ويقدم التمويل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة من المنحة R01HL130864.

<ol>
	<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+liver+cells:+perfusion+technique+and+metabolic+evaluation.">Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation.</a> Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Isolation+and+Purification+of+Murine+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells:+A+Systematic+Review.">Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+perfusion+of+liver+and+other+organs+for+the+study+of+microsomal+electron-transport+and+cytochrome+P-450+systems.">The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems.</a> Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).</li><li>Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+preparation+of+mouse+liver+Kupffer+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Munin open research archive. , 1-10 (2012).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Kreamer, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+low-speed,+iso-density+percoll+centrifugation+method+to+increase+the+viability+of+isolated+rat+hepatocyte+preparations.">Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).</li><li>Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+perfused+rat+liver+technique.">Isolated perfused rat liver technique.</a> Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> J Vis Exp. (57), e3138 (2011).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Anatomy of the Laboratory Mouse. , (1965).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Method+for+Isolation+of+Mouse+Hepatocytes+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells,+and+Kupffer+Cells.">Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells.</a> Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).</li><li>Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocytes:+Isolation,+Culture,+and+Quality+Procedures.">Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).</li><li>Clarke, B. L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+of+the+asialoglycoprotein+receptor+in+isolated+rat+hepatocytes.+ATP+depletion+blocks+receptor+recycling+but+not+a+single+round+of+endocytosis.">Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis.</a> J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ويبرز هذا البروتوكول بالأدوات المتوفرة والتي ستتيح للمستخدم نسبة عالية من النجاح في هذا الإجراء. نضح ناجحة أمر أساسي لأي تطبيق المصب عند العمل مع الخلايا الأولية.
وهناك بضع خطوات حاسمة من الإجراءات التي تحدد النجاح. أولاً، يجب أن يكون وضع طرف قسطرة داخل الوريد البابي الصحيح. إذا وضعت بعيداً جداً داخل الكبد، وسوف perfused الفصوص طفيفة فقط. يجب أن تكون الحافة فقط أدناه فروع الوريد البابي الأيمن والأيسر. ميزة استخدام قسطرة مركب البوليمر عبر إبرة أن بارب الإبرة المسيل للدموع على المنوال خلال نضح من قسطرة على الأرجح. ثانيا، تحديد كمية ونوعية كولاجيناز كفاءة الهضم الكبد. في هذا الإجراء، واستخدمت كولاجيناز المؤهلين مسبقاً نوع 4 وأنه هو حراكه في 0.5 ملغ/مل في المخزن المؤقت 2 إذا كان النشاط كولاجيناز تكون جزيئي أكبر من 900 وحدة دولية.
في نهاية نضح كولاجيناز، ينبغي أن تحتفظ الكبد تان مظلمة إلى حد ما إلى اللون البنى. إذا كان لون تان ضوء، ثم خلايا الكبد معظم القتلى. الكبد وينبغي أن تكون تتهاوى عندما قطعت من الماوس. في أفضل الظروف، قد يكون حصد الكبد خارج تجويف الجسم للماوس مع ملعقة صغيرة. كبد في هذا الشرط دائماً إعطاء صلاحية خلية عالية جداً. إذا كان الأمر يستغرق الكثير من الجهد لاهتزاز الخلايا عن بعضها البعض، إذا ما زال راسخا الكبد أثناء استخراج، أو إذا كان هناك الكثير من القوة اللازمة للتحرك في خلايا الكبد من خلال المرشحات، ثم خلايا الكبد سيكون صلاحية أقل. خلايا الكبد مغطاة زغيبات، مما يسمح لهم بمساحة سطحية عالية جداً (الشكل 10). غير مكتملة الهضم يحتفظ خلية خلية الوصلات بين خلايا الكبد، والقص الميكانيكية سوف تمزق غشاء البلازما. نضح في الموقع مع كولاجيناز هو أفضل طريقة للتفكك من الخلايا والمحافظة على سلامة عالية. في الشكل 11، قورنت اثنين تتمثل الاستعدادات في الذي الكريات الخلية بعد قليل يغسل في المخزن المؤقت 1. بيليه على اليسار أخف ويحتوي على بقاء خلية حوالي 50%. بيليه على اليمين أغمق وجدوى من 92 في المائة. وبالمثل، عند سكب السائل من 50 مل المخروطية، ثابتة داخل الأنبوب، على عكس بيليه أخف، الذي سوف الشريحة في الأنبوب كما سكب السائل قبالة بيليه أكثر قتامة. بقاء الخلية السفلي أو بيرفوسيونس غير فعالة قد تحدث عندما الكبد يحتوي على مستويات عالية من التصلب.
