مقدمة.خلايا الكبد الأولية هي أداة مهمة للدراسات المتعلقة بالكبد في المختبر. ومع ذلك ، فإن توسيع هذه الخلايا وصيانتها كان يمثل تحديا تاريخيا لأنها تفقد التشكل والوظائف بعد بضعة أيام في الثقافة. 3D organoids هي أداة متطورة قادرة على تلخيص الأنسجة في طبق لثقافة طويلة الأجل ، والتغلب على مشكلة عدم القدرة على التوسع إلى خلايا الكبد الأولية في المختبر.
الهدف العام من العمل الحالي هو وصف في بروتوكول شامل ومفصل وتبعي ، الخطوات الحاسمة لتروية كبد الفئران ، وعزل خلايا الكبد الأولية ، من أجل السماح للباحثين بتسريع وتحسين ثقافة 3D العضوية ، حمام ماء دافئ عند 42 درجة مئوية ، ثم وضع عازلة التروية و PBS زوج واحد في حمام مائي لمدة 20 دقيقة. ضع خلايا الكبد الأولية المتوسطة الكاملة و PBS ، مضافة مع 3٪ من القلم على الجليد. قم بإعداد المضخة التمعجية وتوصيل الأنبوب بالزجاجة الزجاجية ومصيدة الفقاعات ، وكلاهما مملوء بمخزن التروية.
املأ الأنبوب بمحلول التروية الدافئة لإزالة فقاعات الهواء وغسل الإيثانول المتبقي. تخدير الفئران البالغة عن طريق الحقن داخل الصفاق من مزيج مخدر. حلق البطن ونظفه بنسبة 70٪ إيثانول لتقليل التلوث البكتيري أثناء الجراحة.
ضع الجرذ في منتصف صينية التشريح وقم بتأمين الأطراف باستخدام الإبر. قم بعمل شق على شكل حرف U عبر الجلد والعضلات ، من وسط أسفل البطن ، إلى القفص الصدري. المشبك الجلد ومطوية حتى الرأس ، وفضح الأمعاء.
حرك الأمعاء بعناية إلى الجانب الأيسر من ، من تجويف البطن ، وفضح الوريد البابي الكبدي والوريد الأجوف. باستخدام كماشة ، قم بتشغيل خياطة تحت الوريد البابي وقم بإعداد عقدتين ، سنتيمتر واحد ، واحد من الآخر ، يحيط بالوريد نفسه. حقن 100 إلى 150 وحدة من الهيبارين المذاب في برنامج تلفزيوني في غطاء الوريد لمنع تخثر الدم.
قم بتشغيل المضخة بمعدل سرعة منخفض. أدخل قسطرة وعائية قياس 18 في الوريد البابي ، على مستوى الخيط بزاوية مسطحة بالنسبة للوريد. قم بإزالة الإبرة الداخلية لترك القنية في الوريد.
قم بتوصيله بنهاية المخرج باستخدام موصل قفل luer. أغلق العقدة ، وقم بتثبيت الأنبوب في الموضع الصحيح. ثم قطع الوريد الأجوف للسماح للدم بالخروج.
يجب أن يبدأ الكبد بسرعة في التورم والتبييض في ثانيتين إلى ثلاث ثوان. هذا يؤكد أن المخزن المؤقت للتروية يتدفق عبر الكبد. قم بزيادة سرعة المضخة ببطء عند 10 ملليلتر في الدقيقة ، وحافظ على 10 دقائق على الأقل للسماح بتنظيف الكبد من الدم.
أثناء التروية ، اضغط بالمسحة على الوريد الأجوف لمدة 10 ثوان. يجب أن ينتفخ الكبد أثناء المشبك ، ويسترخي عند إطلاق الوريد ، مما يؤدي إلى تعزيز تفكك الخلايا. كرر الضغط بشكل دوري.
بعد التروية ، قم بتبديل محلول التروية إلى محلول الهضم الذي تم تسخينه مسبقا دون مقاطعة التدفق وتجنب أي فقاعة هواء في الأنبوب. زيادة سرعة المضخة عند 20 ملليلتر في الدقيقة ، والاستمرار في الضغط بشكل دوري مع مسحة لتورم الكبد والاسترخاء. بعد الهضم العازلة ، يجب أن يبدو الكبد طريا.
في هذه المرحلة ، يمكن إزالة الإبرة وإيقاف المضخة. لتشريح الكبد ، أمسك برفق النسيج الضام المركزي ، بين الفصوص بالملقط. قطع كل اتصال بالأعضاء الأخرى ، ورفع الكبد.
اغسل الكبد ، فقط اغمر في برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا ، بالإضافة إلى محلول 3٪ من بكتيريا القلم لبضع ثوان. ثم ضعه في أنبوب ويليام المتوسط المبرد مسبقا. تحت الغطاء البيولوجي ، انقل الكبد إلى طبق بتري مع 15 ملليلتر بارد من وسط ويليام الكامل ، فوق صينية مليئة بالثلج.
قم بإزعاج الأنسجة بقوة باستخدام الكاشطة لتحرير الخلايا في الوسط. إذا تم تنفيذ عملية هضم الكبد بشكل صحيح ، فيجب أن يكون الإطلاق سهلا. اجمع الخلايا التي تحتوي على الوسط وقم بترشيحه بالفلتر أثناء النقل في أنبوب فالكون المعقم.
