كل من هذين البورليه-مواضع محددة. يستخدم اللاحقة البلمرة المتسلسل (PCR) المنتج من أول رد فعل كقالب جديد لتوليد شظايا التضخيم أصغر حجماً والداخلية. يحسن هذا النهج المتداخل على خصوصية وحساسية PCR التقليدية على حد سواء. ويعتبر علامة إيجابية بالنسبة لمسببات المرض عندما أمبليكونس الداخلية من كلا الجينات البورليه يمكن الكشف عنها بواسطة [اغروس] هلام التفريد.

نبكر نهج أنيقة لزيادة خصوصية وحساسية للكشف عن مسببات الأمراض، لا سيما عندما يجري التحقيق في العينات البيئية المعقدة. كما هو مبين في الشكل 1، جولتين من PCR استهداف منطقة استراتيجية موضع شحم البورليه (و القانوني، لا في الصورة) يمكن تقرير وجود البكتيريا البورليه burgdorferi من خلال توليد الداخلية قصيرة أمبليكونس. عندما تحل بالتفريد هلام، نواتج التفاعل شحم و القانوني من كل علامة يمكن بصريا وسجل ومقارنته مع عناصر التحكم. في الشكل 2، تتوفر معرفات فريدة من نوعها العينة على طول الجزء العلوي من كل جيل، ولا-قالب والهباء الجوي يتم تمثيل عناصر التحكم في أقصى اليسار واليمين، على التوالي، المتاخمة للسلالم.
عصابات أمبليكون قوية تتجلى بوضوح في تحديد العينات التجريبية، وتمييزها بسهولة من كبسولة تفجير الفائض والمتبقي الحمض النووي (الشكل 2). استناداً إلى مبادئ التصميم التجريبي، علامة تعتبر إيجابية البورليه عندما موازية إثبات عناصر سلبية لا التضخيم، وتنتج أمبليكونس الداخلية من الإشعال شحم و القانوني على حد سواء. وفي هذه الحالة، اجتمع العينات T907 و T604 و T606 معايير المراقبة لمسببات المرض لايم (الشكل 2). By contrast، لم يكن إلا T923 الإيجابية القانوني، نتيجة التي توجد عدة تفسيرات محتملة: A) القراد المنشأ كان سلبيا بالنسبة البورليه، ولكن إعداد PCR القانوني الخارجي أو الداخلي أيامهم كانت ملوثة قالب الحمض النووي (علما بأن التلوث المنهجي من الكواشف استبعد عبر عناصر سلبية)، ب) القراد لايم البورليه، ولكن كميات منخفضة من قالب أو خطأ تجريبي منعت التضخيم من شحمأو ج) كائن حي كان حاضرا التي الواردة في التسلسل القانوني مصانة، ولكن تفتقر إلى فلاجيلين أو كانت الهوية غير كافية في المنطقة المستهدفة من شحم يصلب لكبسولة تفجير. وفي الواقع، لوحظت التشابه التسلسل القانوني في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، بما في ذلك النباتات والحيوانات28. الحالة العكسية، تضخيم الأكثر حفظت فلاجيلين الجينات، ولكن ليس الجين القانوني ، يمكن الإشارة إلى أنواع البورليه ذات صلة. في الممارسة العملية، هذا البروتوكول تعطي نتائج إيجابية واحدة القانوني أكثر من القيام بالاشعال شحم ، مما يوحي بأن السيناريو 'A' هو التفسير الأقل احتمالاً. دون مزيد من التحليل التجريبي للعينة المثيرة للجدل، ومع ذلك، من غير الممكن تحديد المصدر بنتيجة إيجابية واحدة. قد تساعد زيادة عدد replicates التقنية التي أجريت على عينات ملتبسة للتوفيق بين وضعهم الحقيقي، إذ لن يكون أي الملوثات التي أدخلت أيامهم إلى ردود الفعل السابقة الموجودة في الحمض النووي المؤرشفة. بيد إذا كانت التفاعلات اللاحقة مع هذه الإشعال لا توفر نتائج قاطعة، المكاني البورليه أخرى يمكن التحقيق في PCR. يمكن أيضا تعيين تسلسل أمبليكونس المتولدة من ردود الفعل هذه ومقارنة بين يعزل للمساعدة في تعيين الهوية، وتقدير درجة الاختلاف سلالة. Sapi والزملاء تقديم مثال لسير العمل هذا باستخدام العينات السريرية البشرية35.
اعتبار جميع العوامل، معايير البروتوكول والتفسير المبين قد قدرت أن تحقق معدلات سلبية إيجابية وكاذبة كاذبة 0.17 في المائة و 0.0063 في المائة، على التوالي.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> الشكل 2 : الكشف عن البورليه burgdorferi في القراد الفردية التي نبكر من شحم و القانوني- يتم تمثيل الرموز المعينة إلى كل التجزئة عبر الجزء العلوي من المواد الهلامية، والهويات محاذاتها عمودياً تقرير كشف القانوني و شحم في كل عينة. الممرات المعنون ب إلى يسار عناصر التحكم في قالب لا تمثل الصورة، بينما الضوابط الهباء الجوي للقبض على تلوث البيئة مختبر (ممرات يد اليمنى). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR at JoVE.com