منذ خلايا الكبد الحية لها كثافة أعلى من خلايا الكبد الميت، سيؤدي إلى إجراءات الطرد المركزي استعدادا نقية جداً في خلايا الكبد سليمة15. إذا لم يكن هناك كمية كبيرة من خلايا الكبد الميت (الذي غالباً ما يحدث عندما تكون الشروط الأمثل)، يعيش الخلايا قد تكون زيادة إثراء وفصلها عن الخلايا الميتة باستخدام التدرجات حماية الأصناف النباتية. منذ خلايا الكبد الحية بيليه أسرع من خلايا الكبد الميت، بالإضافة إلى ذلك، سوف أيضا زيادة نسبة مباشرة إلى الخلايا الميتة في بيليه التطلع للأعلى 3rd لبيليه. تكون هذه الإجراءات سريعة وطرق سهلة لفصل مباشر من خلايا الكبد الميت وخلية الحطام عند الحاجة10،16. وهذا مفيد بشكل خاص إذا كانت العينة الثمينة، وفقط عدد قليل من الخلايا مليون مطلوبة للتجربة.
وفي الختام، وهذا طريقة سهلة وفعالة لحصاد خلايا الكبد وثانية من الكبد. بالأسعار الحالية، هو تكلفة القيام بهذا الإجراء بما في ذلك جميع الكواشف ومرة واحدة تحت 75 دولاراً لكل إعداد. إذا هي رغبت في الفئران متعددة، فمن الأفضل المضي قدما في تنقية تتمثل وإبقاء الكسر نواب على الجليد حتى تم تجهيز جميع الفئران. الشخصيات مستقرة بصفة عامة على الجليد لمالا يقل عن 5 ح، ولكن لم يتم اختبارها لأوقات أطول في هذا المختبر.

وقد أجريت منذ أوائل الخمسينات نضح كولاجيناز في الكبد للحصول على خلايا الكبد وقد تحسنت بشكل مستمر عند1،2،،من34. تم تجميع استعراض لطيفة جداً للعديد من المنهجيات والتقنيات، ووالكواشف المستخدمة في تنقية خلايا الكبد في ماير وآخرون5. الحصول على عائد مرضيا من خلايا الكبد عالية قادرة على البقاء وثانية تحديا من الناحية التقنية. القوات الميكانيكية التي تفصل بين الخلايا بما في ذلك نوعية كولاجيناز هي بعض من المتغيرات التي من الصعب السيطرة عليها. نظراً لحساسية تتمثل بقوى ميكانيكية، يتم تقليل قابليتها ملحوظا في ظروف دون المستوى الأمثل، مما دفع الحاجة إلى بروتوكول وصف الظروف المثلى لعزل. تظهر ثانية من غير أن تكون حساسة للقص الميكانيكية. نضح في الموقع مع الهضم كولاجيناز هو إلى حد بعيد أفضل طريقة لتعطيل الوصلات خلية خلية للحصول على الأعمال التحضيرية خلية مفردة من الكبد والأجهزة الأخرى مثل الأمعاء والطحال6. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة لإدخال المخزن المؤقت التروية في الوريد البابي باستخدام قسطرة بلاستيكية قابل للطي بدلاً من شق التي يمكن أن تسبب الوريد البابي إلى الانهيار، كما هو موضح في Smedsrød وآخرون7.
والهدف من هذه المخطوطة إثبات أهم الخطوات المطلوبة للنجاح في إجراء إسراف الكبد. وتشمل هذه الخطوات موضع القسطرة، تدفق سوائل التروية، والتعامل مع الأنسجة بعد الهضم. معدلات التدفق المعدل فوق المعدل الطبيعي لتدفق الدم، ولكن منخفضة بما يكفي لإبقاء الكبسولة جليسون سليمة. مرة واحدة الكبد يهضم بشكل صحيح ويتم فصل الخلايا في الحل، تنقية خلية بسيطة نسبيا عما إذا كانت تتم بالطرد المركزي التفاضلي، التصاق لوحة، أو بواسطة تنقية حبة المغناطيسية. خلايا الكبد الحية بكثافة أعلى ويتم تنقيتها بسهولة من الخلايا نونبارينتشيمال (الشخصيات) وخلايا الكبد الميت بسرعة بطيئة الطرد المركزي. معظم التطبيقات، التصاق لوحة لفصل كوبفر الخلايا (KCs) وثانية هو أسلوب مشترك8، على الرغم من أن هناك تقارير تفيد بأنها لا تنتج أفضل نقاء ثانية9. KCs لديهم ميل إلى التمسك بالأسطح الصلبة الصلبة بسرعة وأطباق بتري (معيار البوليسترين) هي المواد الأكثر استخداماً لهذا الإجراء. تنقية ثانية أو كيه سي بالاستخدام الأجسام المضادة مترافق المغناطيسي الخرز هو بلا شك أفضل طريقة لتنقية كبيرة من هذه الخلايا، على الرغم من أن الإجراء إضافة آخر 3-4 ح على هذا البروتوكول، وهو العائد الإجمالي انخفضت9. يوضح هذا التقرير بالتفصيل عملية نضح كبد مثلى التي عادة ما تسفر عن عدد مرتفع من خلايا قابلة للحياة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;1 L Erlenmeyer flask</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >S63274</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silicone tubing&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer</td>
			<td >96400-14</td>
			<td>This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tygon tubing</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >R3603</td>
			<td>Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector.&#160; This may also be used for the oxygen tubing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T-connectors</td>
			<td >Cole-Parmer</td>
			<td >EW-06294-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick dissconnects</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >6150-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pinch Clamps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >6165-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70</td>
			<td >Cole-Parmer</td>
			<td >EW-07559-00</td>
			<td>Periplastic pump with variable speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pump head, model 7014-20</td>
			<td >Cole-Parmer</td>
			<td >EW-07014-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass graduated 1.0 mL pipettes&#160;</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >curved non-serrated scissors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL syringe</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >03-377-23</td>
			<td>Only barrel of syringe will be needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sterlized spoon</td>
			<td >Home supply store</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton ball(s)</td>
			<td >Home supply store</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyester sewing thread</td>
			<td >Home supply store</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Masking tape</td>
			<td >Home supply store</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thumb tacks</td>
			<td >Home supply store</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >styrofoam pad&#160;</td>
			<td >50 mL conical rack</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cookie/baking sheet</td>
			<td >Home supply store</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Absorbant underpads</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >19 L water bath</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >TSCOL19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >381412</td>
			<td>Plastic cathetar with retractable needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallizing dishes 100x50</td>
			<td >VWR&#160;</td>
			<td >89000-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene petri dishes</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL conical tubes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >graduated pipettes (5 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >170355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >graduated pipettes (25 mL)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >170357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyStrainer 100 &#956;M</td>
			<td >Greiner bio-one</td>
			<td >542000</td>
			<td>100 &#956;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EasyStrainer 40 &#956;M</td>
			<td >Greiner bio-one</td>
			<td >542040</td>
			<td>40&#956;m filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile transfer pipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated swinging bucket centrifuge</td>
			<td >Sorvall Legend XTR</td>
			<td >75-217-406</td>
			<td>Centrifuge with swinging bucket rotar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galaxy 170R tissue culture incubator&#160;</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >CO170R-120-0000</td>
			<td>Humidified tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Compound</td>
			<td >Grams (g/L)</td>
			<td>Millimolar (mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffer 1, pH 7.4</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >8.3</td>
			<td >142</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >KCl</td>
			<td >0.5</td>
			<td >6.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >HEPES</td>
			<td >2.4</td>
			<td >10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BSA</td>
			<td >15</td>
			<td >0.226</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffer 2, pH 7.4</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >3.9</td>
			<td >66.74</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >KCl</td>
			<td >0.5</td>
			<td >6.71</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >CaCl2</td>
			<td >0.7</td>
			<td >6.31</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >HEPES</td>
			<td >24</td>
			<td >100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BSA</td>
			<td >15</td>
			<td >0.226</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Phenol Red</td>
			<td >0.01</td>
			<td >0.03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffer 3, pH 7.4</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >8</td>
			<td >137</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >KCl</td>
			<td >0.35</td>
			<td >4.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >MgSO4</td>
			<td >0.08</td>
			<td >0.66</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >CaCl2</td>
			<td >0.18</td>
			<td >1.62</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >HEPES</td>
			<td >2.4</td>
			<td >10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >BSA</td>
			<td >15</td>
			<td >0.226</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS, pH 7.4</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >8</td>
			<td >137</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >KCl</td>
			<td >0.2</td>
			<td >2.7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Na2HPO4-7H2O</td>
			<td >1.15</td>
			<td >4.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >KH2PO4</td>
			<td >0.2</td>
			<td >1.4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Percoll (PVP solution)</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >288555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenase Type IV</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane&#160;</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab144581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hepatocyte Growth Medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% by volume fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep (2x)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Long-term Hepatocyte Growth Medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% by volume fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep (2x)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucagon&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>G3157-2mg</td>
			<td >14 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>I9278-5mL</td>
			<td >0.5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrocortisone</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>H0888-1g</td>
			<td >7.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epidermal Growth Factor</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td>354001-100ug</td>
			<td >20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LSEC medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% by volume fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pen/Strep (2x)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion

هذا البروتوكول يوضح طريقة للحصول على المردود العالي والبقاء للماوس خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية (ثانية) ملائمة لاستزراع أو للحصول على خلية ليساتيس. في هذا البروتوكول، الوريد البابي كالموقع لقسطرة، بدلاً من الوريد الأجوف، كما يحد هذا التلوث بأنواع الخلايا الممكنة الأخرى في إعداد الكبد النهائي. مطلوب لا الأجهزة الخاصة طوال فترة الإجراءات. حمام مائي يستخدم كمصدر للحرارة للحفاظ على درجة الحرارة لكافة المخازن المؤقتة والحلول. يتم استخدام مضخة تمعجية قياسية لمحرك السائل، ومطلوب أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول مبردة لإجراءات الطرد المركزي. القيد الوحيد لهذا الأسلوب هو موضع القسطرة داخل الوريد البابي، الذي يمثل تحديا في بعض من الفئران في نطاق الحجم ز 18-25. ميزة هذا الأسلوب هو أن يستخدم المنوال واحد فقط التروية والوصول إلى هذا السياق السريع، مما يقلل من الاسكيمية وضخه من الكبد يقلل من جدوى الخلية الكبدية. وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أنه من السهل التمييز بين لايف من خلايا الكبد الميت بالبصر بسبب الاختلاف في كثافة الخلوية أثناء خطوات استخدام الطرد المركزي. خلايا من هذا البروتوكول قد تكون المستخدمة في خلية ثقافة لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات، فضلا عن معالجة لأي تقييم البيوكيميائية.

أسلوب ديمونستراشونال، وصقل لنضح الكبد وتنقية/تخصيب خلايا الكبد وثانية يرد هنا يوفر نصائح مفصلة لتنقية/تخصيب خلية الأمثل مماثلة للتقارير المطبوعة الأخرى المترجمة في هذا المشار إليه استعراض 5. تحدث في الطريق والتفاصيل التقنية للإجراء نضح كولاجيناز الخطوات الحاسمة التي تحدد النجاح لتنقية الخلوية وهي المبينة في هذا البروتوكول. الإعداد للجهاز إلى حد ما بسيطة وفعالة من حيث التكلفة مع معدات المختبرات القياسية، على عكس الأنظمة الأخرى التي تم نشر11 (الشكل 1). في هذا التشكيل، يجلس علبة عقد الماوس في حوض ماء مع بعض الأنابيب الزائدة في حمام الماء للحفاظ على درجة حرارة السوائل بيرفوسينج في الكبد. يمكن استخدام الجهاز كما هو موضح هنا للفئران وكذلك الفئران، مع هندسة مختلفة قليلاً للفئران نضح الكبد12 (الشكل 2).
في هذا الإجراء، هو perfused في الكبد عن طريق الوريد البابي بدلاً من الأجوف فينا (وتوجيه آخر بشعبية نضح) نظراً لسهولة الوصول إلى داخل البطن والذي يغذي الوريد مباشرة في الكبد. ينبغي أن يكون المشاهد يدرك أن الوريد البابي عدة فروع صغيرة التي يمكن اختزال بيرفوساتي، وينبغي أن توضع القسطرة في الماضي هذه الفروع للنجاح الأمثل13 (الشكل 3). بمجرد التعرف على الوريد البابي، تستخدم الملقط منحنى لرسم خياطة جراحية أو خيط البوليستر تحت الوريد البابي بين الكبد والوريد البنكرياس الإثناعشرية متفوقة. وتستخدم أيضا الملقط تصويب الوريد البابي الذي تحت ضغط الدم الإيجابية (الشكل 4أ). ينبغي أن توضع الإبرة داخل القسطرة موازية بجوار الوريد (الشكل 4ب)، وينبغي إدراج الشطب برفق في التجويف الوريد (الشكل 4ج). وسترد التنسيب السليم بالدم التي تظهر على طول القسطرة. حالما يتم سحب الإبرة يجب أن تستقر القسطرة مع مؤشر ترابط مرتبطة به وسوف يجبر ضغط الدم الدم تصل عن طريق القسطرة. من المستحسن أن القسطرة تكون متصلة بأنابيب ضخ قبل انسكاب الدم بها (الشكل 4د). بمجرد توصيل أنابيب ضخ، فورا قطع الأوعية الدموية رئيسية مثل الوريد الأجوف أو أبدوميناليس الشريان الاورطي لتصريف الدم/السائل (الشكل 5ألف). من الضروري عادة قطع الجانب جدار البطن من الماوس لتصريف المياه الكافية، وتراكم الدم في البطن يجعل من الصعب تصور عملية التروية، والدم قد يرحل إلى تنقية الخلية (الشكل 5 ب). وحالما يبدأ برنامج تلفزيوني نتخلل في الكبد، الكبد سوف لانش مع غياب الدم (الشكل 5ج). إلا إذا كان عدد قليل من الفصوص لانش، ثم السبب المحتمل هو أن القسطرة قد وضعت بعيداً جداً داخل الكبد، وسوف تحتاج إلى أن تدعم بطء. حالما يتم التأكد من وضع القسطرة استخدام للماء إخفاء الشريط لتأمين الأنابيب في المكان. عادة ما تكون الشريط المختبرات العامة غير كافية. للتأكد من الموضع الصحيح للقسطرة، ضغط الأوعية الدموية قطع وقف تصريف المياه ومراقبة زيادة الضغط داخل الكبد. عند القيام بذلك سوف تساعد في مسح الدم من الكبد (الشكل 5د). أيضا وهذا ينبغي أن يتم عند حل كولاجيناز في البداية يذهب إلى الكبد التأكد من أن جميع الفصوص معرضون كولاجيناز. بعد كولاجيناز يعمل الحل، هضم كولاجيناز جيدة إرشادي بفصل الكبسولة جليسون عن حمة.
الإجراء العام لتنقية الخلوية ويرد في الشكل 6 و الرقم 7 فيه خلايا الكبد يتم حصادها في وقت مبكر في الإجراء أثناء سرعة منخفضة يدور وهي نقية جداً بعد 4 يغسل في المخازن المؤقتة التي تحتوي على جيش صرب البوسنة (الرقم 8 ). تنقية يشترك مع KCs على تدرج حماية الأصناف النباتية (الشكل 9ألف) ثانية ومفصولة ثم الالتصاق الانتقائي في البوليسترين المغلفة بالكولاجين طبق بيتري. 83-90 ٪ نقية نقاء ثانية استخدام هذا الأسلوب ويعتمد إلى حد كبير على الفعالية الشاملة لهضم كولاجيناز (الشكل 9ب). القياسات الكمية باستخدام ضوء الفحص المجهري (كخلايا الكبد وثانية لها سمات مميزة من الخلايا الأخرى) تظهر أنه في إعداد ممثل، خلايا الكبد ما يقرب من 100 ٪ نقية وثانية هي فقط ما يزيد على 89% النقي (الجدول 1). بدلاً من ذلك، يمكن الحصول تخصيب أعلى من ثوان قبل الفاصل المغناطيسي العمود بعد التدرج حماية الأصناف النباتية، على الرغم من أن هذا خارج نطاق هذا البروتوكول. يمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول الفصل المغناطيسي لثوان و KCs في ماير et al. 9 وليو et al. 14 وينبغي أن نتذكر أن الجدوى من خلايا الكبد يقلل من سرعة في كبد هضم غير كاف، لكن هذه ليست الحقيقية اللازمة لكبد هضمها غير كاف أيضا إنتاج الحطام الخلوية أكثر، وهي ليست تماما الشخصيات. القضاء في خطوات استخدام الطرد المركزي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig1.jpg"> الشكل 1 : التمثيل التخطيطي لجناح التروية. وتعقد في قوارير في مكان المشابك (غير معروضة)؛ أنابيب السوائل المحتوية على تبديل من قارورة 1 لتر إلى قارورة 125 مل أثناء الإجراء يمثل الخط المنقط أحمر. لا فقاعة علما، بأن تغذية الأكسجين مباشرة إلى الحلول قوارير. ينبغي أن يكون حقق الفلين أيضا للسماح بتدفق السوائل الدائرة المغلقة مع الأنبوب إدراجها داخل الشق. هذا أمر بالغ الأهمية خلال الاحماء الأنابيب وطرد جميع الهواء داخل الأنبوب. التسييل الهواء يتكون من موصل تي التي يتم توصيلها إلى أنابيب تيجون والمشابك قرصه لفتح سريع وإغلاق النظام. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig2.jpg"> الشكل 2 : جناح التروية أثناء التروية الماوس الكبد. العلبة مع الماوس يوضع على زاوية حمام الماء. يتم قطع الأوكسجين الحل كولاجيناز كما أن الفعل كان اﻷوكسيجين أثناء الاحماء. موقع عناصر هي A) الأكسجين خطوط، ب) 1 لتر قارورة تحتوي على برنامج تلفزيوني، ج) 125 مل قارورة تحتوي على المخزن المؤقت 2 مع كولاجيناز، د) مضخة، ضوابط ه) مضخة، فخ و) فقاعة، ز) السائل خط يمتد من قارورة، عن طريق المضخة والماوس. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig3.jpg"> الشكل 3 : صورة المفرج البطن الماوس. ينبغي أن يكون الإدراج القسطرة أسفل الوصلات الوريد المعدة والبنكرياس نزوله الوريد البابي (النقطة الخضراء) وينبغي أن توضع نصيحة قرب الأوردة بوابة اليسار واليمين الكبدي (النقطة الصفراء) التي تشكل شوكة في الفصوص الرئيسية في الكبد. حالما يتحقق الموضع الصحيح، ينبغي أن تستقر القسطرة مع مؤشر الترابط باستخدام عقده تراكم بسيطة. K = الكلي، L = الكبد، سي = الأمعاء. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig4.jpg"> الشكل 4 : موضع قسطرة في الوريد البابي- (أ) تستخدم الملقط لضمان تحفل الدم من الوريد البابي وتصويب على المنوال لقسطرة التنسيب. (ب) القسطرة هو اصطف بالتوازي مع الوريد البابي مع المجسم مشطوف الحواف. (ج) الشطب الإبرة داخل القسطرة يتم إدراج على المنوال، ليس عن طريق الوريد. (د) إبرة القسطرة يتم سحبه والدم سوف الدفق من خلال القسطرة كما هو مبين بتلميح الملقط. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig5.jpg"> الشكل 5 : نضح الكبد السليم. (أ) بعد أن يتم الاتصال قسطرة التنسيب، نهاية القسطرة اللوير الإناث إلى نهاية نظام الذكور (قطع من حقنه 1 مل) من أنابيب الضخ. (ب) بعد أن قطع أحد الأوعية الدموية الرئيسية تنازلي، الدم وبرنامج تلفزيوني يتم استنزفت من البطن بتقطيع إلى جانب الماوس مع المقص. (ج) ينبغي أن لانش الكبد بينما يتم مسح الدم وسوف تضخم (د) عندما تكون تحت ضغط بإيقاف الضغط قطع الأوعية الدموية بالملقط. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig6.jpg"> الرقم 6 : ملخص تخطيطي تتمثل تنقية وعزل المجلس الوطني- وتهدف معظم الخطوات الطرد المركزي لإزالة خلايا الكبد الحية والميتة من الخلايا غير متني. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig7.jpg"> الشكل 7 : ملخص تخطيطي ثانية تخصيب وتنقية- يتم فصل الشخصيات بالتدرج حماية الأصناف النباتية يليه فصل ثانية بالتصاق قصيرة إلى لوحة البوليستيرين قياسية. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig8.jpg"> الشكل 8 : تنقية خلايا الكبد. مطلي على لوحات زراعة أنسجة الكولاجين المغلفة مع دميم + 8% FBS + القلم/بكتيريا خلايا الكبد والمحتضنة ح 6 تليها مجموعة الصور مجهر في 400 X. شريط يساوي 20 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig9.jpg"> الرقم 9 : تنقية SEC. ثانية (A) و KCs جمعت من واجهة حماية الأصناف النباتية 25/50% (الأسهم الصفراء) وغسلها مع المتوسط خالية من المصل. ثانية (ب) كانت تفصل في KCs الالتصاق الانتقائي على أطباق بيتري القياسية وغسلها ومطلي على أطباق زراعة الأنسجة المغلفة بالكولاجين في ربمي + 5% FBS. وأخذ الصور مجهر المقلوب أفوس 400 X. شريط يساوي 20 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig10.jpg"> الرقم 10 : فحص المجهر الإلكتروني لتشريح الفأر الكبد. كان perfused كبد ماوس مع برنامج تلفزيوني تليها مثبت (كاكوديلاتي الصوديوم 100 مم، 12 مل 25 ٪ glutaraldehyde، بارافورمالدهيد 16% 15.6 مل، وكلوريد الكالسيوم مم 2.65، السكروز 180.2 مم، مختلطة في الحل 100 مل) بمعدل 1 مل/دقيقة للحد الأدنى 4 كانت شرائح الأنسجة و أعدت للمسح الضوئي المجهر الإلكتروني. جمعت الصور و "وزارة شؤون المرأة" ميدان الانبعاثات في 10، 000 X. تشير الأسهم الصفراء إلى زغيبات بين خلايا الكبد. شريط يساوي 5 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig10large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig11.jpg"> الرقم 11 : التصور للميت مقابل خلايا الكبد الحية- بعد أن يغسل 2 مع المخزن المؤقت 1، يمكن تقييم الأعلاف خلايا الكبد ليعيش الميت نسبة بالعين المجردة. بيليه أخف (يسار) تشير إلى أن على الأقل نصف خلايا الكبد الميت. بيليه قتامة على اليمين هو أكثر شدة القريبون إلى الجزء السفلي من الأنبوب وهو يعيش أكثر من 90 في المائة. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig11large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">الجدول 1: الخلية تنقية</td>
		</tr>
<tr>
<td>نوع الخلية</td>
			<td>الخلايا الهدف %</td>
			<td>% خلايا أخرى</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلايا الكبد</td>
			<td>99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلايا بطانية سينسوسويدال</td>
			<td>89.1</td>
			<td>10.9</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: تقييم نقاء الخلية بالميكروسكوب الخفيفة.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion at JoVE.com

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على صلاحية عالية وعالية الغلة من خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد. يتم ذلك عن طريق بيرفوسينج في الكبد مع حل نوع كولاجيناز الرابع عن طريق الوريد البابي، متبوعاً بالطرد المركزي التفاضلي للحصول على خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية.

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

purification-hepatocytes-sinusoidal-endothelial-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

50.0K Views.  University of Nebraska. والهدف من هذا البروتوكول الحصول على صلاحية عالية وعالية الغلة من خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد. يتم ذلك عن طريق بيرفوسينج في الكبد مع حل نوع كولاجيناز الرابع عن طريق الوريد البابي، متبوعاً بالطرد المركزي التفاضلي للحصول على خلايا الكبد وخلايا بطانية...

Video: Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video