صب حوالي 15 ملليلتر من وسط ويليام الكامل البارد ، فوق الكبد المهروس في طبق بتري للمساعدة في إطلاق المزيد من الخلايا وتكرار الترشيح. في نهاية مرحلة الإطلاق ، يجب أن يكون وسط المرشح معتما بعد تحرير الخلايا الكبدية. يجب أن يبدو الكبد المتبقي ليفيا وسيتم التخلص منه.
أجهزة الطرد المركزي الوسط المصفى الذي يحتوي على خلايا كبدية ذات سرعة منخفضة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 40 ملليلتر من وسط ويليام المثلج البارد بالكامل ، ثم كرر الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق لوحة الخلايا في 25 ملليلتر من وسط ويليام المثلج البارد الكامل ، أضف 25 ملليلترا ، 90٪ محلول Percoll في الأنبوب واخلطه برفق.
يجب أن تحصل على لوحة مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب المقابلة لخلايا الكبد القابلة للحياة ، والطبقة الموجودة في الجزء العلوي من التدرج المكون من خلايا الكبد الميتة. نضح طبقة الخلايا الميتة من أعلى التدرج واترك واحدا أو ملليلتر من الوسط مع حبيبة. إعادة تعليق بيليه في 30 ، 40 ملليلتر من المتوسط.
أجهزة الطرد المركزي في 200g لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم نضح طاف طاف. أضف كمية مناسبة من الوسيط للعد. عد صلاحية الخلية باستخدام واحد إلى 10 تريبان أزرق.
بالنسبة لثقافة 2D ، تم طلاء خلايا الكبد الأولية بتركيز 500،000 خلية لكل بئر من ستة آبار متعددة على ألواح الخلايا المغلفة بالكولاجين مع وسط ويليام الكامل الذي تم تسخينه مسبقا ، ووضعها في الحاضنة. بعد ثلاث إلى أربع ساعات ، تم تغيير الوسيط إلى وسيط ويليام الكامل الجديد الذي تم تسخينه مسبقا. بالنسبة لثقافة خلايا الكبد 3D ، تم تعليق خلايا الكبد الأولية في مصفوفة Geltrex النقية الباردة بتركيز 1،000 خلية في 20 ميكرولتر من Geltrex.
تم قلب اللوحة رأسا على عقب وتركها في الحاضنة لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح بتصلب المصفوفة. ثم تم تشغيل اللوحة ، وأضيفت وسيلة ثقافة خاصة ب 3D. تم تغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام.
النتائج التمثيلية. في نهاية إجراءات الإعداد ، حصلنا على إنتاج خلية يصل إلى خلية واحدة لكل 10 إلى ثماني خلايا لكل عزل من الكبد يبلغ حوالي 300 جرام من الفئران. تم إثبات صلاحية الخلية بين 78٪ و 97٪ بواسطة تريبان بلو ، بعد تدرج كثافة بيركول.
في أربع ساعات بعد الطلاء ، أظهرت خلايا الكبد مورفولوجيا مكعبة. في اليوم الأول، اكتسبت الخلايا الكبدية الأولية شكلها السداسي النموذجي، وبدأت قطرات الليبيدات في الظهور. في اليوم الثاني إلى الثالث ، تزداد قطرات الدهون ، بينما في اليوم الرابع إلى الخامس ، تتراكم الخلايا ألياف إجهاد الأكتين.
حدث انخفاض كبير في الجدوى بالفعل في الأيام الأولى من الثقافة ليصل إلى 49.5٪ في اليوم الأول. هذا أدنى مستوى عند 33.5٪ في اليوم الثالث ، ويصل إلى 9.1٪ في اليوم الخامس. في اليوم صفر من طلاء العضويات الكبدية ، نقيس 30 ميكرومتر.
في اليوم الثاني من الثقافة ، ضاعفت الكائنات العضوية الكبدية أبعادها تقريبا ، مما يؤكد نمو الحجم الذي تم الحفاظ عليه أيضا في اليوم الخامس. كان الشكل العضوي الكبدي في اليوم الأول دائريا ، بينما أظهروا مجموعة من شكل العنب في اليوم الثاني. في اليوم 15 ، كان النشاط التكاثري لخلايا الكبد ، الخلايا الخضراء ، موجودا حتى لو كان دمج EdU منخفضا ، 9٪استنتاج.
تعتبر المواد العضوية 3D حدودا للطب الشخصي ، وتسمح بثقافة خلايا الكبد على المدى الطويل. بالمقارنة مع خلايا الكبد 2D ، كانت الكائنات العضوية الكبدية لا تزال قابلة للحياة وفي انتشار نشط في اليوم 15 ، مما يدل على إمكانات طويلة الأجل. تتطلب جودة تقنية 3D المتطورة عائدا جيدا من خلايا الكبد القابلة للحياة ونضح الكبد وعزله بشكل جيد.
نوضح الخطوات التي يمكن أن تبدو أكثر أهمية في عزل خلايا الكبد الأولية للفئران ، ونلخص النصائح المتناثرة التي يمكن أن تؤثر بسهولة على نجاح التقنية في نموذج الفئران.