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

يعشق [بكر] هو تقنية حساسة ومحددة وواضحة يمكن تطبيقها للتجزئة استخراج الحمض النووي للتحقيق البورليه burgdorferi، المسبّب لمرض لايم. التجربة الأولية PCR يستخدم الإشعال الخاصة بالجينات لتوليد أمبليكونس طويلة، ثم تصبح قوالب لفعل لاحقة باستخدام كبسولة تفجير الداخلية.

الكشف عن مرض لايم Spirochete، البورليه Burgdorferi، في القراد باستخدام PCR متداخلة

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

18.0K Views.  Mount Allison University. يعشق [بكر] هو تقنية حساسة ومحددة وواضحة يمكن تطبيقها للتجزئة استخراج الحمض النووي للتحقيق البورليه burgdorferi، المسبّب لمرض لايم. التجربة الأولية PCR يستخدم الإشعال الخاصة بالجينات لتوليد أمبليكونس طويلة، ثم تصبح قوالب لفعل لاحقة باستخدام كبسولة تفجير الداخلي?...

Video: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

الطرق السريعة لنقل وتوطين مسببات المرض داخل القناة الهضمية لايم القراد

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Immunology and Infection

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Genetics

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between vertebrates and ticks and dramatically remodels its transcriptional profile to survive in disparate environments during infection. A focus of B. burgdorferi studies is to clearly understand how the bacteria responds to its environment through transcriptional changes. In vitro transcription assays allow for the basic mechanisms of transcriptional regulation to be biochemically dissected. Here, we present a detailed protocol describing B. burgdorferi RNA polymerase purification and storage, sigma factor purification, DNA template generation, and in vitro transcription assays. The protocol describes the use of RNA polymerase purified from B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC is a previously published strain harboring a 10XHis-tag on the rpoC gene encoding the largest subunit of the RNA polymerase. In vitro transcription assays consist of the RNA polymerase purified from strain 5A4-RpoC, a recombinant version of the housekeeping sigma factor RpoD, and a PCR-generated double-stranded DNA template. While the protein purification techniques and approaches to assembling in vitro transcription assays are conceptually well understood and relatively common, handling considerations for RNA polymerases often differ from organism to organism. The protocol presented here is designed for enzymatic studies on the B. burgdorferi RNA polymerase. The method can be adapted to test the role of transcription factors, promoters, and post-translational modifications on the activity of the RNA polymerase.

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

In vitro transcription assays can decipher the mechanisms of transcriptional regulation in Borreliella burgdorferi. This protocol describes the steps to purify B. burgdorferi RNA polymerase and perform in vitro transcription reactions. Experimental approaches using in vitro transcription assays require reliable purification and storage of active RNA polymerase.

المكونات الأساسية لبوريليلا (بوريليا) بورغدورفيري في مقايسات النسخ المختبري

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

المقايسة المناعية المتعددة ل IgG و IgM الخاصة بالبوريليا في المصل

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

تسليط الضوء على المؤلف: توسيع نطاق المقايسات المناعية المتعددة لتشخيص داء لايم وأبحاث مسببات الأمراض 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

الكشف عن مرض لايم Spirochete، البورليه Burgdorferi، في القراد باستخدام PCR متداخلة

Summary

Explore More Videos

الطرق السريعة لنقل وتوطين مسببات المرض داخل القناة الهضمية لايم القراد

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

المكونات الأساسية لبوريليلا (بوريليا) بورغدورفيري في مقايسات النسخ المختبري

التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi

الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال

الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال

الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل